徐 浩 院 東 臧長江* 李曉斌 余英英 李鳳鳴 劉保宣 陳開旭 劉建成

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室，烏魯木齊830052；2.昌吉市吉緣牧業(yè)有限公司，昌吉831100)

N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamic acid，NCG)是N-乙酰谷氨酸的類似物，是內(nèi)源性精氨酸合成的激活劑，可以激活精氨酸合成途徑的關鍵酶——氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ(CPS-Ⅰ)，通過促進谷氨酰胺合成瓜氨酸，增加精氨酸的內(nèi)源性合成及血漿中精氨酸的含量[1]。精氨酸及其代謝產(chǎn)物一氧化氮(NO)、多胺是胎盤血管生成的主要參與者，母畜妊娠期間在血管生成、胎盤和胎兒的生長、子宮-胎盤血流量、母體與胎兒間營養(yǎng)物質(zhì)的交換等方面發(fā)揮著重要的作用[2-3]。母馬的營養(yǎng)和生理狀況直接影響胎兒的生長發(fā)育，母馬繁育過程中具有妊娠期長、流產(chǎn)率高的特點。母馬的流產(chǎn)可能發(fā)生在整個妊娠期間，30%以上的流產(chǎn)發(fā)生在當年妊娠的9—11月份和次年的2—3月份[4]。降低母馬流產(chǎn)率是提高母馬的繁殖效率和經(jīng)濟效益的有效措施。Mortensen等[5]研究表明，母馬妊娠期補飼精氨酸可增加母體對子宮、胎盤的供血量，提高母馬對子宮、胎盤營養(yǎng)物質(zhì)的供應。Lassala等[6]給妊娠100～121 d的多胎母羊靜脈注射精氨酸后提高了羔羊的存活率，增加了4胎羔羊的初生重。目前，關于在母馬妊娠期補飼NCG的報道較少，尤其是關于母馬妊娠期胎兒發(fā)育的報道。因此，為進一步提高伊犁馬的繁殖性能，降低流產(chǎn)率，本試驗開展了在妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿參數(shù)及新生馬駒體重、體尺指標影響的研究，以期為NCG在繁殖母馬生產(chǎn)中的應用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用NCG為市購，有效成分含量為97%。

1.2 試驗設計

在新疆伊犁昭蘇縣種馬場按照體重、年齡、預產(chǎn)期相近的原則選取30匹妊娠后期[(280±15) d]伊犁母馬為試驗對象，隨機分成2組，分別為對照組和NCG組，每組15匹母馬。母馬基本信息見表1，2組間年齡、體重和體高均差異不顯著(P>0.05)。對照組飼喂基礎飼糧，NCG組則飼喂添加0.17% N-氨甲酰谷氨酸的基礎飼糧，即每匹馬每天補飼20 g NCG。飼喂期為52 d，其中預試期7 d，正試期45 d。

表1 母馬基本信息

1.3 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

基礎飼糧配制參考NRC(2007)馬的飼養(yǎng)標準中妊娠母馬的營養(yǎng)需要量進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

續(xù)表2項目Items對照組Control groupNCG組NCG group粗蛋白質(zhì) CP 9.279.29中性洗滌纖維 NDF41.8641.87酸性洗滌纖維 ADF21.0821.06鈣 Ca0.760.76磷 P0.390.39消化能 DE/(MJ/kg)11.3711.38

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗母馬進行分群飼養(yǎng)管理，每天在運動場自由活動。精料補充料飼喂時間為11:00，每天1次，每次按每匹母馬2 kg飼喂，青干草按每匹馬每天10 kg飼喂，于每天09:00、20:00各飼喂1次，每次5 kg，自由飲水，保持圈舍衛(wèi)生。

1.5 樣品的采集與處理

1.5.1 飼糧樣品的采集與處理

于試驗的第0(預試期結(jié)束時記為試驗的第0天)、45天分別采集飼糧樣品，在65 ℃的烘箱中烘48 h至恒重獲得風干樣，然后用粉碎機粉碎，過40目篩，裝入密封袋中密封保存，用于常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定。

1.5.2 血液樣品的采集與處理

分別于試驗第0、21、45(分娩后)天用5 mL肝素鈉抗凝管于馬匹頸靜脈采集血液2管，以3 500 r/min離心10 min，收集血漿，分裝于EP管中，置于-20 ℃冰箱凍存。

1.6 指標的測定

1.6.1 飼糧常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定

干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、鈣(Ca)、磷(P)含量參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(第3版)》[7]進行檢測，采用Van Soest等[8]的方法測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.6.2 新生馬駒體重、體尺指標的測定

于母馬分娩后12 h之內(nèi)測定每匹馬駒的體高、體斜長、胸圍、管圍等體尺指標和體重。馬駒體重用電子秤稱量，體尺指標采用測杖和軟皮尺測定。體高為由鬢甲頂點到地面的垂直距離；體斜長為肩端到臀端的直線距離；胸圍為肩胛骨后緣繞體軀的周長；管圍為左前管骨上1/3下端，管骨最細部分水平周長。

1.6.3 產(chǎn)后妊娠率的測定

母馬分娩時間集中在飼喂期的第42～52天，NCG組和對照組產(chǎn)馬駒30匹，均存活。于產(chǎn)后母馬初次發(fā)情配種后15 d使用獸用B超儀(型號：BXL-V20)檢查妊娠情況，記錄妊娠率；于配種結(jié)束后28 d再次用獸用B超儀檢查妊娠情況，統(tǒng)計妊娠率。

妊娠率(%)=100×妊娠母馬匹數(shù)/配種母馬匹數(shù)。

1.6.4 血漿參數(shù)的測定及方法

血漿送至南京建成生物工程研究所測定血漿參數(shù)，包括NO、總一氧化氮合成酶(TNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、尿素氮、氨、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、生長激素(GH)、胰島素生長因子-1(IGF-1)。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行初步整理，新生馬駒體重、體尺指標及母馬血漿參數(shù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的獨立樣本t檢驗進行分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示；妊娠率采用卡方檢驗進行分析。差異顯著性標準為P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠后期飼糧中添加NCG對新生馬駒體重及體尺指標的影響

由表3可知，與對照組相比，NCG組馬駒的初生重、體高分別顯著提高了6.82%和3.41%(P<0.05)，馬駒的胸圍、管圍分別極顯著提高了5.59%和5.70%(P<0.01)，馬駒的體斜長則無顯著變化(P>0.05)。

表3 妊娠后期飼糧中添加NCG對新生馬駒體重及體尺指標的影響

2.2 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬分娩后妊娠率的影響

由表4可知，分娩后對照組的妊娠率為66.67%，NCG組為80.00%，2組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬分娩后妊娠率的影響

2.3 妊娠后期飼糧中NCG對伊犁母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量的影響

由表5可知，與對照組相比，在試驗第0天，NCG組血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量分別提高了12.76%(P>0.05)、49.41%(P<0.01)、21.54%(P<0.05)、46.96(P<0.01)；在試驗第21天，NCG組血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量分別提高了4.09%(P>0.05)、18.20%(P>0.05)、11.28%(P>0.05)、67.49%(P<0.01)；在試驗第45天，NCG組血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性分別降低了25.72%(P<0.01)、31.01%(P<0.01)、22.10%(P<0.01)，血漿中NO含量提高了42.75%(P>0.05)。

表5 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量的影響

2.4 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中尿素氮和氨含量的影響

由表6可知，與對照組相比，在試驗第0、21天，NCG組母馬血漿中尿素氮、氨含量均有一定程度的提高，但差異不顯著(P>0.05)；在試驗第45天，NCG組母馬血漿中尿素氮含量極顯著降低(P<0.01)，氨含量差異不顯著(P>0.05)。

表6 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中尿素氮和氨含量的影響

2.5 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

由表7可知，與對照組相比，在試驗第0天，NCG組血清中SOD活性、MDA含量極顯著升高(P<0.01)，GSH-Px活性差異不顯著(P>0.05)；在試驗第21、45天，NCG組血清中SOD、GSH-Px活性均無顯著差異(P>0.05)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

表7 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

2.6 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中GH、IGF-1含量的影響

由表8可知，與對照組相比，在試驗第0、21、45天，NCG組血漿中GH、IGF-1含量均無顯著差異(P>0.05)，但在試驗第45天NCG組血漿中GH、IGF-1含量均有所下降。

表8 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中GH、IGF-1含量的影響

3 討 論

3.1 妊娠后期飼糧中添加NCG對新生馬駒體重、體尺指標及伊犁母馬分娩后妊娠率的影響

母體營養(yǎng)作為子宮內(nèi)環(huán)境最主要的影響因素，直接影響著胎兒的生長發(fā)育。哺乳動物在妊娠早期至中期，母體的營養(yǎng)主要影響胎兒的器官發(fā)育，但胎重的2/3是在妊娠最后1/4期(妊娠晚期)內(nèi)增長的。因此，妊娠后期母體營養(yǎng)物質(zhì)的供給是影響新生幼畜初生重的重要因素之一。精氨酸作為動物功能性氨基酸，其自身或代謝產(chǎn)物通過調(diào)控多個關鍵代謝通路，在促進動物的生長發(fā)育、改善繁殖性能、增強機體免疫健康及促進腸道發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用。NCG是N-乙酰谷氨酸(NAG)的結(jié)構(gòu)類似物，參與二氫吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)和CPS-Ⅰ的激活，促進谷氨酰胺或脯氨酸合成瓜氨酸，進而促進精氨酸的合成；精氨酸的代謝產(chǎn)物NO、多胺等可擴張血管，增加母體子宮和胎盤的毛細血管的血流量，促進胎盤對胎兒的供血量及營養(yǎng)物質(zhì)的供給，進而有效地促進胎兒的生長發(fā)育[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠初期母豬飼糧中添加0.05%、0.10%的NCG顯著增加了仔豬窩重和平均出生重。劉星達等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠后期母豬飼糧中添加0.08%的NCG，仔豬活胎數(shù)得到了顯著提高。在本試驗中，在妊娠后期伊犁母馬飼糧中添加0.17%的NCG，顯著或極顯著提高了新生馬駒的初生重、體高、管圍，同時提高了分娩后母馬的妊娠率，這可能與添加的NCG促進動物內(nèi)源生成精氨酸以及精氨酸在體內(nèi)代謝過程的代謝產(chǎn)物NO和多胺等的增加，進而增加了母體與胎盤的血流量，促進了胎盤對胎兒的營養(yǎng)供給，改善了母體營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運效率和子宮內(nèi)環(huán)境有關[12]。

3.2 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量的影響

精氨酸在動物體內(nèi)可以通過一氧化氮合成酶(NOS)和鳥氨酸脫羧酶代謝為NO和多胺，NO和多胺對胎盤血管生產(chǎn)和生長至關重要[13-15]。機體精氨酸的含量和血管平滑肌產(chǎn)生的NOS限速因子是影響NO合成的關鍵因素。Zhang等[10]研究結(jié)果表明，在妊娠母豬飼糧中添加NCG提高了血漿中精氨酸和鳥氨酸的含量，且eNOS的基因表達增加。精氨酸是包括胎盤在內(nèi)的體內(nèi)NO合成的唯一前體，在飼糧中添加NCG可以通過提高血漿精氨酸含量來促進機體內(nèi)NO的生成[16]。本試驗結(jié)果顯示，妊娠后期補飼NCG提高試驗第0、21天伊犁母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量，與上述文獻研究結(jié)果相近。精氨酸在機體內(nèi)的代謝主要有精氨酸-胍基丁胺、精氨酸-NO、精氨酸-鳥氨酸-脯氨酸、精氨酸-胍基乙酸-肌酸、精氨酸-鳥氨酸-腐胺-精胺-亞精胺代謝途徑；催化精氨酸分解的酶主要是NOS、精氨酸酶、精氨酸脫羧酶和精氨酸-甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；不同的酶在線粒體和胞質(zhì)中的表達存在較大差異，NOS催化精氨酸產(chǎn)生NO和瓜氨酸。補飼NCG降低了分娩后母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性，但使NO的含量增加，這可能與分娩應激和精氨酸在體內(nèi)的多條代謝途徑有關。精氨酸在機體內(nèi)代謝，提高了血漿中NO的含量，從而促進胎盤血管的發(fā)育并增加了胎盤的血流量，為胎兒在子宮內(nèi)發(fā)育提供大量營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，這與前面得出的NCG提高了馬駒的初生重、體高、管圍的結(jié)果相一致。

3.3 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中尿素氮和氨含量的影響

NCG是CPS-Ⅰ的輔助因子，氨甲酰磷酸合成酶是一種速率限制酶，在機體內(nèi)可以促進尿素循環(huán)和精氨酸的合成[17]。血漿中尿素氮的含量能準確反映動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝與氨基酸代謝的平衡狀態(tài)。當氨基酸代謝處于平衡狀態(tài)時，尿素氮含量會明顯降低。動物體內(nèi)血漿中氨的含量是精氨酸營養(yǎng)的一個敏感的指標。在動物體內(nèi)，精氨酸可以通過促進尿素循環(huán)使血氨轉(zhuǎn)化為尿素排出體外，從而維持動物體內(nèi)氮的平衡。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，NCG組母馬血漿中尿素氮和氨的含量在妊娠后期無顯著差異，分娩后呈降低趨勢，說明妊娠后期飼糧添加NCG對胎兒沒有造成不利影響；這與Chacher[18]的研究結(jié)果相近。Mateo等[9]在妊娠母豬飼糧中添加精氨酸所得試驗結(jié)果也證實了這一點。

3.4 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中抗氧化指標的影響

機體內(nèi)的SOD、GSH-Px和CAT等活性氧清除酶共同作用來維持機體氧化和抗氧化的動態(tài)平衡，其活性的高低反映了機體抵御氧化應激清除自由基的能力[19]。MDA作為脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物之一，是活性氧誘導氧化應激的指標，可以反映出動物體內(nèi)氧化損傷的程度。研究表明，NCG或精氨酸可以提高大鼠[20]、營養(yǎng)受限的綿羊[21]、斷奶仔豬[22]機體的抗氧化能力。張桂杰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在灘羊飼糧中添加瘤胃保護型NCG，灘羊血清中T-AOC和GSH-Px活性得到了顯著提高，并顯著降低了MDA的含量。本試驗結(jié)果顯示，在試驗第21天，飼糧添加NCG對伊犁母馬血漿中SOD、GSH-Px活性和MDA含量無顯著影響，但SOD、GSH-Px活性有升高的趨勢，MDA含量有降低的趨勢；在分娩后(試驗第45天)，血漿中SOD、GSH-Px的活性無顯著變化，但MDA含量極顯著降低。NOS在機體內(nèi)不僅起到催化精氨酸生成NO的作用，在一定程度上也產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，精氨酸不能滿足機體自身代謝的情況下，可能會產(chǎn)生O2-，且精氨酸在機體內(nèi)存在多種代謝途徑，其中代謝產(chǎn)物胍基丁胺是自由基清除劑[24]，具有一定的抗氧化作用，這可能是在血漿中SOD、GSH-Px的活性無顯著變化的情況下而導致分娩后血漿MDA含量降低的原因。

3.5 妊娠后期飼糧中添加NCG對伊犁母馬血漿中GH、IGF-1含量的影響

GH是垂體分泌的多肽，在促進脊椎動物體細胞生長方面發(fā)揮著重要的作用，同時還參與機體的代謝、免疫和生殖等過程[25-26]。胰島素樣生長因子具有復雜的生物學功能，在細胞分化、增殖、動物生長和代謝中發(fā)揮著重要的作用，尤其是在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著特別重要的作用[27-28]。母馬的營養(yǎng)攝入會影響卵巢卵泡液和血漿中胰島素樣生長因子與GH的含量，進而影響機體葡萄糖、胰島素、促性腺激素和孕酮的分泌；營養(yǎng)攝入良好時，血漿IGF-1含量較高，GH含量較低，但在營養(yǎng)不良的馬機體內(nèi)則相反[29]。精氨酸在機體代謝過程中生成的胍基乙酸對GH和胰島素樣生長因子具有一定的調(diào)節(jié)作用。在本試驗中，飼糧添加NCG在分娩前有提高血漿中IGF-1含量的趨勢，分娩后IGF-1含量呈降低趨勢，這可能與分娩后能量負平衡或分娩前后精氨酸在機體代謝途徑發(fā)生變化有關。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，在伊犁母馬妊娠后期飼糧中添加NCG可提高新生馬駒的初生重、體尺參數(shù)及改善母馬分娩后的妊娠率，還可提高妊娠后期母馬血漿中TNOS、iNOS、eNOS活性和NO含量。因此，NCG可作為營養(yǎng)調(diào)控劑，應用于繁殖母馬妊娠后期或分娩后改善母馬的繁殖力。