李晉南 范 澤 吳 迪 王連生

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150070)

與蛋白質(zhì)和脂類相比，糖類物質(zhì)是更經(jīng)濟(jì)、來源更廣泛的能源物質(zhì)，適量添加可以降低養(yǎng)殖成本，同時(shí)減少氮、磷排放，有利于減輕水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)水環(huán)境的污染[1-2]。然而，魚類被稱為“先天性糖尿病患者”，研究表明，魚類過多的攝入糖類物質(zhì)，不僅會(huì)對(duì)其生長性能產(chǎn)生不利影響，也會(huì)損害腸道健康，使機(jī)體免疫功能下降，抗病力降低，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物死亡[3-4]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，益生菌作為活體微生態(tài)制劑，因其天然、無污染等優(yōu)點(diǎn)受到了越來越多研究者的關(guān)注[5-7]。當(dāng)飼料中添加足夠量的益生菌時(shí)，可以對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響，其具有提高生長性能[8]、消化酶活性[9]、非特異性免疫功能[10]、腸道抗氧化能力[11]等功能。此外，在哺乳動(dòng)物上的研究表明，攝入益生菌可以降低餐后血糖值，改善糖代謝異常[12]。但目前關(guān)于益生菌改善魚類對(duì)飼料糖利用的研究還鮮有報(bào)道。

近年來，松浦鏡鯉(Cyprinuscarpio)作為培育出的優(yōu)良鯉魚品種，因其具有體表無磷、含肉率高、生長速度快等優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已得到了廣泛的推廣。Wilson[13]對(duì)鯉魚的研究表明，其利用淀粉的能力優(yōu)于葡萄糖，飼料糖的最高耐受量為40%。因此，本研究以松浦鏡鯉為研究對(duì)象，探討在高糖飼料中添加4種不同益生菌對(duì)其生長性能和腸道健康的影響，旨在尋找安全、綠色的添加劑，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，為糖類物質(zhì)在飼料中的高效利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)飼料

松浦鏡鯉選自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站。以魚粉、酪蛋白、豆粕為蛋白質(zhì)源，淀粉為糖源，制成糖水平為45%、蛋白質(zhì)水平為30%的基礎(chǔ)飼料，將基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組(G0組)，其余4組分別在基礎(chǔ)飼料中添加有效活菌數(shù)為1×108CFU/g的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)(G1組)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)(G2組)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)(G3組)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)(G4組)。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎過篩后，按表1配方準(zhǔn)確稱重配比，逐級(jí)充分混勻后，用雙螺桿擠條機(jī)制成2 mm的顆粒飼料，制粒溫度為(23±2) ℃，風(fēng)干后存放于-20 ℃冰箱中備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

3) 營養(yǎng)水平為實(shí)測值。Nutrient levels were measured values.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在室內(nèi)控溫循環(huán)水族箱里進(jìn)行，預(yù)飼2周后，選擇規(guī)格均一的健康松浦鏡鯉450尾，初始體重為(1.51±0.02) g，隨機(jī)分為5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)(30尾/缸)。每日飽食投喂3次(08:00、13:00和17:00)，24 h不間斷供氧，溶氧含量大于5.0 mg/L，溫度為(23±1) ℃，試驗(yàn)周期為8周。每日吸除殘餌和糞便，換1/3已曝氣的水，觀察并記錄試驗(yàn)魚攝食和死亡情況。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)魚停食12 h，各組分別計(jì)數(shù)、稱重。計(jì)算生長性能指標(biāo)。

根據(jù)試驗(yàn)魚體初重、末重、體長、內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和腸道質(zhì)量，計(jì)算增重率(weight gain rate, WGR)、飼料系數(shù)(feed conversion rate, FCR)、肥滿度(condition factor，CF)、臟體指數(shù)(viscerosomatic index，VSI)、肝體指數(shù)(hepatosomatic index，HSI)和腸體指數(shù)(intestinal somatic index，ISI)，具體公式如下：

增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0；
飼料系數(shù)=F/(Wt-W0)；
肥滿度(g/cm3)=100×W/L3；
肝體指數(shù)(%)=100×Wh/W；
臟體指數(shù)(%)=100×Wv/W；
腸體指數(shù)(%)=100×Wi/W。

式中：W0為魚體初重(g)；Wt為魚體末重(g)；F為飼料攝入量(g)；W為魚體質(zhì)量(g)；L為魚體長度(cm)；Wh為魚體肝臟重(g)；Wv為魚體內(nèi)臟重(g)；Wi為魚體腸道重(g)。

1.3.2 體成分測定

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚，用于檢測體成分。采用烘干法(105 ℃)測定魚體水分含量(GB/T 6435—2006)；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量(GB/T 6433—2006)；采用550 ℃馬弗爐灼燒法測定粗灰分含量(GB/T 6438—2007)；采用凱氏定氮法測量粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 血清生化指標(biāo)測定

每個(gè)重復(fù)缸隨機(jī)取6尾魚，用MS-222麻醉后，分別稱量每尾魚的體重和體長。尾靜脈取血，置于無菌離心管中，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取血清分裝后存于-80 ℃冰箱保存，用于檢測血清中葡萄糖(glucose，GLU)、膽固醇(cholesterol，CHOL)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量。血清生化指標(biāo)由貝克曼ProCX4全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.3.4 腸道健康指標(biāo)測定

在冰盤中迅速解剖并分離內(nèi)臟團(tuán)并稱重，然后分離肝臟并稱重。最后分離腸道，剔除腸道周圍脂肪和內(nèi)容物，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈腸道，濾紙吸干水分，測量腸道重。將其中3尾魚的腸道存于試管中，保存于-20 ℃冰箱中用于消化酶和抗氧化酶指標(biāo)的檢測。另外3尾魚的腸道迅速置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中用于免疫基因相對(duì)表達(dá)量的檢測。

1.3.4.1 腸道消化酶和抗氧化酶活性測定

腸道消化酶的測定：樣品解凍后，加入9倍體積預(yù)冷的0.86%生理鹽水進(jìn)行勻漿(FJ-200CL高速組織勻漿機(jī))，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ鹊鞍酌富钚圆捎酶Ａ?酚(Folin-phenol)法測定，淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體方法參見試劑盒說明書。組織蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定。

抗氧化酶活性的測定：腸道抗氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，包括丙二醛(malondialdehyde，MDA)和一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、總一氧化氮合成酶(total nitric oxide synthase，T-NOS)活性，具體方法參見試劑盒說明書。

1.3.4.2 腸道免疫基因表達(dá)測定

腸道樣品置于液氮中研磨，利用Trizol法提取腸道總RNA，測定總RNA濃度和純度，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(PrimeScript RT Master Mix，TaKaRa)。免疫相關(guān)基因的Real-time PCR特異性引物見表2，所有引物由上海英濰捷基公司合成。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的檢測，采用ABI 7500 Real-time PCR儀( Applied Biosystems，美國)進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq(2×)為10 μL，上、下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法[15]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。

表2 免疫相關(guān)基因引物

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉生長性能和血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與G0組相比，除G1組外，G2、G3和G4組松浦鏡鯉的末重和增重率均顯著提高(P<0.05)，G2和G3組飼料系數(shù)顯著降低(P<0.05)；各組間肥滿度沒有顯著差異(P>0.05)；G2組的臟體指數(shù)、腸體指數(shù)和肝體指數(shù)為各試驗(yàn)組中最高，各添加組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

表3 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉生長性能的影響

由表4可知，G3組的血清GLU含量顯著低于G0組(P<0.05)，其他各組間血清GLU含量沒有顯著差異(P>0.05)。血清CHOL和TG含量各組間沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉血清生化指標(biāo)的影響

2.2 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉體成分的影響

由表5可知，與G0組和G2組相比，G4組全魚的水分含量顯著提高(P<0.05)，粗脂肪含量顯著降低(P<0.05)；G2組全魚粗蛋白質(zhì)含量與G0組相比顯著增加(P<0.05)。各組間粗灰分含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉體成分的影響

2.3 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

由表6可知，與G0組相比，G2組腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著增加(P<0.05)；G1和G3組腸道淀粉酶活性顯著高于G0組(P<0.05)。

表6 高糖飼料中添加益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

2.4 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道抗氧化酶活性的影響

由表7可知，與G0組相比，各添加組腸道MDA含量均顯著降低(P<0.05)，同時(shí)顯著增加腸道T-AOC(P<0.05)，提高T-SOD活性(P<0.05)。G1、G3和G4組腸道AKP活性顯著高于G0組(P<0.05)。G2、G3和G4組腸道NO含量顯著高于G0組(P<0.05)；G3和G4組腸道T-NOS活性顯著高于G0組(P<0.05)。

表7 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道抗氧化酶活性的影響

2.5 高糖飼料中添加不同益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道免疫基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知，與G0組相比，各添加益生菌的試驗(yàn)組促炎因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；除G3組外，其余益生菌添加組促炎因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)基因相對(duì)表達(dá)量在各試驗(yàn)組間沒有顯著差異(P>0.05)，G1組的白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 高糖飼料中添加益生菌對(duì)松浦鏡鯉生長性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖飼料中添加1×108CFU/g的動(dòng)物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌均可以顯著提高松浦鏡鯉的末重和增重率，同時(shí)，飼料中添加動(dòng)物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌顯著降低了飼料系數(shù)。飼料中添加益生菌可以提高動(dòng)物的生長性能，在牙鲆(Paralichthysolivaceus)[16]、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)[17]、錦鯉(Cyprinuscarpio)[18]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[19]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[20]等水產(chǎn)動(dòng)物上都有研究。但是，在本試驗(yàn)中，添加嗜酸乳桿菌對(duì)松浦鏡鯉的生長性能沒有顯著影響，這一結(jié)果與大菱鲆[17]的研究結(jié)果類似，其研究顯示添加嗜酸乳桿菌對(duì)養(yǎng)殖初期或中期的魚體增重率有顯著的影響，但在養(yǎng)殖后期增重率顯著下降。吳志宏等[17]研究認(rèn)為，其原因可能是過量添加嗜酸乳桿菌導(dǎo)致了魚體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，影響了魚類的生長性能，或者是由于嗜酸乳桿菌在消化道內(nèi)產(chǎn)生了過量的酶，抑制了體內(nèi)內(nèi)源酶的活性，降低了對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用，從而抑制了生長性能。李軍亮等[21]在斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，過量的添加嗜酸乳桿菌會(huì)降低生長性能。本試驗(yàn)中，除嗜酸乳桿菌沒有提高松浦鏡鯉生長性能外，其余3種益生菌均顯著提高了松浦鏡鯉的生長性能，其可能的原因是與嗜酸乳桿菌的添加劑量或投喂方式有關(guān)，需要進(jìn)一步試驗(yàn)的驗(yàn)證。

魚體的體成分可以反映魚體對(duì)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加動(dòng)物雙歧桿菌顯著增加全魚粗蛋白質(zhì)的含量，這一結(jié)果與Sahandi等[22]和Mohapatra等[23]的研究結(jié)果一致。

3.2 高糖飼料中添加益生菌對(duì)松浦鏡鯉消化吸收能力的影響

鯉魚作為無胃魚，腸道是其營養(yǎng)物質(zhì)的主要吸收和消化的場所，腸道中分泌的消化酶活性則是衡量其消化能力的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖飼料中添加嗜酸乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌均顯著增加腸道中消化酶的活性，這一結(jié)果與Mohapatra等[23]在南亞野鯪(Labeorohita)中的研究結(jié)果一致。動(dòng)物雙歧桿菌組腸道胰蛋白酶活性的增加提高了蛋白質(zhì)消化能力，從而提高魚體的生長性能和全魚粗蛋白質(zhì)的含量。李軍亮等[21]對(duì)斜帶石斑魚的研究表明，其腸道消化酶活性及相關(guān)酶mRNA表達(dá)量隨飼料中嗜酸乳桿菌的添加量增加呈先升高后降低的趨勢。本試驗(yàn)高糖飼料中添加干酪乳桿菌并未改善腸道消化酶活性，其原因可能與其添加劑量有關(guān)。

3.3 高糖飼料中添加益生菌對(duì)松浦鏡鯉腸道抗氧化功能的影響

抗氧化系統(tǒng)由1組抗氧化酶和1組低分子質(zhì)量分子組成[24-26]。這種防御系統(tǒng)的重要組成部分是T-AOC、SOD和MDA等。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低是細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志[27]。本試驗(yàn)中，各益生菌添加組腸道MDA含量顯著降低，腸道T-AOC和T-SOD活性提高。有研究表明，過量的碳水化合物會(huì)導(dǎo)致魚類持續(xù)高血糖，最終導(dǎo)致慢性應(yīng)激[28]，Zhao等[29]對(duì)大口黑鱸(Micropterussalmoides)的研究也表明，長時(shí)間的高糖攝入，會(huì)導(dǎo)致腸道抗氧化能力的降低。本試驗(yàn)結(jié)果說明，高糖飼料中添加適宜水平的益生菌可提高腸道的抗氧化能力，降低氧化損傷。趙瑞禎等[30]在刺參(Stichopusjaponicus)的研究中表明，益生菌組腸道MDA含量顯著降低， SOD活性提高。AKP是機(jī)體免疫抗病必不可少的免疫酶[31]，研究表明，其活性高低與魚體的抗病力呈正相關(guān)[32]。本研究中，添加嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌均顯著提高腸道AKP活性。李詠梅等[33]在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的研究中也得到相似的結(jié)果。T-NOS在機(jī)體免疫物質(zhì)誘導(dǎo)下會(huì)釋放大量的NO，生成的NO在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的作用十分重要[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖飼料中添加動(dòng)物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌顯著提高腸道NO的含量，說明益生菌可以通過提高機(jī)體的NO含量來提高機(jī)體的免疫功能。

3.4 高糖飼料中添加益生菌對(duì)松浦鏡鯉免疫指標(biāo)的影響

4 結(jié) 論

綜上所述，在高糖飼料中添加動(dòng)物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌可以顯著提高松浦鏡鯉生長性能，同時(shí)提高腸道消化酶活性及抗氧化指標(biāo)，以及腸道免疫功能。