李 愿 閆素梅 劉錦濤 楊青苗 郭曉宇 郭詠梅 鄭亞光 趙艷麗

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，呼和浩特010018)

乳蛋白作為牛乳中的重要組成部分，是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。奶牛飼糧營養(yǎng)水平、乳腺的健康狀況以及其他調(diào)控乳蛋白合成的調(diào)控因子的變化，均會引起乳蛋白含量的變化。乳腺組織作為合成乳蛋白的重要場所，是奶牛體內(nèi)代謝旺盛的組織之一，短時間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)、活性氮(RNS)自由基，超高水平的ROS等自由基導(dǎo)致乳腺內(nèi)氧化還原失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進而破壞有機大分子發(fā)生代謝紊亂，誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生[1]。長時間的氧化應(yīng)激使奶牛乳腺代謝紊亂，導(dǎo)致產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)的下降，增加患乳腺炎的風(fēng)險，影響經(jīng)濟效益。維生素A在維持機體正常生理功能中起著重要作用，通過對多種通路的調(diào)控影響抗氧化、免疫刺激、上皮細胞維持等功能[2]。體內(nèi)外低濃度的一氧化氮(NO)有抗菌、抗腫瘤作用，但過高濃度的NO則會導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[3]。有學(xué)者提出，維生素A對NO的調(diào)節(jié)可能是通過上調(diào)硫氧還蛋白還原酶(TrxR)抑制誘導(dǎo)型氧化氮合酶(iNOS)的活性，進而影響NO的生成，但其機理尚不清晰[4]。因此，探討維生素A緩解奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)氧化損傷以及乳蛋白合成下降的機理，對提高產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)以及延長奶牛的使用壽命具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與飼喂推薦劑量(110 IU/kg BW)的維生素A組相比，飼喂高劑量(220 IU/kg BW)的維生素A顯著提高了奶牛血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和TrxR的活性，并顯著降低血清中ROS的含量，有增加乳蛋白含量的趨勢[5]。體外研究顯示，維生素A可緩解脂多糖對BMECs的氧化損傷，提高細胞內(nèi)GPx、TrxR的活性和基因表達[6]。對BMECs的體外研究發(fā)現(xiàn)，維生素A具有促進乳蛋白及其合成相關(guān)基因表達的作用[7]。然而，維生素A是否能通過緩解氧化損傷促進乳蛋白合成還未見相關(guān)報道。因此，本試驗采用不同濃度的維生素A進行預(yù)處理，來探究其對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)乳蛋白合成的影響及其機理，并篩選適宜的維生素A添加劑量，為深入研究乳蛋白合成的調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及試驗設(shè)計

原代BMECs的培養(yǎng)采用膠原酶消化法，步驟參照Qi等[8]的方法進行。采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作為氧化應(yīng)激源，將第3代BMECs細胞混勻后分為對照組(CON組)、NO損傷組(NO組)以及NO損傷+不同濃度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL)維生素A預(yù)保護組(NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4組)，每組4個重復(fù)。第3代BMECs細胞在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞融合至80%～90%后，各組更換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后，CON組不添加維生素A和DETA/NO繼續(xù)培養(yǎng)30 h；NO組以不添加維生素A的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，添加1 000 μmol/L DETA/NO繼續(xù)培養(yǎng)6 h；NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4組分別以含0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL維生素A的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，添加1 000 μmol/L DETA/NO繼續(xù)培養(yǎng)6 h。處理結(jié)束后，收集細胞以及細胞培養(yǎng)液進行抗氧化指標(biāo)、乳蛋白合成相關(guān)蛋白含量和酶活性以及抗氧化和乳蛋白合成相關(guān)基因表達的測定。

1.2 配制試劑

維生素A原液：將50 mg的視黃酸(Sigma公司，美國)溶解于2.5 mL二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司，美國)，配制成20 mg/mL的維生素A原液，0.22 μm濾器過濾后避光冷凍保存。

NO貯備液：10 mg的DETA/NO溶于612.8 μL的無菌蒸餾水中，配成濃度為100 mmol/L的貯備液。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 細胞活力

采用CCK-8法測定BMECs的細胞活力，結(jié)果用相對增殖率(RGR)表示。將細胞懸液接種于96孔板中，按照試驗設(shè)計加入不同工作液處理細胞30 h后，每孔加20 μL的CCK-8溶液(碧云天)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度(OD450 nm)值，計算RGR。

RGR(%)=(試驗組OD450 nm值/
對照組OD450 nm值)×100。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)及乳蛋白合成相關(guān)蛋白含量和酶活性

將BMECs以3×105個/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，根據(jù)試驗設(shè)計加入不同工作液處理細胞30 h后，收集1 mL細胞培養(yǎng)液，采用鉬酸銨顯色法測定總抗氧化能力(T-AOC)，采用黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，采用比色法測定過氧化氫酶(CAT)活性，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定NO、ROS含量和iNOS活性，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

將培養(yǎng)皿置于冰上，棄去細胞上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，加入適量細胞裂解液，冰浴30 min，刮取細胞轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管內(nèi)，4 ℃、12 000 r/min離心10min，收集上清，采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GPx活性，采用ELISA法測定TrxR、p70核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)活性和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.3 抗氧化和乳蛋白合成相關(guān)基因表達

將BMECs以2×105個/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，按照試驗設(shè)計加入不同工作液處理細胞30 h后，使用Trizol法提取細胞內(nèi)的總RNA[9]，RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptRTReagentKit(TaKaRa)試劑盒并按說明書進行操作。利用實時熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司)測定細胞內(nèi)抗氧化和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達情況，詳細步驟參照SYBY Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明書。PCR所用引物序列見表1。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算目的基因[GPx1、TrxR、αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、真核起始因子4E(eIF4E)、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、mTOR、S6K1、酪氨酸激酶2(JAK2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)]的mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2019進行整理后，使用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析，以P≤0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs的RGR的影響

由圖1可知，與CON組相比，NO組的RGR顯著降低(P<0.05)。與NO組相比，NA0.1～NA4組的RGR顯著升高(P<0.05)，且以NA1組的RGR最高，達到CON組水平。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，與CON組相比，NO組的TrxR、CAT、GPx活性與T-AOC顯著降低(P<0.05)，iNOS活性與ROS、NO含量顯著增加(P<0.05)。與NO組相比，NA0.2～NA4組的TrxR、CAT、GPx活性顯著提高(P<0.05)，NA0.1～NA4組的T-AOC顯著提高(P<0.05)，NA0.2～NA4組的iNOS活性顯著降低(P<0.05)，NA0.1～NA4組的ROS含量顯著降低(P<0.05)，NA0.5和NA1組的NO含量顯著降低(P<0.05)。NA0.2～NA4組之間TrxR活性與T-AOC無顯著差異(P>0.05)；NA0.2～NA2組之間CAT活性無顯著差異(P>0.05)；NA1、NA2組的GPx活性無顯著差異(P>0.05)；NA4組的CAT、GPx活性顯著低于NA1組(P<0.05)；NA4組的NO、ROS含量顯著高于NA1組(P<0.05)；各組間T-SOD活性均無顯著差異(P>0.05)。

表2 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)蛋白含量和酶活性的影響

由表3可知，與CON組相比，NO組的S6K1活性和mTOR含量顯著降低(P<0.05)；NA1組的S6K1活性顯著提高(P<0.05)；NA1、NA2、NA4組的mTOR含量顯著提高(P<0.05)。與NO組相比，NA0.05～NA4組的S6K1活性和mTOR含量均顯著提高(P<0.05)，且S6K1活性以NA1組最高，mTOR含量以NA2、NA4組較高。

表3 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)蛋白含量和酶活性的影響

2.4 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)抗氧化和乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響

由表4可知，與CON組相比，NO組GPx1、TrxR、CSN2、CSN3、mTOR、S6K1、4EBP1、eIF4E、STAT5的mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)，且均不同程度的低于NA0.05～NA4組。GPx1的mRNA相對表達量以NA1組最高，且顯著高于其他組(P<0.05)，同時NA4組顯著低于NA0.1～NA1組(P<0.05)；TrxR的mRNA相對表達量以NA1～NA4組較高，顯著高于NO組和NA0.05～NA0.2組(P<0.05)。CSN1S1的mRNA相對表達量以NA0.2～NA1較高、CSN2的mRNA相對表達量以NA1組最高，均顯著高于CON組和NO組(P<0.05)；NA2、NA4組CSN3的mRNA相對表達量顯著高于CON組、NO組和NA0.05～NA1組(P<0.05)，NA1組顯著高于NO組和NA0.05～NA0.5組(P<0.05)；NA0.05、NA0.1和NA4組mTOR的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，NA1～NA4組4EBP1、eIF4E的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，mTOR、S6K1、4EBP1和eIF4E的mRNA相對表達量均以NA4組最高；NA0.5～NA4組STAT5的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，NA0.1～NA2組JAK2的mRNA相對表達量顯著高于NO組(P<0.05)，STAT5和JAK2的mRNA相對表達量均以NA1組最高。

表4 維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)抗氧化和乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響

續(xù)表4項目Items組別 GroupsCONNONA0.05NA0.1NA0.2NA0.5NA1NA2NA4SEMP值 P-valueκ-酪蛋白CSN31.00bc0.75d 0.76d0.80cd0.84cd0.85cd1.10b 1.69a 1.73a 0.048<0.000 1哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR1.00ab0.83c 1.02ab1.08ab0.84c 0.79c 0.94bc0.94bc1.15a 0.0480.000 2p70核糖體蛋白S6激酶1S6K11.00ab0.80dc0.93abc0.93abc0.87bc0.66d 0.79dc0.89abc1.07a 0.0550.001 4真核起始因子4E4EBP11.00cd0.75e 0.83e 0.87de0.86de0.75e 1.12c 1.32b 1.52a 0.048 <0.000 1真核起始因子4E結(jié)合蛋白eIF4E1.00ab0.69c 0.79bc0.81bc0.85bc0.88bc1.08ab1.04ab1.27a 0.0850.002 7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5STAT51.00a 0.53d 0.76c 0.80bc0.90abc0.94ab1.05a 1.01a 0.99a 0.047<0.000 1酪氨酸激酶2JAK21.00de0.85e 1.00de1.17abc1.21bc1.33ab1.47a 1.07cd0.85e 0.059<0.000 1

3 討 論

乳腺組織泌乳代謝旺盛導(dǎo)致ROS、RNS生成的增加，誘導(dǎo)奶牛乳腺發(fā)生氧化應(yīng)激。TrxR、T-SOD、CAT、GPx等酶是清除體內(nèi)自由基的重要物質(zhì)，其活性的降低導(dǎo)致機體的抗氧化能力下降，清除自由基的能力下降，致使大量自由基堆積[10-11]。前期本課題組研究顯示，在奶牛飼糧中添加高于推薦劑量(220 IU/kg BW)的維生素A可明顯提高奶牛的免疫、抗氧化能力，有提高乳蛋白含量的趨勢[5]；維生素A能通過提高TrxR、T-SOD、CAT、GPx等抗氧化酶的活性，降低ROS含量來緩解奶牛的氧化應(yīng)激[12]。而有研究顯示，添加高濃度的維生素A會導(dǎo)致妊娠大鼠的子宮和卵巢氧化損傷標(biāo)志物含量增加，產(chǎn)生促氧化效應(yīng)，使維生素A失去抗氧化能力[13]。本試驗結(jié)果顯示，維生素A濃度為4.00 μg/mL組CAT和GPx活性顯著低于維生素A濃度為1.00 μg/mL組，GPx1的mRNA相對表達量顯著低于維生素A濃度為0.10～1.00 μg/mL組，NO和ROS含量顯著高于維生素A濃度為1.00 μg/mL組。這表明高濃度的維生素A可能通過降低抗氧化酶活性，增加ROS的含量，使維生素A失去抗氧化能力，進而導(dǎo)致維生素A緩解NO引起的氧化應(yīng)激能力下降。體外研究驗證了維生素A對過氧化氫(H2O2)、脂多糖(LPS)等外源性刺激誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)的氧化應(yīng)激有緩解作用[7,14]。本研究結(jié)果也得出相同的規(guī)律，即NO誘導(dǎo)損傷BMECs后，ROS、NO含量與iNOS活性顯著升高，抗氧化酶TrxR和GPx等的活性降低，抗氧化相關(guān)基因GPx1和TrxR的表達下調(diào)，降低了細胞的活力和抗氧化能力；而添加不同濃度的維生素A進行預(yù)保護，不同程度地提高了由NO誘導(dǎo)損傷引起的細胞活力、抗氧化酶活性及抗氧化相關(guān)基因表達的下降，且效果以0.20～2.00 μg/mL較好，尤以1.00 μg/mL最好。

乳中的蛋白主要是酪蛋白，如CSN1S1、CSN2和CSN3，是衡量牛奶中乳蛋白含量的重要指標(biāo)，與酪蛋白指數(shù)、乳蛋白的比例以及乳品質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān)[15-17]。本試驗中，NO誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致乳蛋白合成相關(guān)基因CSN1S1、CSN2和CSN3的表達顯著下調(diào)。酪蛋白基因表達下調(diào)可能會降低乳蛋白的比例以及乳品質(zhì)的穩(wěn)定。大量研究表明，蛋白質(zhì)的合成主要通過轉(zhuǎn)錄和翻譯2個方面從酪氨酸激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號通路和mTOR信號通路進行調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷BMECs內(nèi)的JAK/STAT信號通路，CSN2的表達顯著下降，其他與乳蛋白合成相關(guān)的基因的表達均有下降趨勢[8,18-20]。本試驗結(jié)果表明，NO損傷導(dǎo)致了STAT5和JAK2表達的下調(diào)，添加不同濃度的維生素A進行預(yù)保護能緩解STAT5和JAK2表達的下調(diào)。mTOR信號通路主要從乳蛋白翻譯水平發(fā)揮調(diào)控作用，下游通路的mTOR被激活后，磷酸化4EBP1使其與eIF4E分離，并同時激活S6K1，來促進蛋白質(zhì)翻譯及表達[21]，尤其促進酪蛋白的翻譯。Chen等[22]在培養(yǎng)多能性胚胎干細胞時添加維生素A后發(fā)現(xiàn)，其通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)調(diào)節(jié)維生素A介導(dǎo)的細胞增殖，進一步添加雷帕霉素和LY294002分別阻斷mTOR及其上游PI3K，驗證了維生素A可促進mTOR信號通路相關(guān)基因的表達。有研究發(fā)現(xiàn)添加維生素A促進了BMECs內(nèi)TrxR的表達，進一步沉默TrxR后降低了JAK/STAT信號通路和mTOR信號通路相關(guān)基因的表達，以及mTOR信號通路的磷酸化水平[23]。Hu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞時敲除GPx7基因，mTOR信號通路相關(guān)因子S6K1和磷酸化S6K1蛋白的表達顯著降低。也有研究表明JAK/STAT信號通路能調(diào)控炎癥，葛根芩連湯可通過JAK/STAT信號通路降低ROS和其他炎癥因子的產(chǎn)生，緩解小鼠結(jié)腸上皮的氧化應(yīng)激[25]。這些結(jié)果表明，維生素A可能通過影響TrxR和GPx的活性進而調(diào)控JAK/STAT信號通路和mTOR信號通路。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)TrxR、GPx1、mTOR、S6K1、JAK2、STAT5、eIF4E、4EBP1、CSN1S1、CSN2和CSN3表達的下調(diào)具有緩解作用，可能通過上調(diào)TrxR和GPx的表達緩解JAK/STAT信號通路和mTOR信號通路活性的下降，進而緩解乳蛋白合成的下降。本研究也發(fā)現(xiàn)高濃度維生素A對GPx活性及GPx1表達下降的緩解作用減弱，對TrxR和mTOR表達下降的緩解作用較好，因此維生素A是如何通過緩解氧化應(yīng)激調(diào)控JAK/STAT信號通路和mTOR信號通路還需進一步研究探討。

綜上所述，維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)乳蛋白合成下降的緩解作用與添加劑量相關(guān)，對JAK2、CSN1S1、CSN2表達下降的緩解作用以0.20～1.00 μg/mL較好，尤以1.00 μg/mL最好；對mTOR和S6K1表達下降的緩解作用以1.00 μg/mL最好；對eIF4E、4EBP1、STAT5以及CSN3表達下降的緩解作用以1.00～4.00 μg/mL較好。綜合抗氧化指標(biāo)、乳蛋白合成相關(guān)基因的表達來看，以0.20～2.00 μg/mL維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMEC內(nèi)乳蛋白合成下降的緩解作用較好，尤以1.00 μg/mL最好。

4 結(jié) 論

維生素A可以緩解NO引起的BMECs的細胞活力、抗氧化能力下降以及乳蛋白合成相關(guān)基因CSN1S1、CSN2、CSN3、STAT5、JAK2、mTOR、S6K1、eIF4E、4EBP1表達的下調(diào)，且緩解作用與添加劑量相關(guān)。綜合比較，以0.20～2.00 μg/mL維生素A對NO誘導(dǎo)損傷的BMECs內(nèi)乳蛋白合成下降的緩解作用較好，尤以1.00 μg/mL最好。