俞晨秀，孫 莉，孫益民，秦亞東，高 煥

（（1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市食品藥品檢驗中心，安徽 蕪湖 241000；3.安徽師范大學化學與材料科學學院，安徽 蕪湖 241000）

近年來，茶黃素功效的報道日益增多，其研究也備受關注。茶黃素因其在乙酸乙酯中呈現(xiàn)黃色而得名[1]，它是Roberts在1957年從紅茶中分離并鑒定獲得，是茶葉中多酚類物質氧化聚合而成的一類多酚羥基具苯駢卓酚酮結構的物質[2]，是形成紅茶茶湯“黃金圈”的物質，對紅茶茶湯鮮爽度和強度等滋味起著重要作用[3]。茶黃素具有良好的抗氧化性[4]、抗炎癥[5-6]、抗尿酸[7]、抗病毒[8]、抗菌[9]、抗腫瘤等作用[10-12]。到目前為止，各類茶黃素有28種之多[13]，其中最主要的單體有4種化合物，即茶黃素（Theaflavins，TF）、茶黃素-3-單沒食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3'-單沒食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）、茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（Theaflavin-3,3-digallate，TFDG）。

茶黃素結構式見圖1。

圖1 茶黃素結構式

在這4種單體中及總的28種中，茶黃素是具有最基礎結構的單體，其穩(wěn)定性與其他單體的穩(wěn)定性密切相關。因此，研究茶黃素的穩(wěn)定性能較好反映其他單體的穩(wěn)定性。在茶黃素中有多個酚羥基、多個環(huán)和大共軛體系，這種結構有著怎樣的穩(wěn)定性無疑是茶黃素提取、分離和應用中需要考慮的，而這方面系統(tǒng)的專題研究卻未見報道。研究了TF在多種環(huán)境下的穩(wěn)定性，以期為茶黃素的開發(fā)應用和深入研究中提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶黃素（TF），純度99.636%，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；乙酸、EDTA-2Na、抗壞血酸、三氯化鐵、硝酸銀、鹽酸均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供；甲醇、乙腈均為色譜純，德國默克公司提供；水（娃哈哈純凈水）。

1.2 儀器與設備

Agilent HPLC-1260型高效液相色譜儀、DAD檢測器，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；DV215CD型精密電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；RA24型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；FYL-YS-310L型冰箱，北京福意電器有限公司產(chǎn)品；PHS-25型pH計，上海今邁儀器儀表有限公司產(chǎn)品；JK-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，合肥金尼克機械制造有限公司產(chǎn)品；20 W家用日光燈，PAK/三雄極光產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶黃素水溶液的配制

精密稱取一定量的茶黃素（TF）（萬分之一天平稱?。?0℃水溶解，配成約40μg/mL的溶液。

1.3.2 茶黃素不同pH值溶液的配制

pH值約為4的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為3的鹽酸=9∶1），pH值約為5的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為4的鹽酸=9∶1），pH值約為7的茶黃素溶液（1.3.1中所配茶黃素水溶液），pH值約為8的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為9的氫氧化鈉=9∶1），pH值約為9的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為10的氫氧化鈉=9∶1），溶液均過0.45μm膜。

1.3.3 不同濃度Fe3+的茶黃素溶液的配制

分別取1 mmol/L的三氯化鐵溶液0.1，0.2，0.3，0.4 mL于4支5 mL容量瓶中，用茶黃素水溶液（見1.3.1）稀釋至刻度，配成含不同濃度Fe3+的茶黃素溶液，搖勻后過0.45μm膜。

1.3.4 穩(wěn)定溶液的配制

依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]配制穩(wěn)定溶液，分別將EDTA-2Na溶液25 mL，抗壞血酸溶液25 mL，乙腈50 mL加入500 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。

（1）EDTA-2Na溶液。10 mg/mL（現(xiàn)配）。精密稱取EDTA-2Na 1.0 g，用水稀釋至100 mL。

（2）抗壞血酸溶液。10 mg/mL（現(xiàn)配）。精密稱取抗壞血酸1.0 g，用水稀釋至100 mL。

1.3.5 茶黃素的穩(wěn)定液溶液

稱取一定量的茶黃素（TF），用穩(wěn)定溶液稀釋至刻度，搖勻后過0.45μm膜。

1.3.6 茶黃素溶液的含量變化測試

茶黃素含量測定采用高效液相色譜法，依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]測定中的色譜條件和梯度條件，以常溫下同批次標準品水溶液的吸收峰面積為100%含量，比較不同環(huán)境下樣品的峰面積變化值，來確定含量的變化。

2 結果與分析

2.1 茶黃素（TF）標準物的測試

茶黃素（TF）標準品純度高，測試其HPLC色譜圖中峰數(shù)單一，峰形尖銳；基線平直，零點吻合，因此可以作為試驗中參比的標準。

HPLC色譜圖見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.2 加熱溫度的影響

試驗結果顯示，茶黃素水溶液在40℃以下較穩(wěn)定，50℃以上加熱30 min分解明顯，吸收峰面積（響應值）只有空白樣的49.76%，80℃以上加熱30 min吸收峰面積為0，表明此時已經(jīng)全部分解完全，可見溫度對茶黃素水溶液的穩(wěn)定性影響非常大，溫度越高影響越大。

溫度對茶黃素水溶液穩(wěn)定性的影響曲線見圖3。

圖3 溫度對茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線

2.3 酸堿度的影響

試驗結果顯示，茶黃素水溶液在pH值為4～7，酸性和中性條件下比較穩(wěn)定，在pH值〉8的堿性條件下不穩(wěn)定，pH值=8時吸收峰面積（響應值）只有空白樣的26.74%，這與酚類化合物自身是弱酸性物質，在酸性和中性條件下較穩(wěn)定的推測一致。

pH值對茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線見圖4。

圖4 p H值對茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線

2.4 Fe3+的影響

試驗結果顯示，F(xiàn)e3+極易與茶黃素反應，當Fe3+的濃度為0.02 mmol/L的極低濃度時，茶黃素仍然與Fe3+有明顯的反應。

不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積見圖5。

圖5 不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積

2.5 室溫、低功率照射、穩(wěn)定液中放置時間的影響

試驗結果顯示，茶黃素水溶液在冬天10～20℃下放置有緩慢的分解，8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的87.55%；在低功率照射下（20 W日光燈），茶黃素的吸收峰面積變化曲線與室溫下面積變化曲線基本一致，照射8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的89.91%，與87.55%接近，說明低功率照射對茶黃素水溶液的穩(wěn)定性基本無影響；穩(wěn)定液中的茶黃素在10～20℃下放置8 d幾乎不分解，8 d后吸收峰面積是空白樣的101.58%，沒有降低，說明有穩(wěn)定液存在對茶黃素的穩(wěn)定性起到了一定的保護作用。

3種條件下的吸收峰面積變化曲線見圖6。

圖6 3種條件下的吸收峰面積變化曲線

3 討論

茶黃素（TF）由中間的苯與七員雙烯環(huán)酮并合結構，另2個苯與四氫吡喃并合結構共3個部分構成。中間的并合結構是大共軛體系，七員雙烯環(huán)酮上有一個烯醇式結構；另2個并合結構通過單鍵與中間并合結構相連，在2個并合結構與單鍵連接的兩旁都有氧吸電子基，這些因素使得單鍵上電子云向兩端轉移而容易斷裂，當溫度升高有可能發(fā)生斷鍵的分解作用。從溫度增加吸收峰面積降低，HPLC法測定中的吸收峰數(shù)目增多，說明了分解反應的發(fā)生。

在茶黃素中有多個酚羥基而顯示弱酸性[14]，因此茶黃素在酸性和中性中穩(wěn)定，而在堿性中試驗結果是吸收峰面積下降明顯，吸收峰數(shù)目明顯增多，可能是茶黃素發(fā)生了開環(huán)和斷鍵反應，具體原因還不清楚。

酚能與三氯化鐵發(fā)生顯色反應[15]，茶黃素中有多個酚羥基，所以茶黃素極易與Fe3+發(fā)生反應，反應屬于配位反應[16]，從反應的現(xiàn)象由淡黃色變?yōu)榈仙颊f明了該反應的特點。

酚具有易氧化的性質[15]，烯醇式結構不穩(wěn)定，茶黃素的多酚結構和烯醇式結構使得茶黃素的水溶液容易被氧化，在實驗室常溫密閉放置下也會緩慢被氧化；加入了由抗氧化劑（VC）和金屬離子配合物（EDTA）組成的穩(wěn)定液，因穩(wěn)定液能參與氧化，結合大部分金屬離子，因此它們能提高茶黃素的穩(wěn)定性；低功率照射則因照射能力低而幾乎沒有影響。

4 結論

茶黃素（TF）是由3個并合結構通過單鍵連接的多酚物質，易發(fā)生分解和氧化及與Fe3+的配位反應，在加熱、堿性和Fe3+存在下不穩(wěn)定，因此，茶黃素在使用時要盡量選擇低溫、酸性和無Fe3+影響的條件下，避免加熱、堿性和Fe3+的影響，普通日光燈照射基本不影響，穩(wěn)定液對茶黃素水溶液的穩(wěn)定性有一定的保護作用。