田 朋 謝維娜 丁紅研 單興根 劉 暢 李 玉 趙 暢 馮士彬 王希春 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥230036)

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及導(dǎo)致的高死亡率，一直是全世界公共衛(wèi)生體系面臨的重大挑戰(zhàn)。如何控制惡性腫瘤的發(fā)生并尋找較好的防治方法，是科學(xué)家共同關(guān)注的重大科學(xué)問題[1]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路在炎癥性疾病、腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，機(jī)體內(nèi)各組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移過程均離不開這條通路[2-4]。PI3K/Akt信號通路失調(diào)直接影響到細(xì)胞炎癥、細(xì)胞增殖分化[5]，而PI3K/Akt信號通路的異常活化則會影響到腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[6]。研究表明，腫瘤細(xì)胞中PI3K基因突變及Akt基因的擴(kuò)增和活性上調(diào)與PI3K/Akt信號通路失調(diào)有關(guān)，從而引起其通路的相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)[7]。茶黃素最早由Roberts等[8]發(fā)現(xiàn)，是存在于黃茶、紅茶中的一種金黃色色素，是茶葉發(fā)酵的產(chǎn)物。茶黃素?zé)o毒副作用，耐藥性強(qiáng)，在體內(nèi)代謝迅速。在動物生產(chǎn)中，茶黃素能夠抑制腸道有害細(xì)菌增殖，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長，具有無污染、無殘留、高效價廉等優(yōu)點，同時茶黃素能清除機(jī)體內(nèi)自由基和過氧化物，維持動物機(jī)體健康，還能降低膽固醇、甘油三酯含量，防止脂肪肝發(fā)生。此外，研究表明茶黃素具有抗癌功效，可作為一種潛在的抗癌藥物[9-10]。茶黃素可以通過多種方式來達(dá)到治療癌癥的效果，如抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等[11]。因此，茶黃素的開發(fā)應(yīng)用對于提高集約化養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益及維護(hù)人類健康具有重要意義[12]。

細(xì)胞凋亡是一個很復(fù)雜的過程，其中涉及多種基因和蛋白的激活和表達(dá)，例如PI3K信號通路的活化及抑制、半胱氨酸特異性天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族蛋白和基因的活化表達(dá)和B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白的表達(dá)等，茶黃素中的茶黃素雙沒食子酸酯(theaflavin-3，3′-digallate，TF3)對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205的凋亡有促進(jìn)作用，但對正常淋巴細(xì)胞卻無明顯作用[13]。茶黃素通過調(diào)整Bax和Bcl-2的比例，同時抑制磷酸化Akt蛋白(p-Akt)的表達(dá)，從而達(dá)到抑制人類表皮樣癌和黑色素瘤細(xì)胞增殖的作用[14]。茶黃素通過改變PI3K/Akt信號通路和核因子-κB(NF-κB)信號通路內(nèi)相關(guān)蛋白的活性，引起促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例改變，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[15]。此外，茶黃素可以激活p53介導(dǎo)的Bax途徑，改變細(xì)胞線粒體跨膜電位，釋放細(xì)胞色素C，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[16]。

本試驗在研究茶黃素對小鼠乳腺癌細(xì)胞P13K/Akt信號通路影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討茶黃素抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理，并探討劑量與效應(yīng)的關(guān)系，測定不同濃度茶黃素對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，為茶黃素的臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶黃素標(biāo)準(zhǔn)品為GlpBio公司產(chǎn)品，分子式為C29H24O12，純度≥99.5%；小鼠乳腺腫瘤C-127細(xì)胞以及胰酶購自武漢Servicebio公司；DMEM高糖培養(yǎng)基來自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡試劑盒，鈣黃綠素(Calcein)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒以及青霉素、鏈霉素、兩性霉素B均來自碧云天公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒由Biosharp公司提供；β-肌動蛋白(β-actin)來自武漢賽維爾生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗和Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗由杭州華安生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將C-127細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時，棄去全部培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后棄去廢液，加入適量的胰酶細(xì)胞消化液，室溫放置約30 s(顯微鏡觀察細(xì)胞明顯收縮，肉眼可見白霧狀，并有部分細(xì)胞脫落)，加入新鮮培養(yǎng)基，用巴氏吸管吹打至細(xì)胞完全脫落。將細(xì)胞懸液收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。穩(wěn)定傳代至第10代時，收集細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞存活率

將C-127細(xì)胞以8 000個/孔的密度接種到96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基、10 μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值，計算細(xì)胞存活率。每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將C-127細(xì)胞按照1×105個/mL的密度接種到6孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，收集上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌和胰酶消化后，收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞和上清轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，按照每管600 μL加入1×Binding Buffer并輕輕重懸細(xì)胞。再按每管30 μL加入Annexin V-FITC避光染色，在室溫下孵育10 min，在上機(jī)前5 min每個離心管中再加入15 μL PI避光染色。用流式細(xì)胞儀檢測并分析數(shù)據(jù)。每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞活性

將C-127細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種密度為10 000個/mL，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌1次細(xì)胞，根據(jù)Cytotoxicity Assay Kit說明書添加Calcein AM/PI檢測工作液，置于37 ℃下避光孵育30 min后，通過熒光光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)

將C-127細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為107個/mL，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，4 ℃下在含有4%的戊二醛的PBS中固定12 h，然后用PBS洗滌3次(4 ℃、5 000×g離心15 min)，然后在1%鋨酸中固定2 h。隨后，將樣品在4 ℃的PBS中洗滌3次，通過梯度醇(30%～100%)系列脫水5 h，72 ℃烤箱中24 h后取出，包埋、修塊后用Laica超薄切片機(jī)切片，然后銅網(wǎng)撈片，最后將其進(jìn)行電子染色(鉛染色)。在JME-1400透射電鏡下進(jìn)行觀察，并拍照記錄圖像。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和BaxmRNA相對表達(dá)量

將C-127細(xì)胞按照2×105個/mL的密度接種于6孔板后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology，Shiga，日本)提取細(xì)胞的總RNA(提取過程：加入200 μL氯仿，搖勻后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將得到的上清液(500 μL)與500 μL的異丙醇混合，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，向細(xì)胞中加入500 μL的80%乙醇，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄掉上清液)，檢測RNA濃度。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法測定目的基因的mRNA相對表達(dá)量?；蛞飬?shù)如表1所示。

表1 基因引物參數(shù)

1.2.7 Western Blot檢測活化后的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平

將C-127細(xì)胞按照2×105個/mL的密度接種于6孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將茶黃素按照不同濃度[0(A組)、48(B組)、88(C組)、128 μmol/L(D組)]加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用Western Blot檢測Cleaved-Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平。測定蛋白濃度后，在泳道加入30 μg的總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(12%)，電泳之后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜4 ℃下與一抗孵育搖床過夜后用TBST緩沖液清洗3次，再進(jìn)行二抗孵育，TBST洗膜3次，放入凝膠圖像分析系統(tǒng)顯影拍攝。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗所用數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用FlowJo-VX軟件處理流式數(shù)據(jù)。柱狀圖使用Graph Pad Prism 9.2軟件進(jìn)行繪制，Western Blot結(jié)果使用Alpha軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與A組相比，B組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，C組和D組細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01)。

*表示與A組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與A組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞凋亡率的影響

如圖2所示，與A組相比，B組、C組和D組細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測茶黃素對C-127細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，隨著茶黃素濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)的線粒體也逐漸變大，線粒體嵴增多。A組細(xì)胞核染色質(zhì)深，核仁大，呈現(xiàn)出正常腫瘤細(xì)胞形態(tài)。與A組相比，B組細(xì)胞染色質(zhì)濃縮分布在核膜周圍；C組和D組染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊，聚集在核膜周邊，細(xì)胞呈眼球狀，自噬體機(jī)制形成，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器被自噬體包裹，與細(xì)胞膜融合后排出細(xì)胞外，繼而凋亡小體。

紅色箭頭①所示：自噬體機(jī)制形成，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器被自噬體包裹；紅色箭頭②所示：細(xì)胞內(nèi)的線粒體也逐漸變大，線粒體嵴增多；紅色箭頭③所示：細(xì)胞染色質(zhì)濃縮分布在核膜周圍，染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊，聚集在核膜周邊，細(xì)胞呈眼球狀。

2.4 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞活性的影響

如圖4所示，與A組相比，B組細(xì)胞密度無明顯變化，C組和D組細(xì)胞密度降低，活細(xì)胞明顯減少。與A組相比，B組、C組、D組壞死細(xì)胞增多。

綠色熒光代表Calcein標(biāo)記活細(xì)胞；紅色熒光代表PI標(biāo)記壞死細(xì)胞

2.5 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖5所示，與A組相比，B組Akt的mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，PI3K、Bcl-2的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Caspase-3、Bax的mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；C組和D組PI3K、Bcl-2和Akt的mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，Caspase-3和Bax的mRNA相對表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

圖5 茶黃素對C-127細(xì)胞Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax mRNA相對表達(dá)量的影響

2.6 不同濃度茶黃素對C-127細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

如圖6所示，與A組相比，B組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，Cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)，PI3K、Akt和Bax的蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)；C組和D組Cleaved-Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)，PI3K、Akt、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

圖6 茶黃素對C-127細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

隨著癌癥對人類威脅程度的不斷上升，尋找有效的抗癌藥物成為科學(xué)家的主要目標(biāo)[17]。作為一種天然的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)茶黃素在防癌、抑制腫瘤活性中具有重要作用[9]，深入研究其抗腫瘤作用機(jī)制具有重要意義。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶[18]。Akt主要以PI3K依賴的形式被細(xì)胞外因子磷酸化和激活[19]。Akt是PI3K下游的主要效應(yīng)分子，而Akt的活化與腫瘤和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[20]。本試驗利用不同濃度茶黃素作用于小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C-127細(xì)胞，證明茶黃素可以抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

Bcl-2蛋白又稱抗凋亡蛋白，由4個Bcl-2同源域組成[21]，可以抑制細(xì)胞色素C的釋放和阻止Caspase-3的活化[22]。同時，Bcl-2也是抑制細(xì)胞程序性凋亡的關(guān)鍵因素之一。PI3K/Akt信號通路與Bcl-2家族成員的關(guān)系是密不可分的，前者可以調(diào)節(jié)后者的生物活性。Bcl-2家族成員按照結(jié)構(gòu)和功能的不同可以分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白2類，本試驗中檢測的Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白。細(xì)胞對凋亡信號的敏感性是取決于抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡，而一旦這種平衡被打破，細(xì)胞則可能會處于凋亡狀態(tài)[23]。一般情況下，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白處于動態(tài)平衡中，一旦抗凋亡蛋白Bcl-2增多，則說明抑制了細(xì)胞凋亡，而如果促凋亡蛋白Bax增多，則說明促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[24]。本試驗中，添加不同濃度茶黃素后，C-127細(xì)胞中Bcl-2的mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平隨著茶黃素濃度的升高而降低，Bax的mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平則隨著茶黃素濃度的升高而升高；并且，通過透射電鏡和熒光顯微鏡可以觀察到，隨著茶黃素濃度升高，壞死細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞活性降低，內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細(xì)胞形成凋亡小體；C組和D組細(xì)胞無論是從外部形態(tài)還是內(nèi)部形態(tài)均呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

細(xì)胞凋亡過程的核心環(huán)節(jié)還包括Caspase-3，Caspase-3是存在于Akt下游線粒體細(xì)胞凋亡信息通道的關(guān)鍵部分。在開啟Caspase級聯(lián)反應(yīng)中，細(xì)胞凋亡啟動者Caspase-8和Caspase-9同時被活化，二者將成為細(xì)胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3的上游調(diào)控蛋白，如果活化了，則Caspase-3前體將被活化，而激活后的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)會以胞內(nèi)的重要蛋白為靶點，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[25]。在本試驗中，通過Western Blot和PCR檢測發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度茶黃素后，C-127細(xì)胞中Caspase-3的mRNA相對表達(dá)量和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著或極顯著升高，說明茶黃素通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Caspase級聯(lián)反應(yīng)。此外，Cleaved-Caspase-3可以直接誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，加速抑制細(xì)胞的線粒體功能以及促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素C釋放，最終引起細(xì)胞凋亡[26]。

4 結(jié) 論

茶黃素通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控促凋亡基因和抗凋亡基因表達(dá)，改變促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的比例；并且，隨著茶黃素濃度的增大，茶黃素促進(jìn)小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。