劉汝杰 李明曄 孫澤威，2，3 仲慶振，2，3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130118；3.吉林省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130118)

雛雞破殼后需從孵化場(chǎng)運(yùn)輸至養(yǎng)殖場(chǎng)，在運(yùn)輸過程中會(huì)導(dǎo)致雛雞機(jī)體遭受巨大的挑戰(zhàn)，而這些挑戰(zhàn)往往作為應(yīng)激源造成雛雞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，如心跳加速、恐懼不安、呼吸急促等[1-2]。研究表明，長時(shí)間運(yùn)輸可對(duì)動(dòng)物腸道造成嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為腸道絨毛頂端受損、腸道通透性改變、絨毛和隱窩受損及緊密連接蛋白表達(dá)下降等[3-5]。此外，腸黏膜是腸上皮細(xì)胞的第1道防線，在感受和響應(yīng)外界刺激時(shí)需要消耗大量能量，而線粒體作為細(xì)胞能量的供應(yīng)站，在應(yīng)激條件下，外界的刺激可引起線粒體氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體跨膜電位發(fā)生變化、能量供應(yīng)減弱，甚至引起腸上皮細(xì)胞凋亡[6]。為了緩解應(yīng)激造成危害，線粒體可通過上調(diào)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotides，NADH)比值，從而減輕線粒體氧化應(yīng)激，減緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程[7]。研究表明，運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞中線粒體受到損傷，且細(xì)胞出現(xiàn)壞死性凋亡現(xiàn)象[8]。壞死性凋亡亦稱為程序性死亡，受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1，RIPK1)、受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3，RIPK3)和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)是調(diào)控壞死性凋亡的關(guān)鍵信號(hào)因子，是壞死性凋亡中的特殊標(biāo)志物[9]。并且，雛雞腸道功能及形態(tài)的發(fā)育將直接影響其后期生長、免疫及抗病等方面[10]。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控改善運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)雛雞腸道健康的不利影響是亟待解決的問題。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)不僅是蛋白質(zhì)、核酸合成的前體，更是腸黏膜細(xì)胞快速增值的主要能量來源[11]。研究表明，外源補(bǔ)充Gln可提高肉雞生長性能[12-13]、改善腸道健康[14-15]、提高機(jī)體免疫力[16-17]等。張柏林等[18]研究飼糧添加Gln對(duì)肉雞免疫應(yīng)激的影響，結(jié)果表明，飼糧添加1% Gln可顯著改善腸道形態(tài)并減弱應(yīng)激狀態(tài)下炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，從而緩解免疫應(yīng)激對(duì)肉雞產(chǎn)生的不良影響。徐娟等[19]以吉林白鵝為研究對(duì)象，通過腹腔注射Gln研究熱應(yīng)激對(duì)吉林白鵝的影響，結(jié)果表明，腹腔注射Gln可上調(diào)空腸黏膜熱休克蛋白70及緊密連接蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平，有效緩解熱應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜的損傷現(xiàn)象。吳艷[20]以SD大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，建立運(yùn)輸應(yīng)激模型，通過灌服Gln來研究其對(duì)緩解運(yùn)輸應(yīng)激的機(jī)制，結(jié)果表明，Gln可通過影響運(yùn)輸應(yīng)激大鼠的血清、神經(jīng)中與應(yīng)激密切相關(guān)的部分生物活性物質(zhì)含量以及熱休克蛋白72 mRNA表達(dá)水平來緩解運(yùn)輸應(yīng)激。但關(guān)于Gln在緩解運(yùn)輸應(yīng)激雛雞腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體功能及壞死性凋亡信號(hào)通路方面的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選取1日齡愛拔益佳(AA)肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，探究運(yùn)輸前灌服不同水平Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體功能及凋亡信號(hào)通路的影響，從而為集約化養(yǎng)殖提高生產(chǎn)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取1日齡AA肉雞300只，隨機(jī)分為5個(gè)組(A、B、C、D和E組)，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。A、B組運(yùn)輸前灌服1 mL生理鹽水，C、D和E組運(yùn)輸前分別灌服1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50、0.75和1.00 g/kg的Gln。灌服均在雛雞出殼后1 h內(nèi)完成，灌服結(jié)束后A組不做運(yùn)輸應(yīng)激處理，B、C、D和E組以70 km/h的速度運(yùn)輸應(yīng)激5 h。

1.2 樣品采集

運(yùn)輸試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取4只肉雞進(jìn)行屠宰，分別采集空腸腸道及空腸黏膜，裝入提前標(biāo)記的凍存管中，并將其放于液氮中保存?？漳c腸道后續(xù)使用線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行線粒體分離?？漳c黏膜用于測(cè)定壞死性凋亡信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 線粒體跨膜電位測(cè)定

采用JC-1熒光標(biāo)記法檢測(cè)線粒體跨膜電位的變化，具體試驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。

1.3.2 線粒體NAD+和NADH含量的測(cè)定

采用碧云天生物技術(shù)有限公司試劑盒測(cè)定線粒體NAD+和NADH含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并計(jì)算NAD+/NADH比值。

1.3.3 線粒體ATP含量測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定線粒體ATP含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 空腸黏膜RIPK1、RIPK3及MLKLmRNA表達(dá)水平測(cè)定

RNA的提取：使用RNAiso Plus試劑進(jìn)行總RNA的提取。取適量空腸黏膜樣品置于裝有1 mL預(yù)冷的RNAiso Plus的RNase-Free試管中進(jìn)行勻漿，隨后加入氯仿進(jìn)行抽提，離心后抽取適量上清并加入異丙醇，使RNA沉淀，沉淀的RNA用75%的酒精洗滌3次，晾干后重溶，并取重溶后的RNA取2 μL用UVS-99微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)濃度和純度。

選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并將獲得的cDNA于-80 ℃保存。

熒光定量PCR實(shí)時(shí)分析：目的基因和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的序列見表1。利用TB Green Premix Ex Taq試劑盒(No.RR420A)進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。基因表達(dá)的相對(duì)定量計(jì)算參照Curi等[21]的方法。

表1 引物序列

1.4 空腸黏膜RIPK1、RIPK3及MLKL蛋白表達(dá)水平測(cè)定

取20 mg空腸黏膜組織置于裂解液中勻漿至充分裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣分離，將分離得到的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，置于封閉液中室溫、搖床緩慢搖動(dòng)下封閉1 h，然后將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反應(yīng)過夜，孵育結(jié)束后用1×TBST洗膜3次，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中，室溫避光孵育1 h。使用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)中的ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸線粒體跨膜電位及NAD+、NADH含量的影響

如圖1所示，與A組相比，B、C、D和E組空腸線粒體跨膜電位顯著降低(P<0.05)；與B組相比，C、D和E組空腸線粒體跨膜電位顯著提高(P<0.05)。與A組相比，B、C、D和E組空腸線粒體NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著降低(P<0.05)，NADH含量顯著增加(P<0.05)。與B組相比，D和E組空腸線粒體NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著增加(P<0.05)，其中，D組空腸線粒體NAD+含量與A組無顯著差異(P>0.05)。與B組相比，C、D和E組空腸線粒體NADH含量顯著降低(P<0.05)，但仍顯著高于A組(P<0.05)。D組空腸線粒體NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著高于C和E組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸線粒體ATP含量的影響

如圖2所示，與A組相比，B、C、D和E組空腸線粒體ATP含量顯著降低(P<0.05)；與B組相比，C、D和E組空腸線粒體ATP含量顯著增加(P<0.05)，但仍顯著低于A組(P<0.05)。

圖2 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸線粒體ATP含量的影響

2.3 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸黏膜壞死性凋亡信號(hào)通路的影響

如圖3所示，與A組相比，B、C、D和E組空腸黏膜RIPK1、RIPK3和MLKLmRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與B組相比，C、D和E組空腸黏膜RIPK1、RIPK3和MLKLmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但仍顯著高于A組(P<0.05)。

圖3 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸黏膜壞死性凋亡信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與A組相比，B、C、D和E組空腸黏膜RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與B組相比，C、D和E組空腸黏膜RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但仍顯著高于A組(P<0.05)。

圖4 運(yùn)輸前灌服Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸黏膜壞死性凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞線粒體功能的影響

線粒體生成和釋放ATP、進(jìn)行氧化磷酸化的先決條件是具有內(nèi)負(fù)外正的正?？缒る娢籟22]。而在細(xì)胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件之一。在細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體通透性發(fā)生改變，兩側(cè)離子梯度消失，導(dǎo)致線粒體跨膜電位破壞、呼吸鏈與氧化磷酸化失耦聯(lián)、ATP合成停止等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)選取JC-1進(jìn)行染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位。JC-1是一種親脂陽離子染料，線粒體跨膜電位較高時(shí)JC-1在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體跨膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光。研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)會(huì)引起線粒體跨膜電位發(fā)生異常變化[23]。同樣，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，由于5 h的運(yùn)輸導(dǎo)致雛雞空腸線粒體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)致使跨膜電位崩潰，這提示，5 h的運(yùn)輸促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。研究表明，線粒體功能出現(xiàn)障礙大部分原因是由氧化應(yīng)激所引起[24]，在本試驗(yàn)中，灌服Gln后，可觀察到紅色熒光增強(qiáng)，這表明Gln可有效緩解運(yùn)輸應(yīng)激引起的雛雞線粒體跨膜電位的下降。這可能的是由于在運(yùn)輸狀況下線粒體產(chǎn)生大量活性氧引起氧化應(yīng)激，而Gln作為合成谷胱甘肽的合成前體被腸細(xì)胞吸收后合成大量的谷胱甘肽提高抗氧化能力，從而減輕了空腸線粒體跨膜電位受損[25]。

NAD+是一種接受氫化物的輔酶，其還原態(tài)為NADH，二者在細(xì)胞代謝和能量產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用，能夠參與線粒體能量代謝、維持鈣穩(wěn)態(tài)、基因表達(dá)、氧化應(yīng)激、衰老和凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致NAD+向其還原態(tài)NADH的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，降低了NAD+含量以及NAD+/NADH比值。研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或應(yīng)激時(shí)，可通過上調(diào)NAD+/NADH比值，以增強(qiáng)線粒體抵御應(yīng)激的能力[7]，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸前灌服Gln可不同程度改善空腸線粒體NAD+和NADH含量，當(dāng)灌服劑量為0.75 g/kg時(shí)效果較好，可能的原因是Gln被細(xì)胞吸收后轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為NADH，NADH在電子傳遞的過程中產(chǎn)生NAD+，從而增加了NAD+和NADH含量[26]。

ATP含量通常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞能量狀態(tài)的指標(biāo)。ATP合成的主要場(chǎng)所是線粒體，線粒體通過氧化磷酸化負(fù)責(zé)細(xì)胞90%以上的能量來源[27]。線粒體具有突出的“儲(chǔ)備能力”，當(dāng)機(jī)體遭受嚴(yán)重應(yīng)激時(shí)，這種“儲(chǔ)備能力”將被消耗[28-29]。研究表明，運(yùn)輸應(yīng)激可加速機(jī)體的能量代謝，使能量代謝池中可直接消耗能量物質(zhì)減少[30-31]。與此相似，本研究結(jié)果顯示，5 h的運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致空腸線粒體ATP含量顯著減少。Li等[32]研究運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞能量儲(chǔ)備情況的影響，結(jié)果表明，4和8 h的運(yùn)輸應(yīng)激顯著增加了心肌細(xì)胞中ATP含量，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是由于取樣部位不同和心臟損傷的代償反應(yīng)所致。Gln可顯著增加ATP含量，增強(qiáng)能量代謝池中可消耗能量物質(zhì)，從而保障相關(guān)組織在抵抗應(yīng)激時(shí)的能量來源，發(fā)揮最大的保護(hù)作用。本研究表明，Gln改善了空腸線粒體的基本產(chǎn)能功能，這可能由于運(yùn)輸前灌服Gln增加了線粒體中NADH和NAD+含量，而在電子傳遞的過程中，NADH被分解為NAD+，產(chǎn)生H+和1對(duì)電子，H+可用于驅(qū)動(dòng)位于線粒體內(nèi)膜上的某種“泵”，以ATP的形式產(chǎn)生了大量的能量。

3.2 Gln對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激雛雞空腸黏膜壞死性凋亡信號(hào)通路的影響

細(xì)胞壞死性凋亡的特征是細(xì)胞腫脹、膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放[33]。研究表明，壞死性凋亡是一種“受控”的死亡類型，這涉及RIPK1-RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死級(jí)聯(lián)反應(yīng)[34]。壞死性凋亡可由激活炎癥和細(xì)胞死亡的細(xì)胞外刺激物引起，該過程涉及多種磷酸化和泛素化等復(fù)雜過程。首先RIPK1被凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)泛素化，并通過核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活，在檢測(cè)“死亡信號(hào)”后，RIPK1被去泛素化酶圓柱瘤蛋白(cylindromatosis，CYLD)去泛素化從而招募RIPK3。RIPK1/RIPK3復(fù)合物可招募并磷酸化MLKL，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹、膜溶解和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)不可控釋放，使細(xì)胞壞死性凋亡[35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)輸應(yīng)激顯著增加了空腸黏膜當(dāng)中RIPK1、RIPK3和MLKLmRNA和蛋白的表達(dá)。Huang等[36]體外研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可引起RIPK1和MLKLmRNA的表達(dá)水平顯著增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以上結(jié)果提示，Gln可通過抑制壞死性凋亡相關(guān)基因的表達(dá)緩解運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞壞死性凋亡發(fā)生的進(jìn)程，從而保護(hù)了腸道穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié) 論

運(yùn)輸前灌服Gln能夠緩解因運(yùn)輸導(dǎo)致的雛雞應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)腸黏膜線粒體產(chǎn)能功能，降低腸黏膜細(xì)胞凋亡進(jìn)程，從而一定程度上有效緩解運(yùn)輸刺激引起的雛雞腸黏膜應(yīng)激反應(yīng)，且以灌服劑量為0.75 g/kg時(shí)效果較好。