周東來(lái) 劉 凡 汪福保 李慶榮 鄺哲師 邢東旭 鄒宇曉 劉振興 楊 瓊* 廖森泰*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣州510610；2.佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司，佛山528211；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州510640)

鱖魚(Sinipercachuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)真鱸科(Percichthyidae)鱖屬(Siniperca)，俗稱桂花魚，是我國(guó)久負(fù)盛名的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。鱖魚因肉質(zhì)鮮美、無(wú)肌間刺以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。自20世紀(jì)70年代鱖魚人工繁殖技術(shù)取得突破后，鱖魚人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，《2022中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)顯示，2021年我國(guó)的鱖魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到37.4萬(wàn)t，產(chǎn)值超過(guò)200億元[2]。鱖魚為肉食性魚類，以攝食活餌料魚為主，隨著鱖魚攝食機(jī)理和配合飼料馴化技術(shù)的進(jìn)步，目前已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了鱖魚人工配合飼料養(yǎng)殖[3-4]。在人工配合飼料養(yǎng)殖過(guò)程中，脂肪肝和腸道損傷是影響鱖魚成活率的主要隱性威脅[5]。而且，鱖魚在養(yǎng)殖過(guò)程中因病害頻發(fā)、成活率較低而大量使用漁藥和抗生素，這也會(huì)嚴(yán)重影響鱖魚的質(zhì)量安全。因此，篩選能夠促進(jìn)鱖魚生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力、提高抗氧化能力和保護(hù)肝腸功能的適宜飼料添加劑是促進(jìn)鱖魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。

桑樹(shù)(MorusalbaL.)在我國(guó)種植歷史悠久，而桑葉也被廣泛用作食品和中草藥原料[6-7]。桑葉中富含多糖、黃酮類、生物堿、多酚等多種天然活性物質(zhì)[6,8]。研究表明，桑葉具有降血糖[9]、降血脂[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]和抗炎[14]等多種功能。桑葉提取物(mulberry leaf extract,MLE)一般是由曬干粉碎后的桑葉粉經(jīng)過(guò)正丁醇、乙醇和水等溶劑經(jīng)過(guò)加熱提取后得到的混合物[15]，含有大量的多糖類、黃酮類、生物堿類等生物活性物質(zhì)[13]。目前對(duì)桑葉及其提取物進(jìn)行了廣泛的研究，主要集中在提取工藝[6]、藥理活性[16]、臨床應(yīng)用[17]、營(yíng)養(yǎng)和功能成分[6]、飼料蛋白質(zhì)源替代[18]等方面，但其作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究較少。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加MLE可改善大鯢的生長(zhǎng)性能，提高飼料利用率，改善腸道和肝臟的抗氧化能力。另外，王詠梅等[20-21]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加桑葉黃酮對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和體成分沒(méi)有顯著性影響，但可提高凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力，促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦腸道發(fā)育，增加腸道菌群多樣性。此外，飼料中添加桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響，但能夠改善吉富羅非魚的血清和肝臟抗氧化指標(biāo)，提高抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力[22]。目前，鮮見(jiàn)使用MLE作為飼料添加劑研究其對(duì)鱖魚生長(zhǎng)性能、免疫功能及肝腸功能影響的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究3種不同MLE添加水平對(duì)鱖魚生長(zhǎng)性能、抗氧化功能、血清免疫指標(biāo)、肝臟和腸道組織形態(tài)的影響，為MLE在鱖魚配合飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MLE的制備工藝及主要活性成分含量測(cè)定

首先進(jìn)行桑葉樣品預(yù)處理。將采摘的新鮮桑葉洗凈、曬干后粉碎，過(guò)60目篩網(wǎng)。將桑葉樣品粉末裝入燒瓶中，加入20倍體積的石油醚，放置過(guò)夜，然后采用60 ℃水浴回流處理2 h，過(guò)濾，留濾渣風(fēng)干、備用。桑葉提取物提取步驟如下：稱取一定量的預(yù)處理過(guò)的桑葉粉，置于燒瓶中，加入30倍體積75%乙醇溶液，40 ℃超聲輔助提取，每次提取30 min，重復(fù)3次。過(guò)濾，棄濾渣，將濾液合并，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，即得MLE粉末，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MLE中主要活性成分含量測(cè)定。參照文獻(xiàn)[23]中的苯酚-硫酸法和硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法分別測(cè)定桑葉多糖和桑葉黃酮的含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度(OD)490 nm為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=10.305x+0.011 6，R2=0.996 4，利用葡萄糖溶液質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葉多糖的含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以蘆丁溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D510 nm為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=5.667x+0.001，R2=0.999 9，利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葉黃酮的含量。桑葉多糖和桑葉黃酮的提取得率計(jì)算公式如下：

式中：me為MLE的質(zhì)量(g)；C為MLE中桑葉多糖或桑葉黃酮的含量(mg/g)；mp為桑葉粉的質(zhì)量(g)。

1.2 試驗(yàn)飼料

根據(jù)鱖魚的營(yíng)養(yǎng)需求，以魚粉、腸黏膜蛋白粉等為蛋白質(zhì)源，以魚油、豆油和大豆磷脂為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對(duì)照組)、1(MLE1組)、5(MLE5組)和10 g/kg(MLE10組)的MLE，配制成4種等氮等脂飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

膨化飼料制備方法如下：首先，按表1配比稱取各原料，然后將稱取后的各原料混合均勻，經(jīng)過(guò)超微粉碎機(jī)粉碎，使所有成分都能夠通過(guò)250 μm的篩網(wǎng)；再將混合均勻的原料移入調(diào)制解調(diào)器，通入102 ℃的水蒸氣調(diào)制8 min，然后在95 ℃的溫度下進(jìn)行擠壓膨化制粒；再在80 ℃條件下將飼料顆粒烘干，飼料冷卻后分裝并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用(飼料由佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司代加工)。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)所用鱖魚由佛山市三水區(qū)合洋水產(chǎn)有限公司提供，鱖魚苗經(jīng)過(guò)人工馴化后能夠正常采食人工配合飼料。鱖魚馴化的基本流程為：先投喂活餌待攝食正常后逐步過(guò)渡到投喂死的餌料魚，聚群搶食狀態(tài)良好后再過(guò)渡到投喂添加誘食劑的人工配合飼料，使鱖魚的味感和視覺(jué)逐漸適應(yīng)并最終完全適應(yīng)人工配合飼料。發(fā)現(xiàn)魚苗個(gè)體不均勻以及大魚吃小魚現(xiàn)象時(shí)要及時(shí)分篩，放苗密度根據(jù)魚的規(guī)格大小為1 000～2 000 尾/m3，整個(gè)馴食過(guò)程7～10 d。養(yǎng)殖試驗(yàn)在佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司養(yǎng)殖基地的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，養(yǎng)殖系統(tǒng)由12個(gè)養(yǎng)殖桶(有效體積為400 L)和1個(gè)生化過(guò)濾系統(tǒng)組成，養(yǎng)殖水源為經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒、曝氣處理后的自來(lái)水，養(yǎng)殖期間少量補(bǔ)充蒸發(fā)水和排污水。

選擇當(dāng)年培育馴化后的體質(zhì)健壯、大小均勻的鱖魚[體重為(42.35±0.07) g]540尾，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)45尾。正式試驗(yàn)前先用基礎(chǔ)飼料試養(yǎng)14 d，正式試驗(yàn)為期72 d，日投飼率為體質(zhì)量的2%～3%，每天08:30—09:00、16:00—16:30各投喂1次，將投喂后0.5 h內(nèi)未吃完的飼料撈出烘干后稱重，準(zhǔn)確記錄每次投喂后鱖魚采食量。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水溫為25～30 ℃。保證養(yǎng)殖水體中溶解氧濃度為6.0～8.5 mg/L，pH為7.2～8.0，氨氮濃度≤0.10 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度≤0.05 mg/L。

1.4 樣品采集與制備

養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)72 d，養(yǎng)殖72 d后采集樣品。采集樣品前，先對(duì)試驗(yàn)鱖魚禁食24 h，然后從每組隨機(jī)取15尾魚(每個(gè)桶5尾魚)，用MS-222進(jìn)行麻醉后，測(cè)量體長(zhǎng)、體重，然后將鱖魚進(jìn)行解剖，并分別測(cè)定內(nèi)臟、肝胰臟和腸道的重量。

每組隨機(jī)取9尾魚(每個(gè)桶3尾魚)，分離腸道，去除表面脂肪，分別取長(zhǎng)度約1 cm的中腸，用3%多聚甲醛固定液固定，用于石蠟組織切片；分離出肝臟，在相同部位切取約0.5 cm3的肝臟，用3%多聚甲醛固定液固定，用于石蠟組織切片。

每組隨機(jī)取9尾魚(每個(gè)桶3尾魚)，用注射器進(jìn)行尾部靜脈采血，將血液4 ℃靜置2 h，然后3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱，用于血清免疫指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)和酶活性測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)性能及形體指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[24]的試驗(yàn)方法，具體的計(jì)算公式如下：

增重率(weight gain rate,WGR,%)=
100×(Wt-W0)/W0；
肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=100×Wt/L3；
特定生長(zhǎng)率(specific growth rate,SGR,%/d)=
100×(lnWt-lnW0)/t；
臟體指數(shù)(viscera somatic index,VSI,%)=100×
Wv/Wt；
肝體指數(shù)(hepatopancreas somatic index,HSI,%)=
100×Wh/Wt；
腸體指數(shù)(viserosomatic index,VI,%)=100×
Wi/Wt；
飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=F/
(Wt-W0)；
成活率(survival rate,SR,%)=100×Nt/N0。

式中：Wt和W0分別為試驗(yàn)魚的終末體質(zhì)量(FBW)和初始體質(zhì)量(IBW)(g)；t為養(yǎng)殖試驗(yàn)天數(shù)(d)；F為飼料攝入量(g)；N0和Nt分別為試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)試驗(yàn)魚的尾數(shù)(尾)；L為魚體長(zhǎng)(cm)；Wv為內(nèi)臟重(g)；Wh為肝胰臟重(g)；Wi為腸道重(g)。

1.5.2 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

血清過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體的測(cè)定方法參照每個(gè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3 血清免疫指標(biāo)測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒對(duì)血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)含量及堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和溶菌酶(LZM)活性進(jìn)行測(cè)定，具體的測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.4 腸道、肝臟染色組織切片的制備及觀察

取上述用多聚甲醛溶液固定的腸道和肝臟組織，制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度為6 μm，用蘇木素-伊紅(HE)染色。利用全景切片數(shù)字掃描儀(PANNORAMIC-1000，3DHISTECH)對(duì)切片進(jìn)行掃描拍照，利用CaseViewer 2.2(3DHISTECH)軟件截取切片組織照片。截圖完成后使用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybemetics)分析軟件分別測(cè)量腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MLE主要活性成分及含量

由表2可知，利用75%乙醇溶液提取的MLE中主要活性成分為桑葉多糖和桑葉黃酮。其中，MLE中桑葉多糖的含量為513.44 mg/g，提取得率為15.57%；桑葉黃酮的含量為88.23 mg/g，提取得率為2.69%。

2.2 MLE對(duì)鱖魚生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，在飼料中添加1、5和10 g/kg的MLE對(duì)鱖魚的終末體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率、增重率、飼料系數(shù)和成活率都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，但隨著飼料中MLE添加水平的提高，鱖魚的成活率逐漸提高。

表2 MLE中的主要活性成分及含量

表3 MLE對(duì)鱖魚生長(zhǎng)性能的影響

2.3 MLE對(duì)鱖魚形體指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加1和5 g/kg的MLE對(duì)鱖魚的臟體指數(shù)、肝體指數(shù)、腸體指數(shù)和肥滿度都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；飼料中添加10 g/kg的MLE能顯著降低鱖魚臟體指數(shù)(P<0.05)，但對(duì)肝體指數(shù)、腸體指數(shù)和肥滿度都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。隨著飼料中MLE添加水平的提高，鱖魚的臟體指數(shù)逐漸降低，添加10 g/kg MLE時(shí)，臟體指數(shù)最低，并且顯著低于其他組(P<0.05)。

表4 MLE對(duì)鱖魚形體指標(biāo)的影響

2.4 MLE對(duì)鱖魚血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照相比，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著降低鱖魚血清AST和ALT的活性(P<0.05)，顯著提高TP的含量(P<0.05)，但對(duì)LYZ的活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；添加5 g/kg的MLE顯著降低鱖魚血清ALT和LYZ的活性(P<0.05)，顯著降低TP的含量(P<0.05)，但對(duì)AST的活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；添加10 g/kg的MLE顯著降低血清AST和LYZ的活性(P<0.05)，顯著降低TP的含量(P<0.05)，但對(duì)ALT的活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；此外，添加1、5和10 g/kg的MLE對(duì)血清AKP的活性和ALB的含量都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表5 MLE對(duì)鱖魚血清免疫指標(biāo)的影響

2.5 MLE對(duì)鱖魚血清抗氧化能力的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中MDA的含量和T-SOD的活性(P<0.05)，顯著降低鱖魚血清中T-AOC和GSH含量(P<0.05)；添加5 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中GSH含量(P<0.05)，顯著降低MDA的含量(P<0.05)，但對(duì)T-AOC和T-SOD的活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；添加10 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中GSH和MDA的含量(P<0.05)，但對(duì)T-AOC和T-SOD的活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；而飼料中分別添加1、5和10 g/kg的MLE對(duì)血清CAT的活性都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表6 MLE對(duì)鱖魚血清抗氧化能力的影響

2.6 MLE對(duì)鱖魚肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，對(duì)照組鱖魚腸道黏膜組織清晰，結(jié)構(gòu)完整，排列有序，無(wú)混亂、脫落的現(xiàn)象。隨著MLE添加水平升高，鱖魚腸道褶皺增多，絨毛高度增加，絨毛數(shù)量增加，腸道空腔率降低。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MLE的添加水平為10 g/kg時(shí)，絨毛高度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而各組之間絨毛寬度和肌層厚度無(wú)顯著差異(P>0.05)(表7)。

ML：肌層；D：腸絨毛；SM：黏膜下層；GC：杯狀細(xì)胞。

表7 MLE對(duì)鱖魚腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的影響

各組鱖魚肝臟組織切片如圖2所示，對(duì)照組肝細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞核和細(xì)胞膜界限清晰，但肝細(xì)胞有空泡化現(xiàn)象。而添加不同水平MLE后都能夠改善肝細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)正常，肝血竇、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)細(xì)胞質(zhì)空泡化和細(xì)胞核偏移聚集等現(xiàn)象，尤其是MLE添加水平為1 g/kg時(shí)。

V：細(xì)胞質(zhì)空泡化；HS：肝血竇；N：細(xì)胞核；C：細(xì)胞膜。

3 討 論

3.1 飼料中添加MLE對(duì)鱖魚生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

目前，MLE作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用較少，對(duì)生長(zhǎng)性能的研究結(jié)論也各不相同。王詠梅等[20]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加10～300 mg/kg的桑葉黃酮對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和體成分沒(méi)有顯著性影響。同樣，在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50～1 000 mg/kg的桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚的生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響[22]。然而，Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的MLE可改善大鯢的生長(zhǎng)性能，提高腸道消化吸收能力，終末體均重、增重率和特定生長(zhǎng)率隨著飼料MLE添加水平的增加而增加，達(dá)到9.0 g/kg后下降，不同MLE添加水平對(duì)于成活率沒(méi)有顯著影響。在鯽魚中的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加15～60 g/kg的MLE可顯著促進(jìn)鯽魚的生長(zhǎng)，最適的MLE添加水平為46.93 g/kg，超過(guò)101.06 g/kg后會(huì)抑制鯽魚的生長(zhǎng)[25]。也有研究表明，在飼料中添加少量的桑葉粉或發(fā)酵桑葉粉不影響動(dòng)物的生長(zhǎng)，但添加量過(guò)高會(huì)抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)，主要是由于桑葉粉中粗纖維含量較高，也存在很多抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[26-27]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，在飼料中添加1～10 g/kg的MLE對(duì)鱖魚的終末體均重、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)沒(méi)有顯著影響，這與在凡納濱對(duì)蝦[20]和吉富羅非魚[22]中的研究結(jié)論一致，說(shuō)明通過(guò)提取的方法可以有效保留桑葉中的活性物質(zhì)，同時(shí)去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，有利于桑葉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用。

3.2 飼料中添加MLE對(duì)鱖魚血清免疫指標(biāo)的影響

血清免疫指標(biāo)包括AST、ALT、AKP、LYZ、ALB和TP等。ALT和AST是存在于肝臟中的重要轉(zhuǎn)氨酶，當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí)，大量的ALT和AST會(huì)進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，因此，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是反映肝細(xì)胞受損傷程度的主要指標(biāo)[28]。Li等[19]在大鯢中研究發(fā)現(xiàn)，9 g/kg的MLE能夠降低血清AST和ALT的活性，但超過(guò)12 g/kg的MLE能夠顯著提高血清AST和ALT的活性。同樣，王詠梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，適宜水平的桑葉黃酮能降低血清ALT活性，但高濃度桑葉黃酮可能對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺造成負(fù)面影響。本研究中，飼料中添加1 g/kg的MLE能顯著降低血清AST和ALT的活性，添加5 g/kg的MLE顯著降低ALT的活性，添加10 g/kg的MLE顯著降低AST的活性。這說(shuō)明添加適宜水平的MLE確實(shí)能夠改善鱖魚肝臟健康。AKP廣泛存在于高等動(dòng)物的各個(gè)組織中，是生物體內(nèi)一種重要的代謝調(diào)控酶，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白(酶)的去磷酸化過(guò)程，在水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。飼料營(yíng)養(yǎng)成分組成的改變可直接影響動(dòng)物體內(nèi)AKP的活性[29]。本試驗(yàn)中，添加1、5和10 g/kg的MLE對(duì)血清AKP的活性都沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明添加MLE不影響鱖魚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。LYZ是魚類先天免疫的重要指標(biāo)之一，在機(jī)體中廣泛分布，是魚類血清中重要的殺菌劑，能夠分解革蘭氏陽(yáng)性菌，并與補(bǔ)體甚至一些革蘭氏陰性菌相結(jié)合，良好的LYZ活性有助于魚類抵抗水域中各種病原的侵襲[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1 g/kg的MLE對(duì)鱖魚血清LYZ的活性沒(méi)有顯著影響，但添加5和10 g/kg的MLE能夠顯著降低鱖魚血清LYZ的活性。血清TP包括ALB和球蛋白，ALB由肝臟合成，參與維持血漿膠體滲透壓，血清TP和ALB含量的高低是反映機(jī)體蛋白質(zhì)合成代謝強(qiáng)弱的重要標(biāo)志[31]。有研究表明，飼料中添加1 200 mg/kg的桑葉正己烷提取物、乙醇提取物、水提取物和粗提物均能顯著提高小鼠血清ALB和TP的含量[32]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1、5和10 g/kg的MLE對(duì)血清ALB的含量都沒(méi)有顯著影響，而添加1 g/kg的MLE能顯著提高鱖魚血清TP的含量，而添加5和10 g/kg的MLE顯著降低鱖魚血清TP的含量。這說(shuō)明低添加水平(1 g/kg)的MLE有助于提高鱖魚體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成效率。

3.3 飼料中添加MLE對(duì)鱖魚血清抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激在水產(chǎn)養(yǎng)殖中十分常見(jiàn)，當(dāng)魚體受到強(qiáng)烈刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)失去平衡，使魚體內(nèi)的代謝發(fā)生紊亂，長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激會(huì)影響魚的生長(zhǎng)速度，也會(huì)導(dǎo)致魚的品質(zhì)下降[33]。動(dòng)物機(jī)體在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套抗氧化系統(tǒng)，包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。其中，酶促抗氧化系統(tǒng)包括T-AOC、T-SOD和CAT等，SOD主要催化超氧離子自由基歧化反應(yīng)，可以將呼吸鏈產(chǎn)生的超氧陰離子轉(zhuǎn)化成H2O2和O2，從而消除活性氧(ROS)對(duì)機(jī)體的直接毒害作用。而CAT通過(guò)催化過(guò)氧化氫分解來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[30]。在正常的新陳代謝或受到損傷條件下，機(jī)體都會(huì)不斷產(chǎn)生ROS，通過(guò)增強(qiáng)關(guān)鍵的抗氧化酶活性來(lái)避免或修復(fù)ROS可能對(duì)組織造成的氧化損害[34]。此外，GSH和MDA是常見(jiàn)的非酶促抗氧化指標(biāo)。在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。但當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物受到氧化應(yīng)激或損傷時(shí)，導(dǎo)致體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)，代謝產(chǎn)生的過(guò)量ROS會(huì)攻擊磷脂雙分子層中的多不飽和脂肪酸，造成脂質(zhì)過(guò)氧化并生成MDA，因此，MDA被認(rèn)為是細(xì)胞氧化損傷和肝胰臟損傷程度的重要標(biāo)志之一[29]。同時(shí)，MDA能夠與蛋白質(zhì)、核酸和氨基磷脂等的親核基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)聚合，它的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性[30]。GSH作為最重要的非酶促抗氧化物，具有清除自由基和過(guò)氧化氫等功能，因而GSH含量的多少也是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。

MLE的抗氧化作用在一些研究中已經(jīng)得到證實(shí)。有研究表明，基礎(chǔ)飼料中添加1 200 mg/L的桑葉水溶物或粗提物都能夠提高小鼠的抗氧化功能，血清GSH-Px和T-SOD的活性都顯著提高[32]。在大鯢中的研究發(fā)現(xiàn)，MLE能顯著提高腸道T-AOC活性，降低腸道MDA含量，但對(duì)T-SOD的活性沒(méi)有顯著影響[35]，MLE也能夠顯著提高大鯢肝臟T-AOC和T-SOD的活性，并且顯著降低肝臟MDA的含量[36]。在蛋雞研究中發(fā)現(xiàn)，桑枝葉提取物不同程度提高了蛋雞血清T-AOC、GSH-Px和SOD含量，降低了蛋雞血清MDA的含量[37]。桑葉水提物也可以降低糖尿病大鼠血清中MDA的含量[38]。本研究中，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中T-SOD的活性；添加5 g/kg的MLE顯著提高鱖魚血清中GSH的含量，顯著降低MDA的含量；添加10 g/kg的MLE顯著提高鱖魚血清中的GSH含量。這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。MLE對(duì)提高鱖魚抗氧化能力具有良好效果的原因可能是由于其富含的黃酮類和多糖類等生物活性物質(zhì)通過(guò)提高機(jī)體抗氧化酶活性、清除脂質(zhì)過(guò)氧化物和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)達(dá)到抗氧化作用，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.4 飼料中添加MLE對(duì)鱖魚肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

腸道是動(dòng)物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，主要通過(guò)腸上皮細(xì)胞的腸絨毛來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，腸道的皺襞密度、絨毛高度和寬度會(huì)直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[39]。腸道絨毛高度越高、數(shù)量越多、寬度越寬，腸道的吸收面積就越大。而腸壁肌層厚度也會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率[29]。馮麒鳳等[35]在大鯢中研究表明，MLE能夠顯著增加腸黏膜絨毛數(shù)量，提高絨毛高度。王詠梅等[21]研究表明，桑葉黃酮可以改善凡納濱對(duì)蝦的腸道結(jié)構(gòu)，提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力。本研究中，隨著MLE添加水平升高，鱖魚腸道褶皺增多，絨毛高度增加，當(dāng)MLE的添加水平為10 g/kg時(shí)，絨毛高度顯著高于對(duì)照組，各組之間絨毛寬度和肌層厚度無(wú)顯著差異。這說(shuō)明MLE能夠改善鱖魚腸道健康，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。

觀察肝臟組織形態(tài)是了解肝臟病理情況的一個(gè)重要手段。Huang等[40]在母雞中研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝臟組織脂質(zhì)空泡改變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，而添加低水平和高水平桑葉黃酮后肝細(xì)胞病理癥狀均有所緩解，炎癥細(xì)胞及空泡改變較少。同樣，在高脂高糖飼料誘導(dǎo)的小鼠中，添加桑葉水提物能夠改善肝臟細(xì)胞脂肪變性和堆積[41]。在本試驗(yàn)中也觀察到類似的結(jié)果，使用基礎(chǔ)飼料飼喂的鱖魚肝細(xì)胞有空泡化現(xiàn)象，而添加不同水平的MLE后都能夠改善肝細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，尤其是添加1 g/kg的MLE后，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝血竇、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)空泡化和細(xì)胞核偏移聚集等現(xiàn)象，這可能是由于桑葉黃酮改善了肝臟細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，說(shuō)明MLE確實(shí)能夠改善鱖魚的肝臟健康。

4 結(jié) 論

在鱖魚配合飼料中添加1～10 g/kg的MLE不影響鱖魚的生長(zhǎng)性能，但隨著MLE添加水平的提高，鱖魚的成活率不斷提高。此外，添加適量的MLE能夠提高鱖魚血清抗氧化能力和免疫功能，并且改善鱖魚的肝臟和腸道健康。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，鱖魚配合飼料中MLE的推薦添加水平為1 g/kg。