周亞楠 馮宇哲 楊得玉 劉書杰 崔占鴻

(青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，農業(yè)農村部青藏高原放牧牦牛藏羊動物營養(yǎng)與飼草料重點實驗室，青海省牦牛工程技術研究中心，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，西寧810016)

在成年反芻動物的瘤胃內棲息著大量微生物，致使瘤胃內環(huán)境變得較為復雜[1]。因此，對于反芻動物而言，瘤胃微生物極其重要，而對于哺乳期反芻動物，瘤胃微生物區(qū)系在未反芻之前就已建立[2]，但不完善。隨著瘤胃的不斷發(fā)育，對粗纖維的消化會逐漸增強[3]；隨后，瘤胃微生物在反芻動物成長過程會隨著飼糧轉換逐步形成和建立完善的微生物區(qū)系[4]，幼齡反芻動物為了適應環(huán)境和飼糧的變化也會隨之調整優(yōu)勢菌群[5]。在哺乳期給犢牛飼喂開食料的同時添加粗飼料，能夠促進瘤胃快速發(fā)育，縮短犢牛斷奶時間。不同來源的粗飼料所含的營養(yǎng)物質也有所差異，因此，不同來源的粗飼料對哺乳期反芻動物的影響是不同的[6]。尤其是瘤胃微生物主要由飼料的結構決定[7]，故在反芻動物幼齡期飼喂不同的粗飼料必定會影響反芻動物瘤胃細菌群落的豐富性[8]。對于反芻動物，瘤胃的發(fā)育極其關鍵，瘤胃微生物主要的作用是促進瘤胃發(fā)育并通過分泌各種酶來降解飼糧中的粗飼料[9-10]，從而進一步調控反芻動物機體的生長發(fā)育[11]。

在青藏高原傳統(tǒng)的飼養(yǎng)管理模式下，冷季時天然牧草的質量急劇降低，嚴重限制了犢牛的營養(yǎng)攝入水平，從而導致放牧幼畜掉膘甚至成為僵牛。為了提高牦牛犢牛的生長性能，改善飼糧營養(yǎng)結構，本研究選用苜蓿干草替代青海地方性資源中禾本科的燕麥干草；而苜蓿干草屬于典型的豆科牧草，營養(yǎng)物質含量豐富，能夠提高反芻動物的免疫能力。因此，本試驗旨在研究苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛生長性能、血清生化指標及瘤胃發(fā)酵參數、組織形態(tài)和微生物區(qū)系的影響[12]，探討苜蓿干草作為牦牛犢牛粗飼料的可行性，以期為青藏高原地區(qū)哺乳期牦牛犢牛飼糧營養(yǎng)結構與科學配制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取21只體重[(36.47±0.99) kg]相近、健康的45日齡牦牛公犢牛，采用隨機區(qū)組設計分為3組，每組7頭牛。各組在代乳粉和開食料的基礎上飼喂粗飼料，苜蓿干草組(AH組)飼喂苜蓿干草，燕麥干草組(OH組)飼喂燕麥干草，苜蓿干草+燕麥干草組(AO組)飼喂苜蓿干草+燕麥干草(苜蓿草干∶燕麥干草=1∶1)，3組的粗精比均7∶3(粗飼料∶開食料)。預試期21 d，正試期120 d。

1.2 試驗飼糧

3組的代乳粉、開食料和干草飼喂量一致，代乳粉和開食料來自北京標準動物營養(yǎng)研究中心，苜蓿干草來自甘肅省張掖市，燕麥干草來自青海省海晏縣。開食料組成見表1，代乳粉、開食料、苜蓿干草和燕麥干草營養(yǎng)水平見表2。

表1 開食料組成(干物質基礎)

表2 代乳粉、開食料、苜蓿干草和燕麥干草營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗時間2021年8—12月，飼養(yǎng)試驗于青海省海北州海晏縣高原現代生態(tài)畜牧業(yè)科技試驗示范園進行。牦牛犢牛單欄飼養(yǎng)，預試期代乳粉早、中、晚(08:30、12:30、16:30)各飼喂1次，正試期代乳粉早、晚(08:30、16:30)各飼喂1次。在預試期前1周內，為減少犢牛應激，將牦牛奶與代乳粉按比例使用奶瓶飼喂，代乳粉比例從20%逐漸增大至100%，需將沖泡代乳粉的沸水冷卻至42 ℃，代乳粉與水按1∶5比例配制。正式試驗開始后，代乳粉添加量為0.48 kg/d，每隔7 d增加15 g；粗飼料添加量為140 g/d，每隔7 d增加70 g；開食料添加量為70 g/d，每隔7 d增加30 g。為了模擬哺乳環(huán)境，代乳粉遵循代乳粉飼養(yǎng)標準，在每個階段的規(guī)定攝入量內不限制其攝入。為了保證每頭牦牛犢牛開食料攝入量一致，先飼喂開食料后飼喂粗飼料，待粗飼料和開食料攝入量達到1 kg時進行斷奶并屠宰。

1.4 樣品采集和指標測定

1.4.1 生長性能測定

試驗開始和結束時稱量牦牛犢牛體重，記錄耗料量，計算初始體重、終末體重、干物質采食量、平均日增重和料重比；屠宰前1天，測量牦牛犢牛體高、體斜長、管圍、胸圍。

1.4.2 樣品采集

牦牛犢牛于屠宰前1天16：00后斷食斷水，翌日清晨使用采血針從牦牛犢牛頸靜脈采血至肝素鈉采血管，采集3管，每管5 mL，靜置后置于離心機中4 000 r/min離心10 min，取上層血清置于凍存管中，于-80 ℃保存待測，采血后進行稱重、屠宰。

在瘤胃內部取瘤胃液，用4層紗布過濾后應當立即測定pH，之后分裝在離心管內立即投入液氮進行保存，用于后續(xù)瘤胃發(fā)酵參數測定和16S rRNA高通量測序。取瘤胃腹囊組織塊約2 cm×2 cm，用0.9%生理鹽水洗凈后存放于4%的多聚甲醛溶液，用于后續(xù)制備石蠟切片進行組織形態(tài)學觀察。

1.4.3 血清生化指標測定

血清樣品送至青海省第一人民醫(yī)院進行檢測，采用全自動生化分析儀，測定指標為白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLB)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，CRE)、總蛋白(total protein，TP)。

1.4.4 瘤胃發(fā)酵指標測定

氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用比色法[13]，使用TU-1810紫外可見分光光度計進行測定。微生物蛋白(microbial proteins，MCP)含量采用考馬斯亮藍法[14]，使用分光光度計進行測定。揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)含量采用氣相色譜儀(GC-2014，日本島津公司)進行測定[15]，氣相色譜條件為：載氣為氮氣(N2)，分流比為40∶1，進樣量為1 μL，進樣孔溫度為250 ℃，輔助箱溫度為250 ℃，氣化室溫度為250 ℃，火焰離子化檢測器(FID)溫度為250 ℃，色譜柱型號為AT-FFAP毛細管填充柱(30.0 m×0.32 μm)。恒流模式，流量2.1 mL/min，平均線速度38 cm/s，柱壓11.3 psi(0.1 mPa)。

1.4.5 瘤胃組織形態(tài)測定

采用蘇木精-伊紅(HE)染色法制備石蠟切片后在Olympus BX53電子顯微鏡下觀察并測量瘤胃腹囊的黏膜上皮厚度、黏膜下層厚度、乳頭寬度、乳頭高度、肌層厚度以及漿膜層厚度。

1.4.6 瘤胃微生物區(qū)系測定

將1管5 mL的瘤胃液樣品在干冰條件下儲存運輸至北京諾和致源生物技術公司，在Illumina MiSeq平臺上對瘤胃液的細菌擴增子進行測序。文庫構建使用的試劑盒是TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit。一般流程為樣品準備、DNA提取與檢測、PCR擴增、產物純化、文庫制備及庫檢、NovaSeq上機檢測。使用通用引物V341F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和V806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對微生物基因組總DNA的16S rRNA V3～V4高變區(qū)進行PCR擴增，經檢驗合格后進行上機測序。得到的下機數據經過對各樣本的數據進行均一化處理，進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

1.5 數據處理與統(tǒng)計分析

試驗原始數據經Excel 2016初步整理后，再經SPSS 20.0軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。結果以平均值±標準差表示，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛生長性能和體尺指標的影響

由表3可知，3組之間初始體重、體斜長、體高、胸圍、管圍、干物質采食量和平均日增重均差異不顯著(P>0.05)。AO組的終末體重、瘤胃重顯著高于AH組和OH組(P<0.05)，AH組和OH組的料重比顯著高于AO組(P<0.05)。

表3 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛生長性能和體尺指標的影響

2.2 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛血清生化指標的影響

由表4可知，3組之間血清ALP、ALT、AST活性和GLB、TP含量均差異不顯著(P>0.05)。AO組和AH組的血清ALB含量顯著高于OH組(P<0.05)，AO組的血清CRE含量顯著高于AH組和OH組(P<0.05)。

表4 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛血清生化指標的影響

2.3 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵參數的影響

由表5可知，3組之間瘤胃MCP、丙酸含量均差異不顯著(P>0.05)。AO組的瘤胃乙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量和乙酸/丙酸極顯著高于AH組和OH組(P<0.01)，AO組的瘤胃NH3-N含量顯著高于OH組(P<0.05)。

表5 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵參數的影響

2.4 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃組織形態(tài)的影響

由圖1和表6可知，AO組的瘤胃肌層厚度顯著高于AH組和OH組(P<0.05)，AO組的瘤胃黏膜上皮厚度、黏膜下層厚度、乳頭高度、乳頭寬度和漿膜層厚度極顯著高于AH組和OH組(P<0.01)。

表6 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃組織形態(tài)的影響

A：黏膜上皮 mucosal epithelium；B：黏膜肌層 mucosal muscle layer；C：黏膜下層submucous layer；D：肌層 muscular layer；E：漿膜 plasma membrane。

2.5 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.5.1 操作分類單元(OTU)聚類及基礎分析結果

樣品經高通量測序后，統(tǒng)計分析得到每個樣品的OUT數目和代表序列。本試驗共15個樣品，以97%的一致性將樣品聚類成OTU，數據處理后平均每個樣品測得80 493條原始序列，質控后每個樣品平均57 345條有效序列，質控有效率為71.29%。

2.5.2 Venn圖

由圖2可知，AH組、OH組和AO組的OTU數目分別為2 599、2 537、2 914個，3組相同的OTU數目為679個，AH組、OH組和AO組特有的OTU數目分別為1 174、1 260、1 093個。

RSA代表苜蓿干草組，RSO代表燕麥干草組，RSAO代表苜蓿干草+燕麥干草組。下圖同。

2.5.3 Alpha多樣性指數

由表7和圖3可知，3組覆蓋率均為1.00，測序深度已經是飽和狀態(tài)，說明測序結果可代表樣品中微生物的真實信息。AO組的OTU數目顯著高于AH組和OH組(P<0.05)。3組之間的Chao1指數、覆蓋率、Shannon指數、Simpson指數均無顯著差(P>0.05)。

表7 哺乳期牦牛犢牛瘤胃微生物OTU數目和Alpha多樣性指數分析

圖3 覆蓋率圖

2.5.4 瘤胃微生物優(yōu)勢菌門和菌屬相對豐度

由表8可知，在門水平上，3組瘤胃微生物優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門，AO組和OH組的瘤胃擬桿菌門、光古菌門相對豐度顯著高于AH組(P<0.05)。在屬水平上，AO組和OH組的瘤胃歐魯森氏菌屬相對豐度顯著高于AH組(P<0.05)，AO組的瘤胃普雷沃氏菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、甲烷短桿菌屬相對豐度顯著高于AH組和OH組(P<0.05)，AO組的瘤胃普雷沃氏菌科UCG-001相對豐度極顯著高于AH組和OH組(P<0.01)，AH和OH組的瘤胃梭菌屬UCG-014相對豐度顯著高于AO組(P<0.05)。

表8 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃微生物優(yōu)勢菌門和菌屬相對豐度的影響

3 討 論

3.1 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛生長性能的影響

犢牛在哺乳期的營養(yǎng)對后續(xù)發(fā)育極為重要，尤其在發(fā)育后期，攝入的飼糧將使瘤胃快速發(fā)育[16]。在哺乳期給犢牛飼喂粗飼料，飼糧中的粗纖維能夠促進瘤胃發(fā)育，增強對粗飼料的消化，加大采食量[3,17-19]。研究表明，粗飼料來源不同，犢牛的采食量、生長發(fā)育也不同[20-21]。研究表明，犢牛飼喂燕麥干草和苜蓿干草組合相較于單獨飼喂苜蓿干草，其發(fā)育及消化更好[22]。本試驗中，3組干物質采食量相同，這與Daneshvar等[23]和Thomas等[24]研究發(fā)現不同粗飼料來源飼糧不影響反芻動物的干物質采食量的結果一致；3組的體尺指標差異不顯著，這與周芳芳[25]研究發(fā)現粗飼料對犢牛體尺影響不顯著的結果一致；AO組的終末體重顯著高于AH組和OH組，說明在補飼開食料基礎上飼喂混合干草可以有效增加哺乳期犢牛的體重，這與任春燕等[26]研究發(fā)現粗飼料能夠促進犢牛發(fā)育的結果一致；AO組的瘤胃重顯著高于AH組和OH組，這與崔利宏等[27]研究發(fā)現混合干草更能夠促進犢牛發(fā)育以及Tamate等[28]研究發(fā)現粗飼料能夠促進反芻動物前胃發(fā)育的結果一致。因此，飼喂混合干草相較于單一干草而言更能促進哺乳期牦牛犢牛發(fā)育。

3.2 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛血清生化指標的影響

血清生化指標是動物生長過程中健康和營養(yǎng)物質消化吸收狀況的直接反映[29-31]。其中TP由ALB、GLB構成，三者可以反映動物機體對營養(yǎng)物質的代謝情況[32]，能夠反映蛋白質合成與分解速率，并維持血管內的平衡[33]，還能夠提高機體的免疫力；ALP、ALT、AST等是肝臟功能的直接反映，可以監(jiān)測肝臟是否被損傷；CRE則能夠反映機體攝入的營養(yǎng)狀況，監(jiān)測動物的腎臟功能是否正常[32]。本研究無論飼喂單一干草還是混合干草，ALP、ALT和AST活性以及GLB和TP含量均差異不顯著，表明飼喂的干草未損傷犢牛肝臟，飼喂混合干草在哺乳期犢牛生長期間是可行的，能夠給犢牛提供均衡的營養(yǎng)，這與趙淑敏等[34]、周明等[35]、周亞楠等[36]的研究結果一致。本研究發(fā)現，在開食料的基礎上對哺乳期牦牛犢牛飼喂不同的干草能對血清ALB、CRE含量造成一定的影響，AO組和AH組的血清ALB含量顯著高于OH組，AO組的血清CRE含量顯著高于AH組和OH組，說明飼喂組合干草相較于單一干草更能加強哺乳期牦牛犢牛對蛋白質合成和分解以及增強腎臟功能，促進機體代謝，進而提高飼料轉化率。

3.3 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵指標的影響

反芻動物攝入粗飼料后，瘤胃內微生物的菌群活動會改變，瘤胃液pH也會隨之改變[37]，反芻動物攝入粗飼料后，瘤胃內環(huán)境的改變可能會影響其正常的生長發(fā)育，通過瘤胃液pH能直觀地表現瘤胃健康狀態(tài)[27]，并綜合反映瘤胃微生物活動以及生成VFA情況[38]。通常情況下，反芻動物瘤胃液的pH在6.0～7.5[28]，本試驗瘤胃液pH為6.69～7.04，表明本研究的3組瘤胃發(fā)酵均處于正常水平。有研究顯示，適合瘤胃內消化粗飼料的纖維素分解菌生存的pH應在6.2～6.8[1]，本研究的瘤胃液pH在這一區(qū)間內，說明3組的瘤胃內環(huán)境適合微生物生存。VFA是反芻動物瘤胃發(fā)酵最為重要的物質，通過瘤胃吸收后為機體提供了總能量需要的60%～70%[39]。本研究中，AO組的瘤胃TVFA、乙酸、丙酸含量高于另AH組和OH組，說明飼喂組合干草能促進哺乳期牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵，所含的飼糧營養(yǎng)成分更利于乙酸和丙酸生成。蛋白質和脂肪含量較高的粗飼料能夠促進TVFA的生成，而OH組的蛋白質和脂肪含量較低，故其瘤胃TVFA含量較低。瘤胃微生物所需的氮主要來自NH3-N[40]。本研究中，AO組的牦牛瘤胃NH3-N含量最高，OH組最低，說明飼喂組合干草能促進瘤胃微生物對NH3-N的利用，這與Pazoki等[41]研究結果一致；3組的瘤胃MCP含量差異不顯著，說明飼喂不同粗飼料對MCP的合成影響較小或者無影響，這與Van Dung等[42]研究結果一致。

3.4 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃組織形態(tài)的影響

哺乳期是犢牛瘤胃發(fā)育重要階段，研究表明攝入粗飼料能促進犢牛瘤胃發(fā)育，使其重量快速增加，組織形態(tài)發(fā)育完全，在空腹體重時所占比例增大[43]。瘤胃能有效地幫助反芻動物將飼糧進行均勻的攪拌和揉搓，吸收VFA后通過糖異生環(huán)節(jié)為動物提供能量來源。動物攝入粗飼料后，一方面經瘤胃發(fā)酵產生乙酸、丙酸等被反芻動物吸收；另一方面則可以刺激瘤胃乳頭發(fā)育[44]。本研究中，AO組的瘤胃乳頭寬度、乳頭高度發(fā)育較好，說明飼喂組合干草相較于單一干草更能夠有效促進哺乳期牦牛犢牛瘤胃乳頭的發(fā)育。瘤胃肌層能夠使瘤胃產生胃蠕動，進而產生反芻行為。本試驗中，AO組的瘤胃肌層和漿膜層發(fā)育相比于其他2組要好，同樣表明飼喂組合干草相較于單一干草能刺激瘤胃肌層發(fā)育并促進瘤胃進行反芻行為[28,45-46]。因此，從上述結果來看，飼喂組合干草的牦牛犢牛瘤胃發(fā)育最好。

3.5 苜蓿干草、燕麥干草及二者混合飼喂對哺乳期牦牛犢牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

反芻動物攝入粗飼料后，瘤胃微生物能夠將其進行發(fā)酵，產生機體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)，并保證瘤胃的健康發(fā)育。但在攝入粗飼料的同時，也要考慮瘤胃內環(huán)境隨之變化后能否適應瘤胃微生物生存，因為在一定范圍內瘤胃微生物會隨攝入的飼糧而發(fā)生改變，從而保持瘤胃內環(huán)境的穩(wěn)定性。因此，從微生物角度研究粗飼料對瘤胃的變化，對于前期瘤胃發(fā)酵指標的結果更能準確、科學進行解釋。而Chanthakhoun等[47]在水牛飼養(yǎng)中發(fā)現，添加不同的粗飼料可以改變瘤胃菌群的相對豐度。本研究中，AO組的瘤胃OTU數目顯著高于AH組和OH組，與上述研究結果一致。

在門水平上，大量研究表明，反芻動物瘤胃菌群中相對豐度最高的是厚壁菌門和擬桿菌門[48-50]，本研究得出了一致的結果。研究發(fā)現，厚壁菌門參與碳水化合物的分解與代謝[51]，擬桿菌門主要分解瘤胃中非纖維素[52]，如能夠將飼糧中的可溶性多糖降解為琥珀酸，并在瘤胃內經過脫羧反應快速產生丙酸[53]。AO組瘤胃擬桿菌門和光古菌門相對豐度顯著高于AH組，可能是因為AO組飼糧中粗纖維含量比AH組高。

在屬水平上，本研究中AO組的瘤胃普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科UCG-003、克里斯滕森菌科R-7群和甲烷短桿菌屬相對豐度顯著高于AH組和OH組。Tian等[15]研究發(fā)現，粗飼料來源不同，營養(yǎng)成分不同，瘤胃普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科UCG-003相對豐度會有差異，這與本試驗結果一致。普雷沃氏菌屬是反芻動物瘤胃擬桿菌門中最豐富的一個屬，其相對豐度在成年反芻動物瘤胃中保持相對的穩(wěn)定性，它主要受到飼糧組成和營養(yǎng)水平的影響。Jami等[50]研究發(fā)現，草飼牛瘤胃普雷沃氏菌屬相對豐度較高，與本試驗研究結果一致。本研究中，AO組的瘤胃克里斯滕森菌科R-7群和甲烷短桿菌屬相對豐度顯著高于AH組和OH組，克里斯滕森菌科R-7群能調節(jié)瘤胃健康，甲烷短桿菌屬能夠提高瘤胃內纖維素酶活性，說明飼喂組合干草相較于飼喂單一干草更能增加反芻動物對纖維的利用率。AH組和OH組的瘤胃梭菌_UCG-014相對豐度高于AO組，可能是由于AH組飼糧蛋白質含量高于AO組或者OH組飼糧纖維含量略高于AO組，具體影響因素需要后續(xù)的深度挖掘。因此，飼喂苜蓿干草和燕麥干草組合，提高了瘤胃微生物的整體相對豐度，說明哺乳期牦牛犢牛飼喂組合干草的效果最好。

4 結 論

綜上所述，采用飼喂代乳粉方式培育哺乳期牦牛犢牛，在開食料的基礎上同時飼喂苜蓿干草和燕麥干草提高了牦牛犢牛體重，改變了瘤胃微生物菌群多樣性及相對豐度，正向調控了瘤胃形態(tài)和功能的發(fā)育，為青藏高原地區(qū)牦牛犢牛在粗飼料組合飼糧的應用提供了重要參考。