馮 焱 蒙 愛* 馮江浩 薛智權(quán) 趙 燕,2** 崔 潔

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷030800；3.山西省太原市食品藥品檢驗(yàn)所，太原030000)

肥胖已經(jīng)成為21世紀(jì)對(duì)人類健康影響最大的因素之一，是一種日益嚴(yán)重的流行病，影響著全球5億多成年人的健康[1]。肥胖會(huì)導(dǎo)致代謝綜合征、心腦血管疾病和呼吸系統(tǒng)等多種疾病的潛在發(fā)病概率上升[2-4]。目前對(duì)于肥胖成因的認(rèn)知：一是由飲食攝入導(dǎo)致；二是個(gè)體基因表達(dá)的差異[5-6]。食物攝入后在腸道內(nèi)被微生物分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)被機(jī)體吸收產(chǎn)生影響，在此過程中腸道微生物發(fā)揮的作用對(duì)于肥胖形成至關(guān)重要。此外，通過遺傳性肥胖的研究發(fā)現(xiàn)肥胖基因的調(diào)控機(jī)制[7]。研究指出，肥胖與膳食結(jié)構(gòu)和遺傳因素關(guān)系密切[8]。腸道微生物顯著影響腸道內(nèi)環(huán)境和宿主健康[9-11]。宿主遺傳因素和飲食結(jié)構(gòu)是決定腸道微生物的主要因素，且與宿主肥胖密切相關(guān)。高脂飲食會(huì)降低腸道內(nèi)菌群多樣性，影響腸道內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[9]。適量攝入膳食纖維能夠改變腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，促進(jìn)宿主健康[12]。菊粉是一種天然的水溶性膳食纖維，是一個(gè)涵蓋不同聚合度的線性β-(2，1)果糖和果糖化合物的統(tǒng)稱，包含聚合度(DP)為2～60的不同鏈長(zhǎng)的果糖化合物，其中DP為2～9是短鏈菊粉，又稱低聚果糖。攝入菊粉后能增強(qiáng)食欲和胃腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)盲腸內(nèi)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的吸收和利用，提高機(jī)體免疫力。由于DP的不同，其被微生物利用的能力也不同，因此，短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈菊粉在腸道內(nèi)被微生物利用的效率也存在差異[13]。對(duì)于肥胖在遺傳因素方面的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素(Leptin)基因是一個(gè)關(guān)鍵基因[14-15]。Leptin基因相關(guān)蛋白能夠作用于神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控飲食攝入，同時(shí)刺激脂肪組織加速代謝，維持體重處于正常水平[16]。在肥胖個(gè)體的研究中，Leptin的抵抗和Leptin基因的突變均會(huì)使其在各個(gè)代謝通路中的作用降低而導(dǎo)致個(gè)體能量代謝失衡造成肥胖[17-18]。已證實(shí)飲食干預(yù)對(duì)于腸道微生物對(duì)肥胖的影響是關(guān)鍵。本研究主要關(guān)注短鏈菊粉和高脂飼糧在不同基因型間與盲腸微生物的互作關(guān)系。擬采用CRISPR-Cas9基因編輯手段構(gòu)建Leptin基因敲除小鼠，通過飼喂高脂飼糧及添加短鏈菊粉，研究其對(duì)小鼠生長(zhǎng)、糖耐受能力及盲腸微生物菌群區(qū)系的影響。驗(yàn)證短鏈菊粉以及高脂飼糧對(duì)不同基因型小鼠盲腸微生物的作用是否相同，進(jìn)一步研究盲腸微生物在不同條件下的微生物區(qū)系的差異，探究飼糧、基因型與盲腸微生物間的關(guān)系，為研究肥胖相關(guān)的影響因素提供更具有指向性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼糧

無特定病原體(SPF)級(jí)的C57BL/6J小鼠和C57BL/6JLeptin基因敲除小鼠均由北京唯尚立德生物科技有限公司提供，C57BL/6JLeptin基因敲除小鼠構(gòu)建由公司完成，gRNA活性檢測(cè)、繁育篩選及基因型鑒定由公司和作者共同完成。試驗(yàn)通過唯尚立德動(dòng)物倫理委員會(huì)審核(審核編號(hào)：20200048)，符合試驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)間，每組飼養(yǎng)于1個(gè)獨(dú)立通氣鼠籠，12 h光照和12 h黑暗模擬晝夜節(jié)律，自由采食與飲水。8周齡的Leptin基因敲除小鼠已表現(xiàn)出明顯的肥胖表型，同時(shí)可能導(dǎo)致血清葡萄糖含量和腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此，選擇8周齡40只雄性野生型C57BL/6J小鼠與40只雄性Leptin基因敲除小鼠，分為8組，每組10只，單籠飼養(yǎng)。1～4組為野生型小鼠不同處理組：野生型對(duì)照組(CT組)、野生型+10%短鏈菊粉組(CI組)、野生型+高脂組(CH組)、野生型+高脂+10%短鏈菊粉組(CHI組)；5～8組為L(zhǎng)eptin基因敲除小鼠不同處理組：Leptin基因敲除對(duì)照組(OT組)、Leptin基因敲除+10%短鏈菊粉組(OI組)、Leptin基因敲除+高脂組(OH組)、Leptin基因敲除+高脂+10%短鏈菊粉組(OHI組)。持續(xù)飼喂8周。

普通飼糧和高脂飼糧購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。其中普通飼糧(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量：粗蛋白質(zhì)18.2%、粗脂肪7.4%、粗纖維1.8%、粗灰分4.18%、鈣1.05%和有效磷0.71%)、高脂飼糧(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量：粗蛋白質(zhì)26.2%、碳水化合物26.3%和粗脂肪34.9%)和10%菊粉復(fù)合型高脂飼糧的脂肪來源于豆油和豬油，經(jīng)輻射滅菌后飼喂。短鏈菊粉(DP為2～9，純度95%)由比利時(shí)Orafti公司提供。

1.2 樣品采集

于第8周將小鼠脫臼處死，測(cè)定體重與體長(zhǎng)、肝臟和生殖腺脂肪重量。取盲腸內(nèi)容物分裝于凍存管，-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 體重及相關(guān)指標(biāo)計(jì)算

試驗(yàn)期間每3 d測(cè)1次采食量，每6 d測(cè)1次體重。數(shù)據(jù)記錄后，分別計(jì)算小鼠體重增長(zhǎng)率、Lee’s指數(shù)、脂肪系數(shù)及肝重比，計(jì)算公式如下：

1.4 糖耐受測(cè)定

于第8周腹腔注射葡萄糖，小鼠饑餓14 h，期間禁食不禁水，于第2日進(jìn)行測(cè)試。6 g葡萄糖配制30 mL 20%葡萄糖溶液。注射前剪取尾尖取血，使用便攜式血糖儀測(cè)定空腹血清葡萄糖含量，記為0 min血清葡萄糖含量，之后每只按照2 g/kg葡萄糖劑量腹腔注射葡萄糖溶液，并分別于腹腔注射葡萄糖溶液后的15、30、60、120 min測(cè)定并記錄血清葡萄糖含量，繪制血清葡萄糖含量變化曲線。計(jì)算曲線下面積(AUC)，單位表示為mmol/(L·h)，計(jì)算公式如下：

AUC=(Bg0+Bg15)×0.5/2+(Bg15+Bg30)×
0.5/2+(Bg30+Bg60)×0.5/2+(Bg60+
Bg120)×0.5/2。

式中：Bg0、Bg15、Bg30、Bg60、Bg120為不同時(shí)間血清葡萄糖含量。

1.5 腸道菌群分析

以Solarbio Bacterial Genomic DNA Extraction Kit對(duì)內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的抽提。使用通用上游引物338F(5’-ACTCCTACHGGAGGCAGCAG-3’)和通用下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對(duì)基因組16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，采用Trans Gene AP221-02: Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase試劑盒。采用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)的MiSeq測(cè)序技術(shù)獲得并統(tǒng)計(jì)模板DNA片段的序列信息。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SNK法分析多組間差異，LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。使用Graph Pad Prism 8.0繪制圖表。微生物多樣性分析使用美吉生物云計(jì)算平臺(tái)(https://www.i-sanger.com/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化

由表1可知，野生型小鼠在第12天CHI組體重顯著低于CI組(P<0.05)，第42～54天CH組體重顯著低于CI組(P<0.05)；Leptin基因敲除小鼠組間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。野生型小鼠各組體重均顯著低于Leptin基因敲除小鼠各組(P<0.05)。

表1 體重變化

續(xù)表1時(shí)間Time組別 GroupsCTCICHCHIOTOIOHOHI第48天Day 4830.22±2.51bc31.48±1.50b27.70±1.32c29.42±1.48bc50.32±1.94a52.85±3.73a54.06±4.31a56.05±5.74a第54天Day 5428.82±4.06bc31.34±1.35b27.26±0.47c29.50±1.41bc51.84±1.85a54.02±3.90a54.30±4.88a57.03±6.04a第60天Day 6030.72±1.99b32.28±1.59b28.90±1.21b30.50±1.82b51.10±4.98a53.98±3.66a56.66±4.75a58.37±5.88a

2.2 體重增長(zhǎng)率與肥胖相關(guān)指標(biāo)

由表2可知，野生型組中CH組和CHI組體重增長(zhǎng)率顯著低于Leptin基因敲除組中OH組和OHI組(P<0.05)。野生型組中CH組和CHI組的Lee’s指數(shù)低于CT組和CI組，其中CHI組和CI組間差異顯著(P<0.05)，CHI組和CI組間差異顯著(P<0.05)，Leptin基因敲除組中OHI組的Lee’s指數(shù)則略高于OT組和OI組(P>0.05)。與CT組相比，高脂飼糧顯著增加脂肪系數(shù)(P<0.05)，短鏈菊粉能夠略微降低脂肪系數(shù)但與高脂飼糧結(jié)合則表現(xiàn)出增加脂肪系數(shù)的情況。與CT組相比，野生型組中短鏈菊粉降低肝重比，而Leptin敲除組中短鏈菊粉提高高脂飼糧導(dǎo)致的肝重比上升，但均未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

表2 體重增長(zhǎng)率與肥胖相關(guān)指標(biāo)

由表3可知，Leptin基因敲除與高脂飼糧間交互作用對(duì)Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)有顯著影響(P<0.05)。

表3 體重增長(zhǎng)率與肥胖相關(guān)指標(biāo)多因素方差分析(P值)

2.3 糖耐受測(cè)定

由表4可知，所有時(shí)間點(diǎn)野生型組空腹血清葡萄糖含量均低于Leptin基因敲除組，只有CH組和OH組、CHI和OHI組間達(dá)到顯著差異(P<0.05)。30 min時(shí)，CH組和CHI組血清葡萄糖含量顯著高于CT組和CI組(P<0.05)，OH組和OHI組顯著高于OT組(P<0.05)。60 min時(shí)，CHI組血清葡萄糖含量顯著高于CI組(P<0.05)，OH組顯著高于OT組(P<0.05)，OHI組顯著高于OI組(P<0.05)。120 min時(shí)，野生型組間血清葡萄糖含量無顯著差異(P>0.05)，Leptin基因敲除組中OT組顯著低于OH組和OHI組(P<0.05)。除OH組外，其他各組血清葡萄糖含量在15 min時(shí)出現(xiàn)峰值，之后開始降低，于120 min時(shí)達(dá)到最低接近初始血清葡萄糖含量。CT組和CI組AUC顯著低于CH組和CHI組(P<0.05)，OT組和OI組AUC顯著低于OH組和OHI組(P<0.05)；方差分析結(jié)果表明，短鏈菊粉和高脂飼糧與Leptin基因敲除間不存在顯著交互關(guān)系(P>0.05)。

表4 葡萄糖耐受測(cè)定

2.4 盲腸微生物分析

2.4.1 盲腸微生物alpha分析

由表5可知，不同組間盲腸微生物在操作分類單元(OTU)水平進(jìn)行alpha多樣性分析。與CT組相比，CI組、CH組和CHI組Sobs指數(shù)顯著降低(P<0.05)，同時(shí)CHI組顯著低于CI組(P<0.05)；OI組、OH組和OHI組Sobs指數(shù)顯著低于OT組(P<0.05)。CT組Shannon指數(shù)顯著高于CI組、CH組和CHI組(P<0.05)，CHI組顯著低于CI組(P<0.05)；OT組Shannon指數(shù)顯著高于OI組、OH組和OHI組(P<0.05)，OI組顯著高于OHI組(P<0.05)。CHI組Simpson指數(shù)顯著高于CT組、CH組和CI組(P<0.05)，CI組顯著低于CHI組(P<0.05)；OI組、OH組和OHI組Simpson指數(shù)顯著低于OT組(P<0.05)。CHI組與CI組Chao1指數(shù)顯著低于CT組(P<0.05)；OT組顯著低于OH組、OI組和OHI組(P<0.05)。CT組Chao1指數(shù)顯著高于野生型其他組(P<0.05)；OT組顯著高于Leptin基因敲除其他組(P<0.05)。

表5 盲腸微生物菌群alpha多樣性

2.4.2 盲腸微生物在門水平和屬水平的分析

在門水平，野生型組厚壁菌門(35.80%～90.70%)、放線菌門(5.00%～49.70%)、擬桿菌門(0.28%～52.10%)和脫硫桿菌門(0.12%～12.30%)相對(duì)豐度較高(圖1-A)，Leptin基因敲除組厚壁菌門(24.40%～78.40%)、放線菌門(1.40%～36.60%)、擬桿菌門(0.20%～61.70%)和脫硫桿菌門(0.05%～19.20%)相對(duì)豐度較高(圖1-B)。在所有48個(gè)樣品中共檢測(cè)出196個(gè)屬。野生型組盲腸微生物相對(duì)豐度前20的菌屬占野生型各組所有菌屬比例的81.50%～89.50%(圖1-C)，Leptin基因敲除組中盲腸微生物相對(duì)豐度前20的菌屬占野生型組所有菌屬比例的83.40%～92.00%，高于野生型組(圖1-D)。

A：野生型組門水平 wild-type groups at phylum level；B：Leptin基因敲除組門水平 Leptin gene knockout groups at phylum level；C：野生型組屬水平 wild-type groups at genus level；D：Leptin基因敲除組屬水平 Leptin gene knockout groups at genus level。

2.4.3 盲腸微生物條件性致病菌相對(duì)豐度的分析

高脂飼糧增加盲腸內(nèi)的條件性致病菌的相對(duì)豐度，腸球菌屬和大腸桿菌-志賀菌屬在普通飼糧以及短鏈菊粉飼糧飼喂的小鼠盲腸內(nèi)未檢測(cè)到，但在高脂飼糧飼喂的小鼠盲腸內(nèi)的相對(duì)豐度均上升。CHI組中大腸桿菌-志賀菌屬(P=0.000 8)和腸球菌屬(P=0.037 9)的相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著下降，10%短鏈菊粉的添加降低條件性致病菌的相對(duì)豐度，減少盲腸內(nèi)由致病菌大量繁殖引發(fā)疾病的機(jī)率(圖2-A)。在Leptin基因敲除組中，OHI組和OH組間存在相同表征，短鏈菊粉的添加顯著降低OHI組盲腸內(nèi)大腸桿菌-志賀菌屬(P=0.000 6)和腸球菌屬(P=0.034 2)的相對(duì)豐度(圖2-B)。

A：野生型組 wild-type groups；B：Leptin基因敲除組 Leptin gene knockout groups。

由表6可知，高脂飼糧與短鏈菊粉間存在交互作用，短鏈菊粉對(duì)于雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度有影響顯著(P<0.05)，且與高脂飼糧間存在顯著交互作用(P<0.05)。布勞特氏菌屬(Blautia)和腸球菌屬相對(duì)豐度受高脂飼糧影響顯著(P<0.05)，并與短鏈菊粉與Leptin基因敲除間存在顯著交互作用(P<0.05)，高脂飼糧與Leptin基因敲除對(duì)腸球菌屬相對(duì)豐度的影響存在顯著交互作用(P<0.05)。對(duì)于大腸桿菌-志賀菌屬相對(duì)豐度的影響主要是Leptin基因敲除、高脂飼糧和短鏈菊粉共同導(dǎo)致(P<0.05)。

表6 屬水平菌群多因素方差分析(P值)

2.4.4 菌群與表型關(guān)聯(lián)性

選取在盲腸內(nèi)相對(duì)豐度最高的20個(gè)屬，進(jìn)行Mantel Test，分析其與血清葡萄糖含量、Lee’s指數(shù)、脂肪系數(shù)、肝重比及體重增長(zhǎng)率間的相關(guān)性。乳酸桿菌屬相對(duì)豐度與體重生長(zhǎng)率、肝重比、Lee’s指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，雙歧桿菌屬相對(duì)豐度與肝重比呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，布勞特氏菌屬相對(duì)豐度與血清葡萄糖含量(P<0.01)和體重增長(zhǎng)率(P<0.05)呈顯著或極顯著正相關(guān)。拉克氏梭狀芽孢桿菌屬(Lachnoclostridium)、糞桿菌屬(Faecalibaculum)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、杜博西拉屬(Dubosilla)相對(duì)豐度與血清葡萄糖含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，回腸桿菌屬(Ileibacterium)相對(duì)豐度與血清葡萄糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(圖3)。

Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科_NK4A136_群；norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014：未命名梭菌綱_UCG-014屬；norank_f_Muribaculaceae：未命名穆里巴庫萊科；Ileibacterium：回腸桿菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Lachnospiraceae_UCG-006：毛螺菌科_UCG-006；Enterorhabdus：腸桿菌屬；norank_f_Desulfovibrionaceae：未命名脫硫弧菌科；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類毛螺菌科；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；norank_f _Lachnospiraceae：未命名的毛螺菌科；Blautia：布勞特氏菌屬；Faecalibaculum：糞桿菌屬；Lachnoclostridium：拉克氏梭狀芽孢桿菌屬；Dubosilla：杜博西拉屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Coriobacteriaceae_UCG-002：紅蝽菌科_UCG-002；norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group：未命名真桿菌_產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群。

3 討 論

近年來，有大量文獻(xiàn)報(bào)道菊粉具有降低血糖血脂的功能，但鮮有關(guān)于短鏈菊粉與血清葡萄糖相關(guān)的研究[19-20]。糖耐受結(jié)果表明，普通飼糧添加短鏈菊粉能夠降低Leptin基因敲除組的空腹血清葡萄糖含量，但高脂飼糧中添加短鏈菊粉反而使2種基因型小鼠的空腹血清葡萄糖含量均有所提升，雖未至顯著水平，但也提示在高脂飼糧飼喂下添加短鏈菊粉具有潛在刺激空腹血清葡萄糖含量升高的能力。短鏈菊粉對(duì)于腹腔注射葡萄糖后120 min內(nèi)血清葡萄糖含量變化的影響不顯著。Gao等[21]研究表明，菊粉能夠降低Ⅱ型糖尿病小鼠的炎癥和血液中的脂多糖含量。本研究發(fā)現(xiàn)，短鏈菊粉雖然能夠加速血清葡萄糖含量降低但未能顯著降低，表明在不同DP的膳食纖維菊粉中，發(fā)揮降血糖功能的成分不是短鏈菊粉。高脂飼糧在2種基因型小鼠中均表現(xiàn)出對(duì)糖耐量的負(fù)面影響，同時(shí)在Leptin基因敲除組中更易誘發(fā)糖尿病，空腹血清葡萄糖含量高于正常值的是OH組和OHI組。這說明高脂飼糧對(duì)血清葡萄糖含量變化的影響較大，與Nagy等[22]研究結(jié)論一致。Leptin基因敲除組的初始血清葡萄糖含量略高于野生型組，表現(xiàn)出糖尿病癥狀的數(shù)量較多。Nagy等[22]和Wang等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼糧與Leptin基因敲除更容易導(dǎo)致血清葡萄糖含量的升高，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。方差分析也顯示，高脂飼糧是影響AUC的主要因素，其變化與短鏈菊粉和基因型的關(guān)聯(lián)性較低。但根據(jù)AUC來看，普通飼糧飼喂的Leptin基因敲除小鼠則表現(xiàn)出較好的血清葡萄糖調(diào)控能力，OT組血清葡萄糖含量下降高于CT組，最終血清葡萄糖含量更低，但未能達(dá)到顯著水平。這一現(xiàn)象未被以往的研究發(fā)現(xiàn)，推測(cè)其原因可能是Leptin基因敲除對(duì)血清葡萄糖含量變化較為敏感，而敏感程度受飼糧影響較大。此外，肥胖評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)除體重差異外，體脂率、肝重比也應(yīng)考慮在內(nèi)。在本研究中，Leptin基因敲除組體重均高于野生型組，這是Leptin基因敲除的純和小鼠最顯著的表型[24]。但是短鏈菊粉對(duì)體重的影響較低，野生型組間體重未表現(xiàn)出顯著差異，Leptin基因敲除組中OH組與OHI組體重略高于OT組。結(jié)果與Koch等[25]在菊粉與體重方面的研究結(jié)果一致，短鏈菊粉與菊粉的表現(xiàn)相同，同樣對(duì)于體重的影響較小。

關(guān)于短鏈菊粉與肥胖相關(guān)的研究表明，短鏈菊粉能夠在一定程度上降低體脂[26]。結(jié)合其他肥胖指標(biāo)，高脂飼糧在一定程度上增加脂肪系數(shù)及肝重比，短鏈菊粉飼喂能略微降低Lee’s指數(shù)、脂肪系數(shù)及肝重比。有趣的是兩者共同飼喂后，脂肪系數(shù)有所增加，同時(shí)Leptin基因敲除組中的肝重比也增加，但兩者間交互影響未達(dá)顯著水平。這些現(xiàn)象一方面表明短鏈菊粉對(duì)于肥胖的影響是基于飼糧水平，另一方面也表明Leptin基因缺失導(dǎo)致小鼠對(duì)肥胖的控制能力低下，野生型小鼠降低肥胖程度在Leptin基因缺失后失去效果。研究表明，Leptin基因編碼的Leptin蛋白能夠影響下丘腦，抑制食欲從而控制能量攝入，同時(shí)加速脂肪代謝。通過神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量的攝入與輸出從而達(dá)到控制體重的效果[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Leptin基因在心血管疾病中同樣發(fā)揮作用[28]。Leptin基因敲除后表現(xiàn)出自發(fā)性的肥胖，不受攝入食物種類的影響，且盲腸微生物結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的改變。Landman等[29]發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的失調(diào)與肥胖有顯著關(guān)系。Leptin基因敲除不僅導(dǎo)致肥胖，使盲腸菌群失調(diào)進(jìn)一步加劇肥胖進(jìn)展。在本研究中證實(shí)這一觀點(diǎn)，在alpha多樣性分析中，Leptin基因敲除組盲腸微生物相對(duì)豐度普遍低于野生型組。通過對(duì)盲腸內(nèi)微生物相對(duì)豐度檢測(cè)，門水平上相同飼糧組間Leptin基因敲除和野生型間盲腸微生物的構(gòu)成存在顯著差異。在Leptin基因敲除組中含有多種致病菌的脫硫桿菌門(Desulfurobacter)的相對(duì)豐度顯著上升，而這一菌門在野生型組中相對(duì)豐度均較低。在對(duì)屬水平的菌群相對(duì)豐度差異進(jìn)行分析，2種不同基因型的小鼠在相同飼喂條件下菌群的構(gòu)成差異更為顯著。2種條件性致病菌屬——腸球菌屬和大腸桿菌-志賀菌屬的相對(duì)豐度在Leptin基因敲除型小鼠盲腸內(nèi)均高于野生型小鼠，這2個(gè)菌屬相對(duì)豐度升高對(duì)個(gè)體健康具有潛在的威脅。此外，在屬水平的分析發(fā)現(xiàn)，布勞特氏菌屬的相對(duì)豐度變化與之前研究存在差異。以往的研究表明，布勞特氏菌屬相對(duì)豐度與個(gè)體肥胖間存在關(guān)系，在肥胖個(gè)體以及高脂飲食個(gè)體中相對(duì)豐度均下降，因此，其被視為一種新的肥胖相關(guān)標(biāo)志菌屬[30-31]。而通過本研究發(fā)現(xiàn)，布勞特氏菌屬的相對(duì)豐度在高脂飼糧飼喂下出現(xiàn)上升，同時(shí)Leptin基因敲除組盲腸內(nèi)布勞特氏菌屬相對(duì)豐度高于野生型組，這一結(jié)果與先前的研究結(jié)果相反，只有普通飼糧飼喂的2組間，CT組布勞特氏菌屬的相對(duì)豐度高于OT組。結(jié)果表明，Leptin基因?qū)τ诓紕谔厥暇鷮僮鳛樾滦头逝謽?biāo)準(zhǔn)菌，其與肥胖的關(guān)系及作用方式值得進(jìn)一步深入探究。通過多因素方差分析發(fā)現(xiàn)，飼糧類型、短鏈菊粉添加與否，以及Leptin基因敲除對(duì)盲腸微生物的菌群結(jié)構(gòu)存在交互作用，不同情況下短鏈菊粉對(duì)于盲腸微生物的影響是有差異的，這現(xiàn)象在乳酸桿菌屬上表現(xiàn)尤為明顯，同時(shí)也能由此推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果中布勞特氏菌屬相對(duì)豐度與以往文獻(xiàn)中不一致的變化可能是由短鏈菊粉與基因型交互作用所導(dǎo)致。

腸道微生物作為膳食纖維發(fā)揮作用的主體，承擔(dān)著膳食纖維與宿主間的橋梁作用。短鏈菊粉作為一種菊粉，同屬于膳食纖維，也具有膳食纖維共有的功能，但因其DP低，所發(fā)揮的作用與中鏈和長(zhǎng)鏈菊粉不同，更易降解，所以對(duì)盲腸微生物的影響更大[32-33]。高脂飲食能夠降低盲腸菌群種類，而短鏈菊粉的添加進(jìn)一步降低盲腸菌群種類，這一結(jié)果與以往關(guān)于菊粉的研究所得結(jié)論不同[34]。有可能是短鏈菊粉攝入的方式、劑量、時(shí)間和對(duì)象等存在差別，對(duì)盲腸的微生物區(qū)系的變化發(fā)酵程度產(chǎn)生細(xì)微變化，優(yōu)化腸道有益菌成為優(yōu)勢(shì)菌群。雙歧桿菌屬多為益生菌，能夠改變腸道環(huán)境，抑制致病菌的繁殖[35]。So等[36]的研究，菊粉能夠提高雙歧桿菌屬和乳酸菌屬的相對(duì)豐度。本研究的結(jié)果顯示，短鏈菊粉同樣能夠顯著提高雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度。同時(shí)Nova等[37]的研究表明，乳酸桿菌屬有抵抗肥胖的潛在能力。但本試驗(yàn)中，在野生型小鼠飼糧中添加短鏈菊粉會(huì)降低乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，只有在Leptin基因敲除組中短鏈菊粉促進(jìn)乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度上升[38]。除此也證實(shí)，短鏈菊粉對(duì)于不同基因型的小鼠腸道微生物影響也是不同的。菌群豐度分析進(jìn)一步證明這點(diǎn)，高脂飼糧對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)具有負(fù)面影響，而短鏈菊粉能夠改善盲腸菌群結(jié)構(gòu)，一定程度上恢復(fù)受高脂飼糧影響的菌群，重新構(gòu)建盲腸微生物的菌群平衡。

4 結(jié) 論

高脂飼糧或敲除Leptin基因?qū)е滦∈蠓逝?，顯著影響盲腸菌群結(jié)構(gòu)，高脂飼糧破壞盲腸菌群多樣性，并增強(qiáng)腸道能量代謝能力，短鏈菊粉對(duì)肥胖影響較小，但能降低代謝相關(guān)通路，有效降低條件性致病菌相對(duì)豐度，提高雙歧桿菌屬在盲腸內(nèi)的相對(duì)豐度，優(yōu)化盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。