王成麗，劉 翥，田其真，徐亞亞，徐 禾，張馨月，邱新雯，溫馨茹，朱毅佳，丁志麗

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000）

從營養(yǎng)學(xué)角度看，植物蛋白又可分為兩類，一種是完全蛋白質(zhì)，另一種是不完全蛋白質(zhì)（楊國梁等，2011）。絕大多數(shù)的植物蛋白屬于此類，其來源范圍較動物蛋白而言廣泛許多，但日常生活中植物蛋白主要還是來源于米面和豆類（劉爽等，2014），但二者的營養(yǎng)價值卻不盡相同，從米面中來的蛋白質(zhì)缺少人體所需的必需氨基酸——賴氨酸，所以其氨基酸評分較低，僅為0.3～0.5，人體對其吸收利用度較低，但經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，一種菜用枸杞品種含有較為豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、維生素C和礦物質(zhì)，比蔬菜具有更高的營養(yǎng)價值，因此，在平常生活中要注意來源的多樣性，以確保獲取所需氨基酸（李躍森等，2014）。本試驗采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對羅氏沼蝦的肝胰腺組織樣本進(jìn)行測序，闡述羅氏沼蝦對動植物蛋白利用的差異，目前傳統(tǒng)的芯片技術(shù)具有信噪比較低，不夠靈敏，分析范圍有限，成本較高等局限性，而目前所使用的這種轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以很好地克服這些缺陷，在多種經(jīng)濟(jì)水生生物和蝦蟹的生長生殖發(fā)育研究上進(jìn)行廣泛的應(yīng)用（唐凱等，2019）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用蝦 該試驗用蝦所購于浙江淡水研究所，暫且養(yǎng)殖一周后，選擇健康且體態(tài)均勻體色好，均重（0.448±0.05）g的羅氏沼蝦用于試驗。

1.1.2 試驗飼料 試驗中應(yīng)用不同魚粉或混合植物蛋白粉主要成分為玉米蛋白粉、谷朊粉（小麥蛋白粉）、大豆蛋白粉、玉米淀粉）作為飼料的主要蛋白源，設(shè)計2種蛋白質(zhì)水平為58%的等氮等能飼料（記為FP、PP）。飼料主要原料為魚粉、玉米蛋白粉、谷朊粉、大豆蛋白粉、玉米淀粉、豆油、魚油等（鄭述等，1994）。

飼料的制作步驟簡述如下：首先，用粉碎機(jī)粉碎各種原料，然后用60目篩，在加入魚油和豆油重新混勻，添加少量水再次充分混合均勻。最后用雙螺桿擠條機(jī)壓成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，40℃烘干使飼料中水分含量約10%，置于-20℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料在用酸水解后再采用全自動氨基酸分析儀測定（L-8900，Hitachi）其氨基酸組成[9]，其余相關(guān)營養(yǎng)成分及測定方法為國際通用數(shù)據(jù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集 為期8周的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，對羅氏沼蝦進(jìn)行24 h饑餓禁食。次日在精確度為0.01 g的電子天平上對試驗蝦進(jìn)行稱重，并準(zhǔn)確統(tǒng)計蝦的存活數(shù)量。

（1）計數(shù)。

（2）稱重。

（3）解剖。

（4）淡水青蝦的組織解剖：解剖工具包括解剖盤、鑷子、解剖剪、解剖針培養(yǎng)皿等。具體操作方法如下：

在摘取附肢時先用鉗子鉗住其基部，將其豎直拔下。接下來剪開甲殼，在剪開甲殼時，使用解剖剪從頭胸甲背面中央插入和沿腹甲背中線剪。最后在去掉甲殼的階段應(yīng)認(rèn)真地將甲殼和附著在其內(nèi)緣的肌肉與其他內(nèi)臟器官相互剝離開，以免對其內(nèi)臟器官造成損傷。

1.2.2 測序試驗流程 真核mRNA測序是基于HiSeq平臺，測序試驗采用Illumina TruseqM RNA Tsample prep Kit方法進(jìn)行文庫構(gòu)建，其操作流程具體有以下幾步，操作流程及儀器試劑如表1所示。

表1 操作流程及儀器試劑

再 提 取total RNA、Oligo dT富 集mRNA、片段化mRNA、反轉(zhuǎn)合成cDNA、連接adaptor、Illumina Hiseq上機(jī)測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.1.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與組裝 在飼養(yǎng)羅氏沼蝦時，根據(jù)飼料成分來源不同，將其分為FP和PP兩組，每個組又分為3個重復(fù)，這樣共計有6個樣本。然后根據(jù)6個樣本建立6個單獨的測序文庫，經(jīng)過Illumina HiSeqTM 4000高通量測序，得到6個樣本的Raw reads序列條數(shù)。所得到的數(shù)據(jù)分別 為54040250、49628442、52763314、59243310、52758778、53923016。在通過原始數(shù)據(jù)的過濾后得到Clean reads共計321566700條6個樣本分別 為53493494、49199552、52363748、58760046、54333424、53416436條。

使用Trinity軟件對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行de novo組裝，結(jié)果表明，經(jīng)過組裝后所得到的Unigene長度的范圍為201～19229 bp，PP組和FP組每組3個重復(fù)共6個樣本總計組裝得到平均長度為712.22 bp Unigene的序列121988條，平均GC含量為40.43%（表2）。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾后Q20%，Q30%所占的比例較高，Q20%平均在98%左右，Q30%平均在96%左右（Phred數(shù)值大于20，30的堿基占總體堿基的百分比）。

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計

由圖1可知，將全部Unigenes的長度分布進(jìn)行統(tǒng)計，其結(jié)果顯示1～4500 bp是Unigenes序列長度的主要分布范圍，以500個bp為一次劃分統(tǒng)計該長度范圍內(nèi)的數(shù)量具體為多少。其中長度范圍在1～500 bp的有84702個，占69%，長度范圍在501～1000 bp的有18716個，占15%，以及長度范圍在1001～1500 bp的有6327個，占5%，長度范圍在1501～2000 bp的有3685個占3%，長度范圍在2001～2500 bp的有2496個占2%，長度范圍在2501～3000 bp的有1689個，占1%，長度范圍在3001～3500 bp的有1204個占1%，長度范圍在3501～4000 bp的有841個占1%，長度范圍在4000～4500 bp的有608個占0%，大于4500 bp的有1720個占1%。

圖1 Unigenes序列長度分布

2.1.2 轉(zhuǎn) 錄 組 注 釋 （1）經(jīng) 過 與Pfam、NR、COG、Swissprot、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析比對，然后發(fā)現(xiàn)與已知基因基因同源的Unigenes有111270個，占據(jù)了整個組裝轉(zhuǎn)錄本的91%，在數(shù)據(jù)庫中的同源序列條數(shù)分別為Pfam26162（21.4%）、NR30467（24.9%）、COG5336（4.3%）、Swissprot27589（22.6%）、KEGG21716（17.8）（表3）。并且在通過物種的同源分析性顯示，在本次試驗研究中羅氏沼蝦的unigenes和NR庫中的無脊椎動物具有一定的同源相似性。

表3 基因注釋量統(tǒng)計

（2）將測序所得到的數(shù)據(jù)與組裝的結(jié)果進(jìn)行比較得到如表4所示的數(shù)據(jù)。

表4 測序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果統(tǒng)計表

2.2 基因水平差異表達(dá)研究 轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）值表示，兩種樣本（FP、PP）每個reads都進(jìn)行表達(dá)量的計算。其中使用R語言的DESeq包進(jìn)行差異計算。根據(jù)表達(dá)量差異統(tǒng)計我們可以了解到在所有參加測序的基因里有518個基因在兩樣本間的差異中為顯著表達(dá)，目前尚未發(fā)現(xiàn)兩樣本之間存在沒有任何差異的基因。在這些具有顯著差異的基因中其中S1相對S2上調(diào)的基因有460個，相對下調(diào)的基因有58個（圖2）。

圖2 表達(dá)量差異統(tǒng)計柱狀圖

2.3 差異基因功能分析 差異基因功能分析包括GO（Gene Ontology）富集性分析、聚類分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集性分析。并對富集性結(jié)果進(jìn)行圖形化展示。聚類分析可以直觀描述差異基因的表達(dá)情況，篩選出羅氏沼蝦在基因表達(dá)中以植物蛋白為主的飼料（PP）、以動物蛋白為主的飼料（FP）和脂質(zhì)代謝有關(guān)的差異表達(dá)基因，然后進(jìn)一步進(jìn)行聚類分析。

2.3.1 gO富集分析 gO（Gene Ontology）可分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過程等3個部分，對比GO數(shù)據(jù)庫共獲得37098個GO term，這些term分別對應(yīng)在細(xì)胞組分、分子功能和生物過程。其中顯著富集在細(xì)胞組分、生物過程以及分子功能上的GO term分別為9039、2441和0個。由此可以看出，在細(xì)胞組分上所對應(yīng)的富集程度較高，而在細(xì)胞組分功能類型中，細(xì)胞和細(xì)胞部分所含比例又是該部分中最高的。圖3將展示差異基因在細(xì)胞組分、分子功能和生物過程類別下顯著富集的term名稱以及對應(yīng)差異基因表達(dá)的富集程度（劉秀敏等，2019）。

圖3 gO富集分析圖

2.3.2 差異基因KEGG通路分析 KEGG富集分析結(jié)果表明，以魚粉為動物蛋白源（FP組）和豆粕，玉米蛋白粉和谷朊粉為植物蛋白源（PP組）之間差異表達(dá)的基因主要富集在139條通路上，其中在碳水化合物代謝通路、運輸和分解代謝通路，神經(jīng)退行性疾病代謝通路和遺傳信息處理大類中折疊分類堆積代謝通路差異較為顯著，注釋到以上通路的的基因數(shù)量也較多，碳水化合物是一類重要的有機(jī)物，廣泛存在于植物體內(nèi)，是由植物進(jìn)行光合作用所產(chǎn)生的，存在于植物蛋白源為主的飼料里。差異基因注釋在KEGG各通路中數(shù)量較多，通路具體情況和對應(yīng)差異基因的數(shù)目如圖4所示。

圖4 差異基因KEGG通路分析圖

2.3.3 差異的關(guān)鍵基因表達(dá)情況

（1）Dmc1基因的表達(dá)情況 Dmc1基因在進(jìn)行表達(dá)時根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示PP組3組樣本（PP1、PP2、PP3）的表達(dá)程度均高于FP組3組樣本（FP1、FP2、FP3），說明在此次轉(zhuǎn)錄組測序過程中Dmc1基因在植物蛋白源為主的飼料喂養(yǎng)的羅氏沼蝦肝胰腺中具有更高的表達(dá)，表達(dá)結(jié)果見統(tǒng)計表5。

表5 基因表達(dá)量統(tǒng)計表

（2）SET和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白4基因（SET and MYND domain-containing protein 4）的表達(dá)情況 SET和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白4基因（SET and MYND domain-containing protein 4）在羅氏沼蝦肝胰腺經(jīng)轉(zhuǎn)錄測序所得到差異基因表達(dá)統(tǒng)計中以動物為源蛋白的FP組（FP1，F(xiàn)P2，F(xiàn)P3）的表達(dá)量均較低，在0.09～0.2之間，但以植物源蛋白為主要飼料的PP組（PP1，PP2，PP3）中PP1和PP3兩組具有相對較高的表達(dá)量，兩樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到26.003倍，但同平行組PP2表達(dá)量很低與FP組近乎一致，具體結(jié)果見表6，圖5。

圖5 表達(dá)量分布圖

表6 表達(dá)量差異結(jié)果統(tǒng)計表

（3）組織蛋白酶L基因（cathepsin L）的表達(dá)情況 通過高通量測序技術(shù)對羅氏沼蝦肝胰腺樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的基因占絕大部分，而組織蛋白酶L基因（cathepsin L）屬于為數(shù)不多的下調(diào)基因中的一個。該種基因在以動物蛋白源為主的飼料FP1、FP2、FP3中呈現(xiàn)表達(dá)量逐漸升高的趨勢，結(jié)果見表7，圖6。

表7 表達(dá)量差異結(jié)果統(tǒng)計表

圖6 表達(dá)量分布圖

3 總結(jié)

本次研究采用了多種技術(shù)，包括動物組織切片技術(shù)、分子生物學(xué)理論、動物養(yǎng)殖技術(shù)以及包括轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等。但這其中最為主要的是通過轉(zhuǎn)錄組測序這一經(jīng)濟(jì)高效快速的技術(shù)，通過采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對羅氏沼蝦的肝胰腺組織樣本進(jìn)行測序，從而闡述羅氏沼蝦對動植物蛋白利用的差異，并通過豆粕、玉米蛋白粉和谷朊粉的植物蛋白源（PP組）與以魚粉為動物蛋白源（FP組）的差異表達(dá)基因的數(shù)目、上下調(diào)情況和差異功能的注釋及參與代謝途徑和信號通路，初步揭示了二者在表達(dá)差異上的一些規(guī)律（丁志麗等，2015.）。最終通過分析對比得出，以植物蛋白為主要的飼料對羅氏沼蝦的肝胰腺中部分差異基因和動植物蛋白營養(yǎng)確實影響了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，其中不僅是蛋白質(zhì)代謝，還包括脂質(zhì)代謝等。

首先通過對羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組測序，對羅氏沼蝦肝胰腺組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，共獲得了Clean reads321566700條，經(jīng)過拼接組裝得到111270個Unigenes，由基因表達(dá)對比結(jié)果可知，F(xiàn)P和PP組織樣品間共有518個基因表達(dá)量存在顯著差異，由統(tǒng)計得到的數(shù)據(jù)可知上調(diào)基因有460個，下調(diào)基因58個。且根據(jù)聚類分析FP、PP基因差異基因表達(dá)熱圖即FP的3個平行組F1、F2、F3和PP的3個平行組PP1、PP2、PP3共6個樣本組中PP1和PP3組總體來說在樣本中表達(dá)量較高，且PP組在部分差異基因中顯著表達(dá)，并且根據(jù)KEGG富集分析與GO富集分析中可知，主要在環(huán)境信息處理代謝通路、運輸和分解代謝通路以及人類疾病代謝通路中的細(xì)菌性傳染病代謝通路等方面有較為顯著的表達(dá)。差異基因顯著富集在代謝過程、細(xì)胞過程、膜狀物部分、催化活性和細(xì)胞間需結(jié)合部分的相關(guān)term中（鄭偉剛等，2019），由此可見，動植物蛋白營養(yǎng)確實影響了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，包括蛋白質(zhì)代謝和脂質(zhì)代謝等。

還通過采用DESeq2、DEGseq或edgeR獲得Dmc1基因全長cDNA序列，長度為1610 bp，在表達(dá)量分布圖中可清晰看到，PP組3組樣本（PP1、PP2、PP3）的表達(dá)程度均高于FP組3組樣本（FP1、FP2、FP3），說明在此次轉(zhuǎn)錄組測序過程中，Dmc1基因在飼喂植物蛋白源為主的飼料的羅氏沼蝦肝胰腺中具有更高的表達(dá)。該基因在單鏈DNA存在的情況下催化ATP水解，依賴ATP的單鏈DNA被雙鏈DNA攝取，以及同源單鏈DNA的依賴ATP的雜交。它與LexA相互作用，導(dǎo)致其活化，并導(dǎo)致其自身催化裂解（厲桂香等，2019）。

然后，通過對SET和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白4基因在羅氏沼蝦肝胰腺經(jīng)轉(zhuǎn)錄測序所得到差異基因表達(dá)統(tǒng)計中，以動物為源蛋白的FP組（FP1、FP2、FP3）的表達(dá)量均較低，在0.09～0.2之間，以植物源蛋白為主要飼料的PP組（PP1、PP2、PP3）中，PP1和PP3兩組具有相對較高的表達(dá)量，兩樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到26.003倍，但同平行組PP2表達(dá)量很低與FP組近乎一致。

最后，通過高通量測序技術(shù)對羅氏沼蝦肝胰腺樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的基因占絕大部分，而組織蛋白酶L屬于為數(shù)不多下調(diào)基因中的一個。該種基因在以動物蛋白源為主的飼料FP1、FP2、FP3中呈現(xiàn)表達(dá)量逐漸升高的趨勢，該基因?qū)α_氏沼蝦體內(nèi)發(fā)育多種通路具有一定的影響。而在以植物蛋白源為主的植物飼料中的表達(dá)量從PP1、PP2、PP3開始逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，且整體表達(dá)水平低于FP組。

因此，在接下來的試驗研究中，我們應(yīng)更加明確差異基因?qū)ζ渚唧w影響體現(xiàn)在哪些方面，以期更好地對羅氏沼蝦進(jìn)行養(yǎng)殖，從而獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益，為此可以展開更為全面且細(xì)致地研究，從羅氏沼蝦體內(nèi)的其他組織對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，從而在基因表達(dá)領(lǐng)域內(nèi)全方位地了解各種不同基因表達(dá)量對羅氏沼蝦代謝過程的影響。