王曉娜 孫國君 孫建政 庫倩倩 沈思軍 王旭哲

(石河子大學動物科技學院，石河子832000)

為了解決苜蓿鮮草糖分含量較低、苜蓿青貯難以調制的問題，傳統(tǒng)的苜蓿青貯方法是將玉米等高糖飼料作物和苜?；旌锨噘A，以改善苜蓿青貯的發(fā)酵品質。然而，目前仍存在諸多尚待解決的問題。青貯過程中由于自身植物酶和青貯中微生物共同作用，導致發(fā)酵時蛋白質水解，大量蛋白質轉化成非蛋白氮，這降低了蛋白質品質[1-2]。苜蓿青貯蛋白質降解成非蛋白氮的現象貫穿整個青貯過程，新鮮牧草中79%以上氮以真蛋白質形式存在，青貯后紫花苜蓿的非蛋白氮達到52.1%～70.2%[3]；青貯60 d后，苜蓿蛋白質損失率可達11%[4]；同時，青貯飼料產生的有機酸和氨態(tài)氮降低了適口性和采食量。已有文獻報道，用含有殺菌物質的植物同其他飼料作物混合青貯，同樣可以獲得高質量的青貯飼料[5]。松針中含有殺菌、抑菌活性物質，對細菌具有一定的抑制和殺滅作用。前人試驗證明，在苜蓿青貯飼料中將落葉松針葉與苜蓿按1∶1比例混合制成青貯飼料，pH和產氣量最低，在該青貯料中微生物的發(fā)酵過程和生命活動都受到極大的抑制[6]。本課題組前期研究也證實，松針與苜蓿混貯比例為3∶7和5∶5時青貯效果較好[7]。在前期研究基礎上，本試驗通過分析和比較2種苜蓿混合青貯飼料品質指標的差異，以期為松針的應用和提高青貯飼料品質提供新的技術措施。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用苜蓿產自石河子大學動物科技學院試驗田，于第二茬初花期(2019年6月下旬)刈割；樟子松松針采自石河子大學校園。

1.2 試驗設計

試驗分2個組，將苜蓿青草和樟子松松針切短至1～2 cm，以苜蓿鮮重計，在苜蓿鮮草中分別添加10%玉米粉(CAMS組)和30%松針(PAMS組)，混合均勻后，密封于青貯罐中，每個組3個重復。分別于青貯發(fā)酵的第0、1、3、5、7、15、30、45和60天打開青貯罐，取樣，備測。

1.3 指標測定

1.3.1 感官評價

青貯結束后，按照《青貯飼料質量評定標準(試行)》[8]，從色澤、氣味和質地3個方面對青貯飼料進行感官評價。

1.3.2 營養(yǎng)成分測定

青貯飼料中干物質(DM)含量采用烘干恒重法測定；粗蛋白質(CP)含量采用凱氏定氮法測定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量采用范氏洗滌纖維法測定，具體測定方法參考《飼料分析及飼料質量檢測技術》[9]；可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[10]測定。

1.3.3 發(fā)酵品質指標測定

取青貯飼料樣品20 g置于250 mL錐形瓶中，加約180 mL蒸餾水，于4 ℃冰箱中浸提24 h，先用4層粗紗布過濾，再用濾紙精濾后獲得浸提液[11]。測定pH后，將浸提液裝入離心管并置于-20 ℃冰箱中保存，測定氨態(tài)氮(NH3-N)、乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。

pH采用雷磁PHSJ-3F pH計測定；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法[12]測定；乳酸含量采用對-羥基聯苯比色法[13]測定；乙酸、丙酸和丁酸含量采用液相色譜法[14]測定。

1.3.4 微生物數量測定

微生物數量采用平板計數法進行計數。在超凈臺準確稱取5 g樣品，剪碎混勻后，放入有45 mL無菌水的錐形瓶中。在常溫搖床上處理1 h后使用無菌水稀釋10-1～10-8，選擇適宜的梯度涂布。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)在MRS培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3 d后，選擇有顯著特征的菌落計數；酵母菌和霉菌分別在孟加拉紅瓊脂平板和葡萄糖麥芽浸膏瓊脂平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后計數；好氧細菌(aerobic bacteria,AB)在普通瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后計數[15]；大腸桿菌(Escherichiacoli,EC)使用伊紅美蘭培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后計數。

1.3.5 霉菌毒素含量測定

采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測總黃曲霉毒素(AFT)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)和T2毒素(T2)含量，使用百奧森(江蘇)食品安全科技有限公司生產的ELISA檢測試劑盒，按照試劑盒提供的方法進行測定。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用Excel 2016初步整理后，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，結果采用“平均值±標準差”表示，對同一組不同時間點平均值進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較，對組間平均值進行t檢驗分析，以P<0.05作為差異顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 2種苜?；旌锨噘A飼料感官評價

2種苜?；旌锨噘A飼料感官評價見表1。青貯結束時，2組青貯飼料未發(fā)現霉變現象，色澤、氣味以及質地均符合優(yōu)等青貯標準。與玉米粉與苜?；旌锨噘A相比，松針與苜?；旌锨噘A具有酸香味和松針清香味。

表1 2種苜?；旌锨噘A飼料感官評價

2.2 2種苜蓿混合青貯飼料青貯過程中常規(guī)營養(yǎng)成分的變化

由表2可知，2組的DM含量均從青貯第3天開始顯著下降(P<0.05)，青貯第7天后均無顯著變化(P>0.05)；青貯前后，CAMS組和PAMS組的DM損失率分別為6.63%和5.27%，且PAMS組的DM損失率顯著低于CAMS組(P<0.05)。CAMS組各時間點的CP含量顯著高于PAMS組(P<0.05)；青貯前后，CAMS組的CP含量降低了11.41%(P<0.05)，PAMS組的CP含量降低了4.27%(P>0.05)，且PAMS組的CP損失率顯著低于CAMS組(P<0.05)。隨著青貯時間的延長，2組的NDF和ADF含量均有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；同一時間點2組的NDF和ADF含量之間無顯著差異(P>0.05)。2組的WSC含量從青貯第0天至第30天顯著下降(P<0.05)，之后無顯著變化(P>0.05)；各時間點PAMS組的WSC含量顯著低于CAMS組(P<0.05)；CAMS組和PAMS組的WSC損失率分別為46.07%和38.35%，且PAMS組的WSC損失率顯著低于CAMS組(P<0.05)。

表2 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中常規(guī)營養(yǎng)成分的變化(干物質基礎)

2.3 2種苜蓿混合青貯飼料青貯過程中發(fā)酵品質的變化

由表3可知，2組的pH隨著青貯時間的延長而下降。從青貯第0天至第45天，CAMS組的pH顯著下降(P<0.05)，之后至試驗結束無顯著變化(P>0.05)；從青貯第3天至第15天，PAMS組的pH顯著下降(P<0.05)，第30天至青貯結束保持不變(P>0.05)；青貯過程中，各時間點PAMS組的pH均顯著高于CAMS組(P<0.05)。從青貯第0天至第45天，2組的乳酸含量均顯著上升(P<0.05)，隨后保持不變直至青貯結束(P>0.05)；各時間點PAMS組的乳酸含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。

表3 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中發(fā)酵品質的變化

從青貯第0天至第45天，2組的乙酸含量均顯著上升(P<0.05)，隨后保持不變直至試驗結束(P>0.05)；各時間點PAMS組的乙酸含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。青貯開始時，CAMS組和PAMS組均未檢測到丙酸；從青貯第1天至第45天，CAMS組的丙酸含量顯著升高(P<0.05)，隨后保持不變直至試驗結束(P>0.05)；從青貯第3天至第60天，PAMS組的丙酸含量顯著升高(P<0.05)；除前3 d外，其余時間點PAMS組的丙酸含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。青貯開始時，2組均未檢測到丁酸；從青貯第5天至第45天，CAMS組的丁酸含量顯著升高(P<0.05)，隨后保持不變直至試驗結束(P>0.05)；從青貯第15天至第60天，PAMS組的丁酸含量顯著升高(P<0.05)；除前7 d外，其余時間點PAMS組的丁酸含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。從青貯第0天至第45天，CAMS組和PAMS組的NH3-N/總氮(TN)值均顯著上升(P<0.05)，之后無顯著變化(P>0.05)；各時間點PAMS組的NH3-N/TN值顯著低于CAMS組(P<0.05)。

2.4 2種苜蓿混合青貯飼料青貯過程中微生物數量的變化

由表4可知，從青貯第0天至第7天，2組的乳酸菌數量顯著上升(P<0.05)，之后逐漸顯著下降(P<0.05)，第30天至青貯結束無顯著變化(P>0.05)；在青貯的第1、3和5天，PAMS組的乳酸菌數量顯著低于CAMS組(P<0.05)，之后2組的乳酸菌數量無顯著差異(P>0.05)。從青貯第0天至第5天，2組的酵母菌數量顯著上升(P<0.05)，之后逐漸顯著下降(P<0.05)，第45天至青貯結束無顯著變化(P>0.05)。除青貯的第0、1天外，其他時間點PAMS組的酵母菌數量顯著低于CAMS組(P<0.05)；從青貯第3天至第7天，CAMS組的霉菌數量顯著下降(P<0.05)，之后至青貯結束未檢測到霉菌；從青貯第0天至第5天，PAMS組的霉菌數量顯著下降(P<0.05)，之后至青貯結束未檢測到霉菌；青貯第1、3和5天，PAMS組的霉菌數量顯著低于CAMS組(P<0.05)，青貯結束后，2組均未檢測到霉菌。

表4 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中微生物數量的變化

從青貯第0天至第3天，2組的好氧細菌數量顯著上升(P<0.05)，之后逐漸顯著下降(P<0.05)，第45天后基本穩(wěn)定至青貯結束(P>0.05)；青貯過程中，PAMS組的好氧細菌數量均顯著低于CAMS組(P<0.05)。從青貯第0天至第3天，CAMS組的大腸桿菌數量顯著上升(P<0.05)，之后逐漸顯著下降(P<0.05)，第45天后基本穩(wěn)定至青貯結束(P>0.05)；從青貯第5天至第30天，PAMS組的大腸桿菌數量顯著低于CAMS組(P<0.05)，青貯結束時，PAMS組未檢測到大腸桿菌。

2.5 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中霉菌毒素含量的變化

由表5可知，從青貯第0天至第15天，2組的總AFT含量顯著上升(P<0.05)，第30天至青貯結束無顯著變化(P>0.05)；同一時間點PAMS組的總AFT含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。從青貯第3天至第7天，CAMS組的ZEN含量顯著上升(P<0.05)，之后至青貯結束無顯著變化(P>0.05)；青貯前后，PAMS組的ZEN含量無顯著差異(P>0.05)；從青貯第3天開始，同一時間點PAMS組的ZEN含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。青貯前后，2組的DON含量無顯著變化(P>0.05)，且2組之間的DON含量無顯著差異(P>0.05)。從青貯第0天至第30天，2組的T2毒素含量均顯著升高(P<0.05)；第30天之后無顯著變化(P>0.05)；同一時間點PAMS組的T2毒素含量顯著低于CAMS組(P<0.05)。

表5 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中霉菌毒素含量的變化

3 討 論

3.1 2種苜?；旌锨噘A飼料感官評價

本試驗感官評價表明，玉米粉與苜?；旌锨噘A和松針與苜蓿混合青貯感官品質沒有差異，評級均為優(yōu)等。添加玉米粉增加了可溶性糖含量，可以促進乳酸菌發(fā)酵；添加松針提高了抗菌成分，因此2種處理方法均可抑制霉菌、酵母菌等有害微生物的生長繁殖，從而改善苜?；旌锨噘A的品質。

3.2 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中常規(guī)營養(yǎng)成分的變化

本試驗中，隨著青貯發(fā)酵的進行，2組的DM、CP和WSC含量均呈下降趨勢。盧強等[16]試驗發(fā)現，在苜蓿青貯第1周，DM耗損速率較快，本試驗結果與之相似。其原因是苜蓿的真蛋白質在自身蛋白酶和微生物酶作用下，分解為非蛋白氮所致。青貯開始后，梭菌和腐敗菌分解利用CP，導致其含量下降；隨著青貯發(fā)酵的進行，梭菌和腐敗菌被抑制，下降速度趨于平緩。青貯結束時，PAMS組的DM、CP和WSC損失率顯著低于CAMS組。主要原因是松針精油對有害微生物有較強的抑制作用，有害微生物的作用程度低；玉米粉與苜?；旌锨噘A含有較多的可溶性糖，微生物活動旺盛，有害微生物作用程度高，因而養(yǎng)分損失較多。

試驗表明，添加玉米粉可顯著降低苜蓿青貯NDF和ADF含量[17-18]，原因是添加玉米粉可顯著增加苜蓿青貯DM和可溶性糖的含量，導致纖維含量相對降低。本試驗表明，2組的NDF和ADF含量青貯前后差異均不顯著，可能是松針和玉米粉的添加量對混合苜蓿青貯的NDF和ADF含量未能產生明顯影響。

3.3 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中發(fā)酵品質的變化

Meeske等[19]研究發(fā)現，如果青貯原料DM含量比較高，則青貯飼料的pH未必需要小于4.2。本試驗也表明，由于2組青貯原料DM含量較高，雖然pH高于4.2，但品質優(yōu)良。現有文獻報道，玉米粉含有較高的WSC，可促進乳酸菌增殖；隨著玉米含量逐漸增加，苜蓿與玉米混合青貯的pH顯著降低，乳酸含量顯著升高[20-21]。本試驗中，松針與苜蓿混合青貯可以利用松針中所含的抑菌物質抑制有害菌的繁殖，促進乳酸菌生長，所以與玉米粉與苜?；旌锨噘A相比較，松針與苜?；旌锨噘A中的乳酸含量低，pH高。乙酸由厭氧菌產生，過量的乙酸可降低動物的采食量；丙酸在正常青貯中含量很少，主要是丙酸桿菌、反芻硒單胞菌以及丙酸梭菌的產物[22]；丁酸由丁酸梭菌分解氨基酸產生，會造成養(yǎng)分損失，意味著青貯飼料保存不良[23]。松針與苜蓿混合青貯的乙酸、丙酸和丁酸含量顯著低于玉米粉與苜?；旌锨噘A，這是由于青貯過程中乳酸菌等優(yōu)勢菌的大量繁殖，以及松針所含抑菌成分對上述菌群產生抑制作用所致。

NH3-N/TN值能夠展示青貯飼料的CP以及氨基酸被降解的程度，該值越大，CP降解越多，且較高的NH3-N/ TN值可影響動物采食量[24]。研究表明，青貯中部分NH3-N是植物蛋白酶降解CP所產生，部分是由青貯中腐敗菌降解蛋白質、氨基酸產生[25]。本試驗中，由于松針所含抑菌成分抑制了梭菌等微生物的生長繁殖，從而減少了CP的分解。因此，PAMS組的NH3-N/值顯著低于CAMS組。

3.4 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中微生物數量的變化

青貯過程是一個復雜的微生物區(qū)系變化過程[26]，涉及乳酸菌、酵母菌、霉菌及芽孢桿菌等多種微生物。微生物群落結構、演替過程及其代謝產物影響著青貯飼料的發(fā)酵品質[27]。本試驗發(fā)現，青貯結束后，2組之間的乳酸菌數量無顯著差異，且均未檢測到霉菌；PAMS組的酵母菌、好氧細菌數量顯著低于CAMS組，且松針與苜蓿混合青貯中未檢測到大腸桿菌。一般認為，在苜蓿青貯中添加玉米粉可有效改善菌群結構，促進乳酸菌發(fā)酵，抑制腐敗菌增殖，進而提高苜蓿青貯品質[28]。植物精油的主要成分是萜烯類化合物，具有很好的殺菌特性，對食物及植物來源真菌均具有抗菌作用[29-30]。有試驗發(fā)現，在苜蓿青貯飼料中添加孜然精油和松針精油，可抑制酵母菌生長，增加乳酸菌數量，提高青貯飼料的發(fā)酵品質和有氧穩(wěn)定性[31-32]。松針精油具有良好的抗菌活性、抗菌廣譜性和高揮發(fā)性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、青霉菌和黑曲霉菌均具有抑制作用[33]，且抑菌效果因菌種有所不同。孫建政等[34]研究發(fā)現，松針精油對酵母菌、梭狀芽孢桿菌和串珠鐮刀菌有著較強的抑制效果，對嗜酸乳桿菌則無抑制作用。在松針與苜?；旌锨噘A中，松針精油抑制了有害微生物的增殖，提高了乳酸菌的數量，這是松針改善苜蓿青貯品質的主要原因。同時，這也表明在苜?；旌锨噘A中添加松針對有害菌的抑制作用強于添加玉米粉。

3.5 2種苜?；旌锨噘A飼料青貯過程中霉菌毒素含量的變化

霉菌毒素是霉菌在植物上生成的有毒代謝物，青貯飼料在收獲前、發(fā)酵期間及開窖后都會受到霉菌毒素污染[35]。已有研究發(fā)現，在發(fā)霉飼料和沒有被霉菌污染的青貯原料中均檢測出霉菌毒素，青貯飼料中的ZEN和一些單端孢霉烯族毒素不受厭氧和酸性條件影響[36]，青貯條件下不易被降解，可持續(xù)存在。據文獻報道，植物精油不僅能有較抑制真菌生長，而且可抑制真菌產生霉菌毒素[37]。本試驗表明，青貯結束時，松針與苜?；旌锨噘A的總AFT、ZEN和T2毒素含量均顯著低于玉米粉與苜?；旌锨噘A，其原因可能是松針精油抑制了霉菌毒素的產生，其機制尚不明確。植物精油抑制真菌產生毒素的機理極為復雜，通常認為在較高濃度下，植物精油主要通過抑制真菌生長而抑制真菌毒素的產生；而在較低濃度下，植物精油則通過下調毒素關鍵調控和合成結構基因的表達而抑制真菌毒素的生物合成[38]。

4 結 論

① 松針與苜蓿混合青貯的DM、CP和WSC損失率及NH3-N/TN值，酵母菌、好氧細菌和大腸桿菌數量，以及總AFT、ZEN和T2毒素含量顯著低于玉米粉與苜蓿混合青貯。

② 綜合考慮，松針與苜?；旌锨噘A的品質顯著高于玉米粉與苜蓿混合青貯，松針可改善苜蓿青貯飼料的品質。