趙桐，田訓(xùn)，曹晨

0 引言

卵巢癌是最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年中國(guó)有約55 300例卵巢癌新發(fā)病例和37 500例死亡病例[1]。卵巢癌轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，多數(shù)于診斷時(shí)已出現(xiàn)疾病進(jìn)展或廣泛轉(zhuǎn)移，患者5年生存率不足30%[2]，因此，研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于該疾病的治療具有重要意義。

近年來(lái)大量研究揭示了線粒體代謝相關(guān)基因與腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。醛脫氫酶5家族A1（ALDH5A1）編碼產(chǎn)物為琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH），在線粒體代謝中通過(guò)催化琥珀酸半醛的氧化反應(yīng)來(lái)降解γ-氨基丁酸（GABA）。ALDH5A1表達(dá)下調(diào)，SSADH功能缺陷會(huì)導(dǎo)致GABA正常降解途徑受阻，轉(zhuǎn)而生成γ-羥基丁酸（GHB），Hilvo等[6]報(bào)道了GHB可作為高級(jí)別卵巢漿液性癌生物標(biāo)志，其蓄積提示卵巢癌的進(jìn)展以及預(yù)后不良。

Deng等[7]發(fā)現(xiàn)ALDH5A1表達(dá)下調(diào)可通過(guò)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展；Kaur等[8]采用Gene Sapiens微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，在特定類型腫瘤如膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)ALDH5A1表達(dá)上調(diào)，而在乳腺癌中ALDH5A1則較正常組織表達(dá)下調(diào)。

本課題組前期研究也表明，卵巢癌患者腫瘤組織ALDH5A1較正常卵巢組織表達(dá)下調(diào)，且ALDH5A1低表達(dá)與卵巢癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)[9]，然而具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究將進(jìn)一步探討ALDH5A1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞

人卵巢癌上皮SKOV3細(xì)胞系來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞系在添加10%胎牛血清（FBS，購(gòu)于美國(guó)Gibco公司）和1%青霉素/鏈霉素（購(gòu)于美國(guó)Gibco公司）的McCoy’s 5A培養(yǎng)基（購(gòu)于瑞士Lonza公司）中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。

1.2 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[9]下載GSE20565卵巢癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析ALDH5A1 mRNA表達(dá)水平。為進(jìn)一步證實(shí)ALDH5A1和共表達(dá)基因的蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)，分析從人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/）中獲得的卵巢癌組織芯片（TMA）隊(duì)列。

基于網(wǎng)絡(luò)工具PROGgeneV2[10]評(píng)估卵巢癌中ALDH5A1表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH5A1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和578例卵巢癌患者的總生存率信息建立Kaplan-Meier生存曲線圖。Kaplan-Meier plotter在線平臺(tái)芯片數(shù)據(jù)分析不同TP53突變型別與卵巢癌患者總生存率的關(guān)系。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小干擾RNA 下調(diào)目的基因ALDH5A1 ALDH5A1 siRNA購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。靶標(biāo)序列如下：siRNA1: 5’-CGGAAGTGGTACAATTTAATG-3’；siRNA2: 5’-GGTTCAACAACTACAGGAAAG-3’。LipofectamineTM3000（Thermo Fisher）將siRNA和陰性對(duì)照按說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定敲減效率。

1.3.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) SKOV3野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板中，在5%CO2、37℃下孵育。過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)到100%密度。用移液器無(wú)菌100 μl槍頭尖端在單層細(xì)胞上劃出劃痕。PBS沖洗細(xì)胞1次，去除細(xì)胞碎片，撫平劃痕邊緣，再用2.5 ml McCoy's 5A培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。倒置顯微鏡攝取劃痕邊緣的圖像。

1.3.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用包被人工基質(zhì)層（Matrigel）的Transwell小室評(píng)估SKOV3細(xì)胞侵襲能力。將基質(zhì)在冰上融化，然后將30 μl的基質(zhì)添加到24孔的Transwell小室中并凝固，野生或轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞按1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度置于基質(zhì)凝膠涂層頂部，在37℃、5%CO2下孵育10 min，使細(xì)胞下沉。下室為含有McCoy's 5A培養(yǎng)基，10%胎牛血清作為化學(xué)引誘劑。在5%CO2、37℃下孵育24 h后，用棉簽去除未穿透膜的細(xì)胞。成功遷移至膜底面的細(xì)胞，4%聚甲醛固定，0.2%結(jié)晶紫染色10 min。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4 ALDH5A1共表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與分析 來(lái)自Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）中的卵巢癌細(xì)胞系（n=47）和TCGA中的卵巢漿液性囊腺癌（n=489）患者數(shù)據(jù)用cBioPortal[11]在線平臺(tái)進(jìn)行分析。當(dāng)Spearman相關(guān)性>0.2和P<0.05時(shí)，認(rèn)為該基因?yàn)锳LDH5A1共表達(dá)基因。采用g:Profiler[12]和Metascape[13]兩個(gè)在線平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH5A1的共同共表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析。Metascape在線平臺(tái)將具有相似功能的重要GO關(guān)鍵詞可視化為交互網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步確定關(guān)鍵詞之間的關(guān)系，其中P<0.01、相關(guān)度評(píng)分>0.3的項(xiàng)位于網(wǎng)狀圖邊緣。此外，運(yùn)用cBioPortal對(duì)ALDH5A1與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組織通路關(guān)鍵基因進(jìn)行共表達(dá)分析。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）試劑盒（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶（TransGenBiotech）以1 μg總RNA合成cDNA。SYBR Green PCR Master Mix（Takara Bio）和Light Cycler（Roche）行qRT-PCR分析。結(jié)果用2-??ct計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行分析，以三次重復(fù)的（）表示。兩組間定量資料用Student'st檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH5A1下調(diào)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移灶組織（n=35）與原發(fā)灶（n=90）相比，轉(zhuǎn)移灶的ALDH5A1表達(dá)水平顯著下調(diào)（P=1.6×10-5），見(jiàn)圖1A。

siRNA技術(shù)建立ALDH5A1表達(dá)下調(diào)的SKOV3卵巢癌細(xì)胞系，并用qRT-PCR驗(yàn)證：相比于SKOV3-NC組，SKOV3-siRNA1及SKOV3-siRNA2組中ALDH5A1mRNA表達(dá)水平下調(diào)，見(jiàn)圖1B。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，隨著ALDH5A1表達(dá)水平下調(diào)，卵巢癌細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)（P<0.0001），見(jiàn)圖1C。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，卵巢癌細(xì)胞的遷移能力與ALDH5A1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），見(jiàn)圖1D。

圖1 ALDH5A1下調(diào)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移Figure 1 ALDH5A1 downregulation promoted metastasis and invasion of ovarian cancer

2.2 ALDH5A1與卵巢癌中ECM信號(hào)通路的關(guān)系

運(yùn)用cBioPortal在線平臺(tái)從CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了47個(gè)卵巢癌細(xì)胞株中1 575個(gè)ALDH5A1共表達(dá)基因，見(jiàn)附表1，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的489個(gè)卵巢癌患者中提取了1 220個(gè)ALDH5A1共表達(dá)基因，見(jiàn)附表2。通過(guò)取這兩個(gè)共表達(dá)基因集的交集，發(fā)現(xiàn)有128個(gè)共同的共表達(dá)基因重疊，見(jiàn)圖2A、附表3（附表1～3請(qǐng)掃描本文OSID碼）。對(duì)上述128個(gè)ALDH5A1的共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，以識(shí)別共表達(dá)基因列表中可能存在的信號(hào)通路。首先，運(yùn)用g:Profiler鑒定ALDH5A1與128個(gè)共表達(dá)基因的功能信息和富集途徑及過(guò)程。如圖2B所示，生物進(jìn)程（biological processes: BPs）方面，這些基因主要富集在ECM組織（GO: 0030198）和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（GO: 0043062）；細(xì)胞組成（cellular components:CCs）方面，這些基因主要富集在ECM通路中（GO: 0031012）；分子功能（molecular functions:MFs）分析和Reactome（REAC）分析也顯示這些基因在ECM結(jié)構(gòu)成分（GO: 0005201）和ECM組織（REAC: R-HSA-1474244）中顯著富集。同時(shí)用Metascape平臺(tái)再次進(jìn)行了GO分析。推測(cè)結(jié)果中與ALDH5A1關(guān)聯(lián)密切的20種生命活動(dòng)，其中富集最顯著的基因集是ECM組織通路（GO: 0030198），見(jiàn)圖2C。Metascape繪制的共表達(dá)通路富集網(wǎng)路顯示此20種生命活動(dòng)彼此密切相關(guān)，見(jiàn)圖2D。

圖2 ALDH5A1基因功能富集分析以及其與卵巢癌中的共表達(dá)基因Figure 2 Gene-Ontology analysis of ALDH5A1 and coexpressed genes revealing the relationship between ALDH5A1 and ECM signaling pathways in OC

2.3 卵巢癌患者TP53突變型別影響ALDH5A1與ECM途徑中分子的相關(guān)性

運(yùn)用g:Profiler平臺(tái)找到ECM通路中與ALDH5A1密切相關(guān)的基因MMP2、MMP3和MMP14。借助cBioportal平臺(tái)中的卵巢癌數(shù)據(jù)庫(kù)（TCGA,Firehouse Legacy數(shù)據(jù)集中卵巢漿液性囊腺癌臨床資料）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)“RNA Seq V2 RSEM” mRNA表達(dá)譜，對(duì)ALDH5A1與MMP2、MMP3、MMP14等基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行Sperman相關(guān)性分析。結(jié)果提示ALDH5A1與MMP2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R=-0.34），ALDH5A1與MMP3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R=-0.27），ALDH5A1與MMP14表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R=-0.30），見(jiàn)圖3A。通過(guò)分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)GSE63885，驗(yàn)證ALDH5A1與MMP2、MMP3、MMP14表達(dá)水平的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)ALDH5A1與MMPs表達(dá)水平的相關(guān)性與卵巢癌患者是否存在TP53突變有關(guān)：在所有卵巢癌患者（n=101）中，ALDH5A1僅與MMP14表達(dá)水平顯著性負(fù)相關(guān)（R=-0.26,P=0.009）；而存在TP53突變（n=75）的卵巢癌患者中，ALDH5A1與MMP14表達(dá)水平負(fù)相關(guān)更加顯著（R=-0.36,P=0.0014）；在TP53野生型（n=15）卵巢癌患者中，ALDH5A1與MMP2、MMP3、MMP14表達(dá)均無(wú)顯著相關(guān)性，見(jiàn)圖 3B。

圖3 ALDH5A1與ECM組織通路的共表達(dá)分析Figure 3 Coexpression analysis of ALDH5A1 and correlated genes among ECM pathways

一方面，我們從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取卵巢癌TMA隊(duì)列，臨床樣本免疫組織化學(xué)染色結(jié)果從蛋白水平驗(yàn)證卵巢癌患者ALDH5A1和MMPs表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)：ALDH5A1低表達(dá)組（Stain:Not detected/Intensity: Negative）中MMP14表達(dá)水平（Stain: low/Intensity: Weak）相較于高表達(dá)組（Stain: Medium/Intensity: Moderate）MMP14表達(dá)水平（Stain:Not detected/Intensity:Negative）有所提升，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，見(jiàn)圖4。

圖4 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中兩例代表性卵巢癌患者免疫組織化學(xué)提示ALDH5A1和MMP14表達(dá)負(fù)相關(guān)Figure 4 Immunohistochemical staining results from HPA database demonstrating the negative correlation between ALDH5A1 and MMP14

2.4 ALDH5A1低表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后

在卵巢癌患者中ALDH5A1表達(dá)較低者預(yù)后較差。ALDH5A1高水平卵巢癌患者的總生存率明顯高于ALDH5A1低水平卵巢癌患者（HR=0.75（0.64～0.88）,P=0.0005），見(jiàn)圖5A。病理Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)患者ALDH5A1高表達(dá)與OS改善相關(guān)（HR=0.54（0.34～0.88）,P=0.0127;HR=0.79（0.66～0.94）,P=0.0077），見(jiàn)圖5B～C。

TP53突變型患者的ALDH5A1表達(dá)與總生存時(shí)間相關(guān)性更為顯著（HR=0.71（0.56～0.89）,P=0.0026），見(jiàn)圖5E，而TP53野生型卵巢癌患者的ALDH5A1表達(dá)則與總生存時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)（HR=1.07（0.62～1.85）,P=0.82），見(jiàn)圖5F。

圖5 ALDH5A1 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后相關(guān)分析Figure 5 Relative analysis between ALDH5A1 mRNA expression and the prognosis of OC patients

3 討論

真核細(xì)胞的線粒體是一種重要的細(xì)胞器，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。ALDH5A1屬于ALDHs家族，編碼產(chǎn)物為SSADH，后者對(duì)于線粒體代謝中GABA的降解起著非常重要的作用，功能缺陷或降低可導(dǎo)致GABA和GHB在體內(nèi)蓄積。早在2001年即有研究報(bào)道，卵巢癌患者尿液中可觀察到GABA濃度升高[14]。Hilvo等[6]發(fā)現(xiàn)高級(jí)別漿液性卵巢癌患者中GHB有異常蓄積現(xiàn)象，并證明這種蓄積現(xiàn)象是由ALDH5A1基因突變和活性降低引起的。盡管多項(xiàng)研究一致認(rèn)為ALDH5A1與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但卵巢癌中ALDH5A1作用的具體分子機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)與原發(fā)灶相比，卵巢癌患者轉(zhuǎn)移組織中ALDH5A1的表達(dá)水平降低，提示細(xì)胞中ALDH5A1表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)卵巢癌的侵襲和遷移。為深入了解ALDH5A1的功能，我們進(jìn)行了功能富集分析，結(jié)果顯示ALDH5A1共表達(dá)基因主要與ECM通路相關(guān)。ECM是由細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子物質(zhì)，由基底膜（basement membrane,BM）和細(xì)胞間基質(zhì)組成，是阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要組織屏障。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的首要條件是降解ECM和破壞BM，而MMPs是降解ECM最重要的蛋白酶類[15]。

近年來(lái)許多研究表明MMPs和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，MMP2蛋白在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起早期應(yīng)答蛋白的作用[16-18]。MMP14在基底膜和間質(zhì)組織遷移過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)降解中發(fā)揮著核心作用[19]，它刺激腫瘤-間質(zhì)信號(hào)通路并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞上的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[20]。本研究從轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)、HPA免疫組織化學(xué)樣本、生存分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ALDH5A1下調(diào)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移與ECM通路中的關(guān)鍵基因MMP14相關(guān)，且這種影響可能與卵巢癌患者TP53突變有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ALDH5A1表達(dá)下調(diào)與卵巢癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并初步探討了ALDH5A1下調(diào)可能通過(guò)ECM通路影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示卵巢癌患者預(yù)后不良，具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究提示ALDH5A1可能作為卵巢癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。