毛愛鵬 孫皓然 周 寧 郭肖蘭 南韋肖 李夢(mèng)杰 陳 淼 張海華 徐 超*

(1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，秦皇島066004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

犬是人們生活中常見的伴侶動(dòng)物，與人類有著共同的生活環(huán)境，甚至相似的飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣[1]。益生菌、益生元和合生元等作為寵物功能性食品添加劑使用，不僅可滿足寵物的基本營養(yǎng)需求，還可為不同生命階段或特定生理、病理狀態(tài)下的寵物提供營養(yǎng)需要[2]。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)屬于革蘭氏陽性菌，具有降低膽固醇[3]及抵抗致病菌等作用[4]，可促進(jìn)幼犬的生長發(fā)育[5]。研究表明，嗜酸乳桿菌活菌體和熱滅活菌體均能很好地抑制大腸桿菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的黏附和入侵[6]；在無抗飼糧中添加嗜酸乳桿菌菌體及其代謝產(chǎn)物可顯著提高斷奶仔豬的生長性能，并改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[7]?；罹置诨蚣?xì)菌裂解后可產(chǎn)生多糖、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等活性物質(zhì)，無活力的微生物細(xì)胞、細(xì)菌裂解物或無細(xì)菌提取物具有降低膽固醇、抗炎、抗高血壓和抗氧化等作用[8-9]。無細(xì)胞上清液(cell free supernatant，CFS)中含有微生物生長產(chǎn)生的代謝物和培養(yǎng)基中剩余的營養(yǎng)物質(zhì)，來自乳酸菌的CFS因含有機(jī)酸、脂肪酸和蛋白質(zhì)等化合物而具有抗菌活性[10]。嗜酸乳桿菌ATCC 4356及其CFS均可抑制空腸彎曲桿菌的生長，并能夠減少空腸彎曲桿菌菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附和侵襲[11]。與干酪乳桿菌相比，嗜酸乳桿菌CFS表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌和生物膜消除作用，對(duì)常見的腸道致病菌(致病性大腸埃希菌、傷寒沙門菌和痢疾志賀菌)及其L型菌均有不同程度的抑制作用[12]，適用于控制食源性致病菌的生長[13]。

由此可知，嗜酸乳桿菌菌體及其代謝產(chǎn)物中存在多種活性物質(zhì)，且在菌株滅活后，無生命的菌體及其組成成分、代謝產(chǎn)物等仍具有一定的生物活性[14-15]，可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等致病菌的生長，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及功能性食品中[16-17]。本研究基于以往的相關(guān)報(bào)道，將實(shí)驗(yàn)室從藍(lán)狐腸道中分離且具有優(yōu)良體外益生潛能的嗜酸乳桿菌菌株ZJBF003[18]經(jīng)離心過濾后，分為菌體、上清液及未離心的菌液3種不同的成分，通過探討嗜酸乳桿菌不同成分對(duì)幼年期中華田園犬體重變化、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)以及糞便短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)含量的影響，旨在比較嗜酸乳桿菌不同成分對(duì)中華田園犬營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的異同，并為其在寵物飼糧中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取24只4～6月齡健康的中華田園犬，初始體重為(4.80±0.91) kg，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只，公母比例相同，單籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物在試驗(yàn)前注射犬用四聯(lián)疫苗，并根據(jù)糞便檢查和體質(zhì)情況進(jìn)行驅(qū)蟲。試驗(yàn)犬每天飼喂2次基礎(chǔ)飼糧，自由飲水，飼喂后4組犬分別經(jīng)口灌服等體積生理鹽水(Ⅰ組，對(duì)照組)、嗜酸乳桿菌菌體(Ⅱ組)、嗜酸乳桿菌CFS(Ⅲ組)和嗜酸乳桿菌菌液(Ⅳ組)。菌液的處理參照文獻(xiàn)[19]，經(jīng)平板計(jì)數(shù)確定菌液活菌數(shù)量為1×108CFU/mL，添加劑量為2×108CFU/d。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期3 d，正試期28 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)儀器

沛歐全自動(dòng)凱氏定氮儀，全自動(dòng)生化分析儀(日立7020，日本)，氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)

1.3 樣品采集

正試期第20天，通過全收糞法收集連續(xù)4 d的糞便樣本，噴灑10%的硫酸進(jìn)行固氮，混合均勻并烘干至恒重，粉碎過40目篩，用于各營養(yǎng)成分的檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用一次性負(fù)壓采血管(分離膠促凝劑)空腹采集血液10 mL，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)。無菌采集新鮮糞便，用于SCFA含量的測(cè)定。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 體重

正試期第1、7、14、21和28天早晨空腹稱量動(dòng)物體重，并計(jì)算平均日增重(average daily weight，ADG)、增重率(weight gain rate，WGR)和總增重(total weight gain，TWG)。

1.4.2 飼糧和糞樣中營養(yǎng)物質(zhì)含量

分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 6438—2007、GB/T 6432—2018和GB/T 6433—2006測(cè)定飼糧和糞樣中干物質(zhì)(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白質(zhì)(CP)和粗脂肪(EE)含量。采用以下公式計(jì)算碳水化合物含量和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率：

碳水化合物含量(%)=干物質(zhì)含量-粗蛋白質(zhì)
含量-粗脂肪含量-粗灰分含量；
營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(營養(yǎng)物質(zhì)
攝入量-糞樣中營養(yǎng)物質(zhì)排出量)/
營養(yǎng)物質(zhì)攝入量。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性等指標(biāo)的檢測(cè)試劑盒均采購于中生北控生物科技股份有限公司。

1.4.4 糞便SCFA含量

在5 mL離心管中加入0.1 g糞便和3 mL超純水，冰中靜置6 h后，低溫高速離心，取上清液按照5∶1(體積比)加入含有內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸的25%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))偏磷酸溶液，冰中靜置30 min后離心，過0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。采用氣相色譜法(Agilent 7890A氣相色譜儀，美國)測(cè)定糞便中SCFA含量。色譜柱為30 m×0.32 mm×0.32 μm，載氣為高純氮?dú)?，載氣流量為2.2 mL/min，進(jìn)樣口為250 ℃。程序升溫條件為：初始溫度為60 ℃，10 ℃/min升溫到170 ℃，8 ℃/min升溫到212 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019整理后，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬體重的影響

由表2可知，與Ⅰ組(對(duì)照組)相比，試驗(yàn)組(Ⅱ～Ⅳ組)第7、14、21和28天的體重均無顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)組ADG和TWG均高于對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)，其中Ⅲ組ADG、WGR和TWG最高，表明嗜酸乳桿菌CFS有提高中華田園犬體增重的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬體重的影響

2.2 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ～Ⅳ組干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和碳水化合物的表觀消化率均無顯著差異(P>0.05)，其中Ⅲ組干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和碳水化合物表觀消化率均最低，但與其余3組相比，差異均不顯著(P>0.05)；Ⅱ組粗脂肪表觀消化率顯著低于其他3組(P<0.05)，且其他3組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，Ⅲ組血清TP含量顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅲ組血清ALB含量最高，但與其他組相比，差異不顯著(P>0.05)；Ⅲ組血清TG含量顯著高于其他各組(P<0.05)，表明嗜酸乳桿菌CFS可顯著提高中華田園犬血清TP和TG含量。Ⅳ組血清CHO和LDL-C含量顯著低于其他各組(P<0.05)，表明嗜酸乳桿菌菌液可顯著降低中華田園犬血清CHO和LDL-C含量。各組血清ALB、HDL-C含量以及ALT、AST活性之間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬血清生化指標(biāo)的影響

2.4 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬糞便SCFA含量的影響

由表5可知，與Ⅰ組相比，Ⅲ組糞便中乙酸含量顯著提高(P<0.05)，且Ⅱ組和Ⅲ組糞便中乙酸含量顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，表明嗜酸乳桿菌CFS可顯著提高中華田園犬糞便中乙酸含量。與Ⅰ組相比，Ⅲ組和Ⅳ組糞便中丁酸和異戊酸含量均顯著降低(P<0.05)，表明嗜酸乳桿菌CFS和菌液均可降低中華田園犬糞便中丁酸和異戊酸含量。各組糞便中丙酸和異丁酸含量之間均無顯著差異(P>0.05)。

表5 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬糞便SCFA含量的影響

3 討 論

3.1 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬體重的影響

益生菌不僅可以增強(qiáng)腸道消化酶活性，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而提高幼犬的ADG[20-21]；還可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群影響動(dòng)物的體重變化，這與菌株的不同、益生菌劑量和干預(yù)時(shí)間不同有關(guān)[22]。本研究中，嗜酸乳桿菌不同分離成分對(duì)中華田園犬各階段的體重并無顯著影響，其中Ⅲ組的ADG、WGR和TWG均較對(duì)照組有所提高，但差異不顯著。其可能是由于嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)腸道pH改變較小，消化酶未能充分分解腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)；也可能是本研究中試驗(yàn)動(dòng)物遺傳及生理上存在較大差異，未能表現(xiàn)出顯著差異，從ADG、WGR和TWG等的結(jié)果表明，Ⅲ組的體重增幅最高，這表明嗜酸乳桿菌CFS對(duì)中華田園犬的體增重有一定的影響。

3.2 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率通過測(cè)定機(jī)體攝入和排出營養(yǎng)物質(zhì)的差異，可反映飼糧養(yǎng)分的可消化性及動(dòng)物對(duì)飼糧養(yǎng)分的消化能力。本試驗(yàn)中，在幼犬進(jìn)食后，經(jīng)口灌服的嗜酸乳桿菌菌體及其代謝產(chǎn)物對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和碳水化合物的表觀消化率均無顯著影響，但嗜酸乳桿菌菌體組(Ⅱ組)粗脂肪表觀消化率顯著低于其余各組，嗜酸乳桿菌CFS組(Ⅲ組)的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和碳水化合物表觀消化率最低。研究表明，在犬飼糧中添加有活性的嗜酸乳桿菌對(duì)干物質(zhì)、有機(jī)物和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率均無顯著影響[23]，單獨(dú)添加無活性的嗜酸乳桿菌對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率也無顯著影響[24]。結(jié)腸中SCFA含量的升高會(huì)刺激不同器官和組織部位的大量激素和神經(jīng)信號(hào)，從而累積抑制短期食欲和能量的攝入，乙酸可直接調(diào)節(jié)食欲中樞，丙酸可通過刺激肝臟迷走神經(jīng)抑制進(jìn)食行為[25]，而動(dòng)物體重下降及脂肪含量的減少與產(chǎn)生SCFA的腸道菌群結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系[26]。本研究中，嗜酸乳桿菌菌體和CFS組營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的降低可能與腸道中產(chǎn)生SCFA的微生物相關(guān)。

3.3 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)不僅可以反映血液系統(tǒng)本身的狀態(tài)，還可以揭示機(jī)體各組織器官潛在的生理變化。研究表明，連續(xù)14 d以不同劑量飼喂犬源發(fā)酵乳桿菌CCM7421可導(dǎo)致血紅蛋白和TP含量升高，ALT活性下降，但與益生菌的劑量或持續(xù)時(shí)間無關(guān)[27]。本研究中，在犬采食后，經(jīng)口灌服1×108CFU/mL的嗜酸乳桿菌28 d，結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌CFS可顯著提高幼犬血清中TP和TG含量，嗜酸乳桿菌菌液可顯著降低血清CHO和LDL-C含量。TP是機(jī)體主要的蛋白質(zhì)來源，可在一定程度上反映機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，血液系統(tǒng)中TP和ALB含量升高，表明嗜酸乳桿菌CFS可有效促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收。TG是機(jī)體儲(chǔ)量最大和產(chǎn)能最多的能源物質(zhì)，食物中的脂肪在膽汁酸和酯酶的作用下被腸黏膜吸收，并在黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)合成TG，肝臟來源的極低密度脂蛋白和腸道來源的乳糜微?？尚纬筛缓琓G的脂蛋白(triglycerides lipoprotein，TGL)[28]，CHO和TG可反映機(jī)體脂質(zhì)代謝狀況，是決定血脂水平的重要因素。本研究中，嗜酸乳桿菌菌液可顯著降低血清中CHO和LDL-C的含量，這與其他關(guān)于嗜酸乳桿菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體的研究結(jié)果[29-32]一致。CHO和LDL-C含量的降低可有效促進(jìn)機(jī)體脂質(zhì)代謝，可能是由于乳酸菌通過吸收、共沉淀和酶解轉(zhuǎn)化等途徑降低CHO的含量[33]，也可能是由于乳酸菌通過調(diào)控機(jī)體的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶及膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)的合成和表達(dá)、降低重吸收等方式降低機(jī)體CHO含量[34]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)中華田園犬糞便SCFA含量的影響

腸道微生物是消化系統(tǒng)的重要組成部分，在結(jié)腸近端，微生物可將復(fù)雜的碳水化合物、蛋白質(zhì)及部分脂肪代謝為SCFA等物質(zhì)[35]。SCFA不僅可直接激活G蛋白偶聯(lián)受體，抑制組蛋白去乙?；竅36-37]，還可供給結(jié)腸細(xì)胞高達(dá)70%的能量需求[38]，在維持結(jié)腸細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)和保護(hù)結(jié)腸細(xì)胞免受外界傷害方面發(fā)揮重要作用[39]，進(jìn)而影響宿主的生理機(jī)能[40]。

當(dāng)腸道中的內(nèi)容物向結(jié)腸遠(yuǎn)端蠕動(dòng)時(shí)，SCFA會(huì)迅速被結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收，只有不到10%會(huì)隨糞便排出體外[41-42]。本研究結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌CFS顯著提高了犬糞便中的乙酸含量，并降低了糞便中丁酸和異戊酸的含量；嗜酸乳桿菌菌液也可顯著降低糞便中丁酸和異戊酸的含量。有研究表明，SCFA含量的提高可顯著降低饑餓素含量，本研究中嗜酸乳桿菌CFS組體重增加不顯著，可能是由于糞便中乙酸含量提高，導(dǎo)致血漿中饑餓素含量降低引起[43]。丁酸是腸道上皮細(xì)胞的重要能量來源，可抑制核因子-κB(NF-κB)的活化和組蛋白去乙?；谝种颇c炎、結(jié)腸癌和改善結(jié)腸防御屏障功能等多方面被廣泛研究[44-45]。與熱滅活的嗜酸乳桿菌及其上清液相比，有活性的嗜酸乳桿菌可顯著提高結(jié)腸炎大鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量，從而改善腸道屏障功能[46]。本研究中，單獨(dú)添加嗜酸乳桿菌分離成分對(duì)犬腸道健康的影響較小，嗜酸乳桿菌CFS及菌液通過調(diào)節(jié)腸道中SCFA比例，對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)的消化吸收及脂質(zhì)代謝有一定的促進(jìn)作用，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

① 嗜酸乳桿菌CFS可增強(qiáng)中華田園犬機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，這與其對(duì)體增重的影響具有一致性，但與其對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和碳水化合物表觀消化率的影響并不一致。

② 嗜酸乳桿菌菌液可有效促進(jìn)中華田園犬機(jī)體脂質(zhì)代謝，有助于降低血脂水平。