陳 奇 韋玉衡 謝小東 趙 怡 王秋華 于美玲 韋英益 胡庭俊

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)是單鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)4個型(PCV1～PCV4)[1]，感染宿主會減少其樹突狀細胞的數(shù)量，并抑制病毒抗原向T淋巴細胞傳遞，進而導(dǎo)致免疫活性T/B淋巴細胞數(shù)量減少，抑制宿主的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主抵抗力下降[2]。此時，易造成其他病毒或細菌的感染而繼發(fā)其他疾病，如豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、仔豬心肌炎、母豬繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾病以及仔豬先天性震顫(CT)等[3]。PCV感染在全世界的養(yǎng)豬地區(qū)普遍存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。

近年來，中草藥及其活性成分在預(yù)防和治療動物疾病方面取得了一定的成果。辣蓼(PolygonumhydropiperL.)為蓼科(Polygonaceae)植物的干燥全草，含有黃酮類化合物、揮發(fā)油、鞣質(zhì)類等物質(zhì)[4]。辣蓼具有抗氧化、抗菌、抗高血壓、抗炎和鎮(zhèn)靜等多種藥理活性作用[5-6]。另外，根據(jù)體內(nèi)外抗炎試驗表明，辣蓼主要成分中的黃酮類化合物可以通過抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)、脂氧化酶(LOXs)、誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)、核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)的活性，再通過激活Ⅱ期抗氧化解毒酶依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶(NQO1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)和核因子紅細胞2-相關(guān)因子2(Nrf2)的活性來發(fā)揮抗炎作用[7]。從意大利黑麥草(Loliummultiflorum)中分離出的黃酮類化合物同樣也能抑制MAPK和NF-κB的活性[8]。任守忠等[9]在研究辣蓼提取物對大鼠急性胃黏膜損傷的保護作用時，發(fā)現(xiàn)辣蓼提取物能增強胃黏膜損傷大鼠的抗氧化能力，表明辣蓼提取物具有清除氧自由基的生物活性。Peng等[10]對辣蓼黃酮進行了抗氧化能力測定，結(jié)果表明其具抗氧化活性。谷俐媛等[11]在研究辣蓼黃酮對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用試驗中，發(fā)現(xiàn)辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)和辣蓼黃酮正丁醇部位(FNB)均能減少LPS刺激所誘導(dǎo)的活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)的釋放，從而發(fā)揮抗炎特性。谷俐媛等[12]還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NB能夠減少LPS刺激所誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠模型中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等的釋放，同時，F(xiàn)EA則能夠減少炎性細胞因子TNF-α、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-2(IL-2)的mRNA表達，表明辣蓼黃酮可以減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥對小鼠的損傷。以上研究表明，PCV2的感染可誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激與炎癥的發(fā)生，且辣蓼黃酮具有良好的抗炎作用。

蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，參與和調(diào)控生命體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達和細胞周期等諸多生命過程，在生命體內(nèi)至少有30%的蛋白質(zhì)被磷酸化后，參與生命活動[13-14]。通過蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化，可以調(diào)節(jié)MAPK信號通路等多種Toll樣受體(TLR)依賴性信號分子的激活和失活，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15]。大量證據(jù)表明LPS通過激活NF-κB、MAPK和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路導(dǎo)致促炎介質(zhì)和細胞因子的過量產(chǎn)生[16-17]。PCV2感染通過激活NF-κB信號通路進而誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而NF-κB通路與MAPK通路密切相關(guān)[18-21]。FEA具有抗病毒活性，由此推測，F(xiàn)EA可能通過減少炎癥因子的產(chǎn)生并抑制p38 MAPK和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2蛋白磷酸化而調(diào)節(jié)PCV2誘導(dǎo)的豬肺泡巨噬細胞(3D4/2細胞)的炎癥反應(yīng)。

本研究用PCV2體外感染3D4/2細胞，建立病毒感染的炎癥模型，觀察FEA對細胞內(nèi)炎性因子的影響，并觀察在FEA作用后MAPK通路和ERK1/2通路上的關(guān)鍵蛋白磷酸化表達是否得到抑制，進而闡明FEA的抗炎作用及其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 FEA的制備和試劑

FEA純度為56.53%，經(jīng)XDA-8大孔吸附樹脂分離純化后，得到淡黃色粉末物質(zhì)，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室制備。胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；豬IL-6、白細胞介素-10(IL-10)、IFN-γ、環(huán)氧合酶-1(COX-1)、COX-2的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自江蘇晶美公司；LPS購自美國Sigma公司；蘆丁對照品購自北京索萊寶公司；Trizol總RNA提取試劑、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和預(yù)冷RIPA裂解緩沖液購自北京康維世紀公司生物公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物公司；Chemiluminescent HRT Substrate超敏發(fā)光顯色液購自美國millipor公司；BCA購自上海Biotech公司；一抗β-肌動蛋白(β-actin)、p38 MAPK、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、ERK1/2、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(pERK1/2)和二抗均購自美國CST公司。

1.2 病毒和細胞

PCV2：SH株，為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病診斷與免疫實驗室分離保存(GenBank登錄號：AY686763)，經(jīng)豬腎細胞(PK-15細胞)增殖后測得病毒滴度為10-2半數(shù)組織細胞感染量(TCID50)/mL。3D4/2細胞由廣西大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室惠贈，經(jīng)廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)藥理實驗室培養(yǎng)凍存。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置7個組，分別為空白對照組、PCV2感染組、LPS陽性對照組、蘆丁陽性對照組和FEA藥物組(25、50和100 μg/mL)，每組4個重復(fù)。LPS溶于10% FBS-DMEM培養(yǎng)液(終濃度為0.1%)。蘆丁溶于二甲基亞砜(DMSO)后加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液(DMSO終濃度小于0.1%)。FEA溶于DMSO后加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液(DMSO終濃度小于0.1%)。調(diào)整3D4/2細胞濃度至1×106個/mL，均勻接種在6孔細胞培養(yǎng)板上，2 mL/孔，空白對照組加入2 mL無血清DMEM，LPS陽性對照組加入2 mL濃度為1 μg/mL的LPS，PCV2感染組加入2 mL PCV2病毒液(10-2TCID50/mL)；PCV2接種2 h后，蘆丁陽性對照組加入2 mL的40 μg/mL蘆丁，各FEA組分別加入2 mL的25、50和100 μg/mL FEA。37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)8 h。

1.4 PCV2的增殖和鑒定

復(fù)蘇并傳代PK-15細胞，并使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待其長成單層細胞后，調(diào)整PK-15細胞濃度至1×105個/mL，100 μL/孔均勻接種至96孔細胞培養(yǎng)板。接種PCV2毒液，吸附2 h后，吸棄病毒液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次。而后加入5% FBS的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。而后，收獲細胞毒液，并反復(fù)凍融3次后，5 000 r/min離心5 min，收集上清液，分裝至1.5 mL的EP管中備用。

采用PCR檢測病毒核酸，首先根據(jù)GenBank設(shè)計PCV2引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成(F：5′-CACTTCTTTCGTTTTCAG-3′；R：5′-TTTATCACTTCGTAATGGT-3′)(GenBank登錄號：MT376724.1)，然后按照北京康維世紀生物公司的DNA提取試劑盒說明書(CW0548)操作。抽提病毒DNA后進行PCR擴增，擴增體系為：無菌水8.5 μL；2×Mix酶12.5 μL；引物1(P1)1 μL；引物2(P2)1 μL；DNA 2 μL；總體系為25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 40 s；55.5 ℃ 40 s；72 ℃ 40 s，進行30個循環(huán)，94 ℃延伸7 min。最終PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察擴增片段的大小。

1.5 CCK8法檢測3D4/2細胞活力

將3D4/2細胞濃度調(diào)整至1×105個/mL，每孔100 μL接種至96孔板中培養(yǎng)過夜。次日，吸棄細胞培養(yǎng)上清液，PBS洗滌細胞3次后，各FEA組分別加入200 μL的25、50、100、200、400和800 μg/mL的FEA，空白對照組加入200 μL的10% FBS的DMEM。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的CCK8溶液，并將96孔細胞培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h，避光取出96孔板，并在450 nm處檢測其吸光度(OD)值，細胞活力計算公式如下：

細胞活力=(試驗組OD-空白對照組OD)/
(對照組OD-空白對照組OD)。

1.6 ELISA檢測炎性因子及相關(guān)酶活性

按照1.3進行分組與處理，而后使用ELISA試劑盒，按照操作說明書測定IFN-γ、IL-6、IL-10等炎性細胞因子含量及COX-1和COX-2活性。

1.7 定量PCR(q-PCR)檢測mRNA的表達

按照1.3進行分組與處理，調(diào)整3D4/2細胞濃度至1×106個/mL，將細胞接種于6孔板中，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于q-PCR檢測相關(guān)基因的表達。COX-2、IL-6、IL-10、c-fos、c-jun、c-myc、p38MAPK、ERK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等基因的引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達水平。

表1 基因序列

1.8 Western Blotting檢測蛋白表達水平

按照1.3進行分組與處理，調(diào)整3D4/2細胞濃度至1×106個/mL，將細胞接種于6孔板中，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。提取總蛋白后，根據(jù)BCA蛋白濃度測定說明書測定蛋白濃度，并用Western Blotting檢測蛋白表達水平。操作方法同其他研究[18,22-24]，簡述如下：蛋白質(zhì)經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，在4 ℃下用5% BSA封閉緩沖液封閉1.5 h，用5%脫脂奶粉以1∶1 000倍稀釋p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、pERK1/2和β-actin抗體，并在4 ℃下孵育過夜，1×TBST洗滌3次后，將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜與二抗在37 ℃下共孵育1.5 h，1×TBST洗滌3次后，使用ChemiluminescentHRT Substrate超敏發(fā)光顯色液對PVDF膜進行避光顯色。使用蛋白成像儀觀察蛋白條帶。各蛋白表達用β-actin進行標準化，以評估蛋白條帶的相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2的增殖和鑒定

將PCV2接種于PK-15細胞中，培養(yǎng)48 h，收集病毒，提取病毒DNA，采用q-PCR檢測病毒核酸，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖1顯示目標片段的擴增量約為107 bp。

C為未感染PCV2的PK-15細胞；1～5分別為PK-15細胞感染后4、8、12、24、48 h；6為陽性對照；M為DNA Marker。

2.2 FEA對3D4/2細胞的細胞活力的影響

如表2所示，與空白對照組相比，200、400和800 μg/mL的FEA作用于3D4/2細胞后，細胞活力極顯著降低(P<0.01)；而25、50和100 μg/mL的FEA作用于3D4/2細胞后，細胞活力無顯著差異(P>0.05)。因此，選擇25、50和100 μg/mL的FEA作為后續(xù)試驗的用藥濃度。

表2 FEA對3D4/2細胞的細胞活力的影響

2.3 FEA對PCV2感染3D4/2細胞的炎癥細胞因子水平和相關(guān)酶的活性的影響

如圖2-A、圖2-B、圖2-C所示，與空白對照組相比，PCV2感染后，PCV2感染組的IL-6、IL-10和IFN-γ含量升高(P>0.05)；與PCV2感染組相比，F(xiàn)EA處理后，25、50和100 μg/mL FEA藥物組的IL-6、IL-10和IFN-γ含量顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。如圖2-D、圖2-E所示，與空白對照組相比，PCV2感染后，PCV2感染組的COX-1和COX-2活性顯著升高(P<0.05)；與PCV2感染組相比，F(xiàn)EA處理后，25和100 μg/mL FEA藥物組的COX-1和COX-2活性顯著降低(P<0.05)。

Control：空白對照組；PCV2：PCV2感染組；LPS：LPS陽性對照組；Rutin：蘆丁陽性對照組；FEA25：25 μg/mL FEA藥物組；FEA50：50 μg/mL FEA藥物組；FEA100：100 μg/mL FEA藥物組。*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；#表示與PCV2感染組相比差異顯著(P<0.0 5)，##表示與PCV2感染組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同，

2.4 FEA對PCV2感染3D4/2細胞IL-6、IL-10、COX-2、c-fos、c-jun、c-myc、p38 MAPK和ERK的mRNA相對表達水平的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，PCV2感染后，PCV2感染組的IL-6、IL-10、COX-2和c-fos的mRNA相對表達水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與PCV2感染組相比，F(xiàn)EA處理后，25、50和100 μg/mL FEA藥物組的IL-6、IL-10、COX-2和c-fos的mRNA相對表達水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。其中，25 μg/mL的FEA作用效果最佳。

圖3 FEA對PCV2感染3D4/2細胞IL-6、IL-10、COX-2和c-fos mRNA相對表達水平的影響

如圖4所示，與對照組相比，PCV2感染后，PCV2感染組的c-jun、c-myc、MAPK和ERK的mRNA相對表達水平均顯著升高(P<0.05)。與PCV2感染組相比，F(xiàn)EA處理后，25和100 μg/mL FEA藥物組的c-jun、c-myc、MAPK和ERK的mRNA相對表達水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。其中，25 μg/mL的FEA作用效果最佳。

圖4 FEA對PCV2感染3D4/2細胞c-jun、c-myc、MAPK和ERK mRNA相對表達水平的影響

2.5 FEA對PCV2感染3D4/2細胞中p38 MAPK和ERK1/2通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用

如圖5所示，與對照組相比，PCV2感染后，p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白相對表達水平均極顯著升高(P<0.01)。與PCV2感染組相比，F(xiàn)EA處理后，25、50和100 μg/mL FEA藥物組的p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)的蛋白相對表達水平均極顯著降低(P<0.01)。其中，25和100 μg/mL的FEA作用效果最佳。

圖5 FEA對PCV2感染的3D4/2細胞中p38 MAPK、ERK1/2蛋白相對表達水平的影響

3 討 論

PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的主要致病因子[25]。PCV2感染巨噬細胞將促進炎性因子的表達，當病毒侵入宿主細胞后，免疫細胞釋放的細胞因子和趨化因子是消除入侵病原體的必要因素[26]。但炎癥介質(zhì)的過度釋放同樣也不利于機體抵抗病毒感染[27]。研究表明，在多種炎癥的刺激下，COX會誘導(dǎo)花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和COX-2，而COX-2的過度表達會促進炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)[28]。巨噬細胞在由炎癥引發(fā)的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[29]。IL-10是一種具有抗炎和免疫抑制作用的細胞因子，由巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞和B細胞分泌，主要在晚期免疫效應(yīng)階段產(chǎn)生[30]。IL-10的產(chǎn)生將抑制其他促炎細胞因子的產(chǎn)生，如白細胞介素-1(IL-1)、IL-2、IFN-γ和TNF-α等[6]。此外，Borghetti等[31]研究表明，PCV2感染的早期階段，TNF-α、IL-8和IL-1β的基因表達增加，證明了在PCV2感染的早期階段，炎癥反應(yīng)更加迅速。此外，Sipos等[32]研究發(fā)現(xiàn)，PDNS豬外周血單核細胞中IFN-γ和IL-6的mRNA表達上調(diào)。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染的3D4/2細胞中，IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表達水平增加，進而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。在本試驗中，PCV2感染3D4/2細胞后，IL-6、IL-10和IFN-γ含量呈上升的趨勢，但與空白對照組相比無顯著差異，其可能的原因是，細胞炎性因子的分泌水平較基因的表達而言相對滯后，因此在取細胞上清液進行測定時，尚未得出差異顯著的結(jié)果。另外，PCV2感染3D4/2細胞使得COX-1和COX-2活性顯著增加。這與前人的研究結(jié)果相類似。而FEA處理后，可使得IL-6、IL-10、IFN-γ含量和COX-1、COX-2活性顯著減少，說明FEA能有效調(diào)節(jié)PCV2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并抵抗病毒感染。

黃酮類化合物因其具有抗炎和抗氧化等生物活性，成為了科學(xué)研究領(lǐng)域值得探索的藥物。Hsieh等[34]研究表明，人參皂苷Rh2(GRh2)可減少促炎因子TNF-α、一氧化氮(NO)和IL-1β的產(chǎn)生，并促進肺臟組織中白細胞介素-4(IL-4)、IL-6和IL-10的產(chǎn)生。此外，GRh2還會抑制核因子-κB抑制蛋白(IκB-α)、ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Raf-1)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)、一氧化氮合成酶(iNOS)和COX-2的蛋白表達水平。還有相關(guān)研究表明，黃酮類化合物可減少各種炎性細胞因子或趨化因子的表達。例如，在LPS誘導(dǎo)的人血單核細胞中，染料木黃酮會減弱細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[35]。病毒的感染通常伴隨著炎癥的發(fā)生，病毒感染誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥因子，在此過程中NF-κB被激活，一方面其通過分泌抗病毒細胞因子如IFN-γ等發(fā)揮抗病毒作用，另一方面NF-κB通過激活ERK1/2、p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)促炎介質(zhì)和細胞因子的過量產(chǎn)生[16,20]。研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染也同樣通過以上通路參與炎癥反應(yīng)[19-21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PCV2感染3D4/2細胞后，炎癥因子IL-6、IL-10、COX-1和p38MAPK和ERK1/2 mRNA相對表達水平升高，F(xiàn)EA處理后，p38MAPK和ERK1/2 mRNA相對表達水平下降。這表明FEA可通過p38 MAPK和ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這與上述的研究報道結(jié)果一致。另外，F(xiàn)EA也降低了PCV2感染3D4/2細胞中COX-2、IL-10和IL-6的mRNA相對表達水平，其中25 μg/mL的濃度效果最好。這些結(jié)果說明，F(xiàn)EA通過下調(diào)炎癥相關(guān)mRNA的表達抵抗病毒感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

c-fos、c-jun、c-myc為原癌基因家族早期基因，大量研究表明原癌基因參與了各種不同的細胞過程，如增殖、分化和凋亡[36]。c-myc編碼一種核磷蛋白和一種轉(zhuǎn)錄因子。此外，c-fos和c-jun所編碼的蛋白還可構(gòu)成二聚體活性蛋白-1(activation protein-1，AP-1)，而AP-1是一種核轉(zhuǎn)錄活化因子，已被證實在各種炎癥蛋白的表達中起著關(guān)鍵作用。另外，AP-1還參與了炎性信號的調(diào)控[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染3D4/2細胞后，原癌基因c-fos、c-jun和c-myc的mRNA相對表達水平增加。不僅如此，炎癥細胞因子IL-6、IL-10和COX-2的mRNA相對表達水平也增加，這表明原癌基因的表達與炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。25～100 μg/mL的FEA可顯著降低PCV2感染3D4/2細胞中的c-fos、c-jun和c-myc的mRNA相對表達水平，表明FEA可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄起始水平來抑制炎性因子的釋放。

蛋白質(zhì)磷酸化是真核生物中關(guān)鍵的可逆翻譯后修飾方式，蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，參與調(diào)控諸多生命過程，如免疫應(yīng)激、基因表達、細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在生命體內(nèi)至少有30%的蛋白被磷酸化修飾后參與生命活動[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染3D4/2細胞后，p38 MAPK和ERK1/2的蛋白磷酸化水平顯著增加，而FEA處理顯著抑制了ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化，這與基因表達的結(jié)果一致。這表明FEA可能通過抑制MAPK和ERK1/2信號通路來減少PCV2感染3D4/2細胞的炎癥反應(yīng)。綜上所述，F(xiàn)EA可通過抑制MAPK和ERK1/2信號通路的相關(guān)蛋白磷酸化發(fā)揮抗炎作用，可作為一種潛在的有效藥物以防治病毒誘導(dǎo)的炎癥性疾病。

4 結(jié) 論

FEA通過抑制p38 MAPK和ERK1/2通路的關(guān)鍵蛋白的磷酸化，減少相關(guān)炎癥細胞因子的分泌，降低相關(guān)炎癥細胞因子的mRNA相對表達水平，而保護3D4/2細胞受PCV2誘導(dǎo)的炎癥損傷。此外，25 μg/mL的FEA為適宜的作用劑量。