郝文君 薛國良 劉書杰 郭文杰 張玉瑩 焦 洋 崔占鴻

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原放牧牦牛藏羊動(dòng)物營養(yǎng)與飼草料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

牦牛是青藏高原的優(yōu)勢家畜，被譽(yù)為“高原之舟”，是牧民生產(chǎn)、生活和經(jīng)濟(jì)的重要來源之一[1]。每年4～6月，母牦牛集中產(chǎn)犢，犢牛出生后采用隨母哺乳放牧的飼喂方式進(jìn)行早期培育[2]。母牦牛日平均產(chǎn)乳量僅為1.75 kg，且隨著青藏高原進(jìn)入冷季，牧草的質(zhì)量和數(shù)量急劇下降，母乳和牧草中的營養(yǎng)物質(zhì)供給不足，不能滿足犢牛的生長發(fā)育需求[3]，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，進(jìn)而影響犢牛對應(yīng)激以及疾病的抵抗力和恢復(fù)力[4-5]。犢牛易發(fā)各種疾病，使?fàn)倥５脑缙谏L發(fā)育質(zhì)量降低，影響牦牛犢牛的高效培育[6]。

營養(yǎng)與免疫存在著緊密的聯(lián)系，營養(yǎng)水平的高低影響動(dòng)物機(jī)體的免疫力，動(dòng)物免疫力高低又影響動(dòng)物的生長性能[7]。在免疫系統(tǒng)建立建全過程中營養(yǎng)物質(zhì)至關(guān)重要[8]。哺乳動(dòng)物幼畜時(shí)期，營養(yǎng)供給失調(diào)時(shí)，機(jī)體首先會(huì)保證腦組織的發(fā)育和保證機(jī)體存活，而胸腺等發(fā)育較快的器官會(huì)重量減輕，對胸腺造成實(shí)質(zhì)性損傷，進(jìn)而影響其免疫功能[9]。機(jī)體營養(yǎng)不良時(shí)，脾臟血管周圍免疫細(xì)胞數(shù)量減少，不同程度損害單核巨噬細(xì)胞的游走功能，影響脾臟的免疫和消化功能[10]。胸腺和脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，對于機(jī)體整體免疫狀態(tài)具有重要意義。開食料是斷奶前后為滿足犢?；蚋嵫蛏L發(fā)育需要專門配制的混合精料，對犢牛由液體向固體飼料過渡、早期斷奶和后期生長發(fā)育有著重要意義[11]。轉(zhuǎn)錄組測序是指利用高通量測序方法，研究特定的細(xì)胞、組織或個(gè)體在特定時(shí)間和狀態(tài)下所轉(zhuǎn)錄出的所有mRNA，用于揭示不同功能狀態(tài)下的基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)的差異，闡明分子機(jī)制[12]。目前有關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛胸腺和脾臟免疫機(jī)能的影響的報(bào)道很少。因此，本研究以早期斷奶的牦牛犢牛為研究對象，以開食料為切入點(diǎn)，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛胸腺和脾臟部分免疫機(jī)能的相關(guān)機(jī)制，以期為后期牦牛犢牛早期健康培育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與時(shí)間

牦牛犢牛購自青海省大通牛場，飼養(yǎng)試驗(yàn)在青海省海北州海晏縣高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技試驗(yàn)示范園進(jìn)行。試驗(yàn)期為2020年7月14日至2020年11月21日，共計(jì)130 d，預(yù)試期為30 d，正式試驗(yàn)期100 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選取20頭出生日齡[(30±4)日齡]及體重[(30.79±3.43) kg]相近、健康的大通牦牛犢牛(公)，隨機(jī)分為2組。對照組(CON組)飼喂代乳粉和苜蓿干草，試驗(yàn)組(SS組)在CON組的基礎(chǔ)上補(bǔ)飼開食料，2組每天代乳粉飼喂量相同，CON組飼喂的苜蓿干草和SS組飼喂的苜蓿干草+開食料的干物質(zhì)量相同，當(dāng)固體物質(zhì)的干物質(zhì)采食量達(dá)到1 kg時(shí)(此時(shí)犢牛在160日齡左右)，牦牛犢牛斷奶，2組各屠宰5頭牦牛犢牛。

代乳粉飼喂時(shí)間為每日08:00、14:00和17:00，用煮沸后冷卻到42 ℃的溫水按代乳粉和水1∶5的比例沖泡進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)正式開始時(shí)，代乳粉飼喂量為0.48 kg/(頭·d)，代乳粉每5 d增加0.01 kg，飼喂方法與郭文杰等[5]一致；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，代乳粉飼喂量為0.72 kg/(頭·d)。30～80日齡SS組牦牛犢牛按苜蓿干草與開食料2∶1比例飼喂，81～160日齡SS組牦牛犢牛按苜蓿干草與開食料1∶1比例飼喂，試驗(yàn)飼糧營養(yǎng)水平見表1，不同日齡飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。試驗(yàn)犢牛為單圈飼養(yǎng)，圈舍始終保持衛(wèi)生良好，通風(fēng)良好，定期消毒。代乳粉和開食料均采購自北京精準(zhǔn)動(dòng)物營養(yǎng)研究中心。

表1 試驗(yàn)飼糧營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 不同日齡飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集及測定指標(biāo)

1.3.1 采食量和體重

正式試驗(yàn)期第1天和第100天晨飼前稱量牦牛犢牛體重，計(jì)算平均日增重(ADG)，每日記錄牦牛犢牛的采食量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

平均日增重=(初始體重-終末體重)/試驗(yàn)天數(shù)；
料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序

牦牛犢牛屠宰前1天禁食，屠宰10頭牦牛犢牛，采取脾臟和胸腺組織，放入液氮中保存，待測。將10頭牦牛犢牛胸腺和脾臟組織樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，使用動(dòng)物Trizol(Ambion/Invitrogen，美國)總RNA提取試劑盒提取樣本的總RNA，隨后對RNA樣品進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，質(zhì)控方式主要是通過Agilent 2100 Bioanalyzer精確檢測RNA完整性，總RNA質(zhì)檢合格后，構(gòu)建文庫。先使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，利用Illumina NovaSeq 6000(Illumina，美國)進(jìn)行雙端測序，得到測序數(shù)據(jù)。

1.3.3 參考基因組序列比對

測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估后得到質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，在HISAT2軟件上與野牦牛參考基因組(Bos_mutus_GCF_000298366.1)對比，得到樣本基因。

1.3.4 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選注釋及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)驗(yàn)證

用DESeq R軟件包(1.10.1)分析轉(zhuǎn)錄組在條件不同時(shí)的差異表達(dá)，計(jì)算log2FC及其統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的P值，以P-adjust≤0.05和|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。通過GO數(shù)據(jù)庫和京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋分析，分析DEGs參與的信號通路。

從脾臟和胸腺DEGs中各隨機(jī)挑選出5個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，使用動(dòng)物Trizol(TaKaRa)總RNA提取試劑盒提取樣本的總RNA(具體操作流程按照試劑盒進(jìn)行)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA稀釋成50 ng/μL，進(jìn)行qRT-PCR。引物均由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。儀器為ABI OuantStudio 6 qRT-PCR儀。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；擴(kuò)增95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s,40個(gè)循環(huán)；采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，用Primer3 Plus網(wǎng)站設(shè)計(jì)定量PCR引物序列，每個(gè)樣本3次生物學(xué)重復(fù)。表3為胸腺組織qRT-PCR所用引物，表4為脾臟組織qRT-PCR所用引物。

表3 胸腺組織qRT-PCR所用引物

表4 脾臟組織qRT-PCR所用引物

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019初步處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)比較數(shù)據(jù)差異性，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)飼開食料對早期斷奶牦牛犢牛生長性能的影響

由表5可知，SS組牦牛犢牛平均日采食量、凈增重和平均日增重均顯著高于CON組(P<0.05)，SS組牦牛犢牛料重比顯著低于CON組(P<0.05)。

表5 補(bǔ)飼開食料對早期斷奶牦牛犢牛生長性能的影響

2.2 補(bǔ)飼開食料對早期斷奶牦牛犢牛的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

2.2.1 堿基質(zhì)量分布檢查

檢測原始序列錯(cuò)誤率分布情況，Illumina的堿基質(zhì)量值用Qphred表示。牦牛胸腺、脾臟組織樣品的Q20均在96.52%以上，說明在測序時(shí)正確識別率大于99%的堿基總數(shù)占所測定的堿基總數(shù)的96.52%；Q30均在91.03%以上，說明在測序時(shí)正確識別率大于99%的堿基總數(shù)占所測定的堿基總數(shù)的91.03%。測序結(jié)果顯示，每個(gè)胸腺、脾臟組織樣品的clean bases總數(shù)均大于6.09 G，GC含量在48.71%～50.49%，表明測序質(zhì)量較高，結(jié)果較可靠。

2.2.2 測序數(shù)據(jù)比對分析

將每個(gè)胸腺、脾臟組織樣品的clean reads與參考基因組對比，定位到基因組上的測序序列的比例大于92.33%，每個(gè)胸腺組織樣品測序的clean reads與參考基因組的比對率均達(dá)到90.11%以，說明測序結(jié)果可靠，可以用于后續(xù)分析。

2.2.3 主成分分析(PCA)

所有樣本的基因表達(dá)值(FPKM)進(jìn)行PCA，如下圖1所示，胸腺組織組內(nèi)樣本聚在一起，組間樣本分散，說明胸腺組織樣品重復(fù)性較好。如下圖2所示，脾臟組織、胸腺組織組內(nèi)樣本聚在一起，組間樣本分散(CP5樣本分散較開，后續(xù)分析中已剔除)，說明脾臟組織樣品重復(fù)性較好，二者都可進(jìn)行后續(xù)分析。

CX1、CX2、CX3、CX4和CX5為CON組5頭牦牛犢牛胸腺組織樣本，EX1、EX2、EX3、EX4和EX5為SS組5頭牦牛犢牛胸腺組織樣本。

CP1、CP2、CP3、CP4和CP5為CON組5頭牦牛犢牛脾臟組織樣本，EP1、EP2、EP3、EP4和EP5為SS組5頭牦牛犢牛脾臟組織樣本。

2.3 DEGs分析及篩選

2.3.1 牦牛犢牛胸腺基因差異表達(dá)及篩選

根據(jù)P-adjust≤0.05和|log2FC|≥1標(biāo)準(zhǔn)篩選樣本的DEGs，由圖3可知，SS組與CON組胸腺對比有2 004個(gè)DEGs，其中有793個(gè)是上調(diào)基因，1 211個(gè)是下調(diào)基因。

圖中橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)；縱坐標(biāo)表示差異結(jié)果的顯著性；EX：SS組胸腺；CX：CON組胸腺；UP：顯著上調(diào)；DOWN：顯著下調(diào)；NO：不顯著。

2.3.2 牦牛犢牛脾臟差異基因表達(dá)及篩選

根據(jù)P-adjust≤0.05和|log2FC|≥1標(biāo)準(zhǔn)篩選樣本的DEGs，由圖4可知，SS組與CON組脾臟對比有772個(gè)DEGs，其中有389個(gè)是上調(diào)基因，383個(gè)是下調(diào)基因。

2.4 GO聚類分析

2.4.1 牦牛犢牛胸腺差異基因的GO富集分析

以P-adjust<0.05作為顯著性富集的閾值，進(jìn)行GO功能富集分析，圖5為SS組和CON組胸腺差異基因GO富集情況，從圖中可以看出DEGs在生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三大類上均有所富集，DEGs注釋到796條GO條目，其中BP類別414條，CC類別100條，MF類別282條。在BP功能中，2組間胸腺的DEGs在細(xì)胞表面受體信號通路、細(xì)胞黏附、生物黏附、多細(xì)胞生物過程、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞分化、三磷酸腺苷生物合成過程、Notch信號通路、細(xì)胞周期過程等富集最多；在CC功能中，2組間胸腺DEGs在超分子復(fù)合物、超分子聚合物、超分子纖維、聚合細(xì)胞骨架纖維、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞骨架、細(xì)胞外區(qū)域部分、中間絲、中間絲細(xì)胞骨架等富集最多；在MF功能中，2組間胸腺DEGs在鈣離子結(jié)合、分子功能調(diào)節(jié)劑、酶調(diào)節(jié)劑活性、酶抑制劑活性、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、肽酶抑制劑活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、透明質(zhì)酸結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等方面富集最多。

Category：類別；BP：生物過程 biological process；CC：細(xì)胞組分 component of cell；MF：分子功能 molecular function；P-adjust: P值矯正之后的數(shù)值 The P-value is the value after correction; Cell surface receptor signaling pathway：細(xì)胞表面受體信號通路；Cell adhesion：細(xì)胞黏附；Biological adhesion：生物黏附；Multicellular organismal process：多細(xì)胞生物過程；Cell cycle：細(xì)胞周期；Cytoskeleton organization：細(xì)胞骨架組織；Cell differentiation：細(xì)胞分化；ATP biosynthetic process：ATP生物合成過程；Notch signaling pathway：Notch信號通路；Cell cycle process：細(xì)胞周期過程；Supramolecular complex：超分子復(fù)合物；Supramolecular polymer：超分子聚合物；Supramolecular fiber：超分子纖維；Polymeric cytoskeletal fiber：聚合細(xì)胞骨架纖維；Extracellular region：細(xì)胞外區(qū)域；Cytoskeleton：細(xì)胞骨架；Extracellular region part：胞外區(qū)部分；Intermediate filament：中間絲；Intermediate filament cytoskeleton：中間絲細(xì)胞骨架；Extracellular matrix：細(xì)胞外基質(zhì)；Calcium ion binding：鈣離子結(jié)合；Molecular function regulator：分子功能調(diào)節(jié)劑；Enzyme regulator activity：酶調(diào)節(jié)活性；Enzyme inhibitor activity：酶抑制劑活性；Chemokine activity：趨化因子活性；Chemokine receptor binding：趨化因子受體結(jié)合；Peptidase inhibitor activity：肽酶抑制劑活性；Peptidase regulator activity：肽酶調(diào)節(jié)劑活性；Hyaluronic acid binding：透明質(zhì)酸結(jié)合；G-protein coupled receptor binding：G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合。

2.4.2 牦牛犢牛脾臟差異表達(dá)基因的GO富集分析

由圖6可知，以P-adjust<0.05作為顯著性富集的閾值，進(jìn)行GO功能富集分析，SS組和CON組脾臟間的DEGs注釋到582條GO條目，其中BP類別331條，CC類別201條，MF類別50條。在BP功能中，2組間脾臟的DEGs在有機(jī)氮化合物生物合成方法、翻譯、肽生物合成過程、酰胺生物合成過程、肽代謝過程、細(xì)胞酰胺代謝過程等過程富集最多；在CC功能中，2組間脾臟DEGs在核糖體、核糖核蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞外區(qū)域部分、非膜界細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)非膜界細(xì)胞器等富集最多；在MF功能中，2組間脾臟DEGs在核糖體的結(jié)構(gòu)成分、作用于糖苷鍵的水解酶活性、結(jié)構(gòu)分子活性、三磷酸腺苷酶活性等富集最多。

Category：類別；BP：生物過程 biological process；CC：細(xì)胞組分 component of cell；MF：分子功能 molecular function；P-adjust: P值矯正之后的數(shù)值 The P-value is the value after correction; Organonitrogen compound biosynthetic process: 有機(jī)氮化合物生物合成過程；Translation: 翻譯；Peptide biosynthetic process: 肽生物合成過程；Amide biosynthetic process: 酰胺生物合成過程；Peptide metabolic process: 肽代謝過程；Cellular amide metabolic process: 細(xì)胞酰胺代謝過程；Alpha-amino acid metabolic process: α-氨基酸代謝過程；Phospholipid biosynthetic process: 磷脂生物合成過程；Regulation of biological quality: 生物質(zhì)量；Small molecule biosynthetic process: 小分子生物合成過程的調(diào)控；Ribosome: 核糖體；Ribonucleoprotein complex: 核糖核蛋白復(fù)合體；Cytoplasmic part: 細(xì)胞質(zhì)部分；Extracellular region part: 胞外區(qū)部分；Non-membrane-bounded organelle: 非膜界細(xì)胞器；Intracellular non-membrane-bounded organelle: 細(xì)胞內(nèi)非膜界細(xì)胞器；Endoplasmic reticulum: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Extracellular matrix: 細(xì)胞外基質(zhì)；Endoplasmic reticulum membrane: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；Endoplasmic reticulum subcompartment: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞室；Structural constituent of ribosome: 核糖體的結(jié)構(gòu)成分；Hydrolase activity, acting on glycosyl bonds:作用于糖苷鍵的水解酶活性；Structural molecule activity: 結(jié)構(gòu)分子活性；ATPase activity: ATP酶活性；Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds: 水解酶活性，水解O-糖基化合物；rRNA binding: rRNA結(jié)合；Exopeptidase activity: 外肽酶活性；Primary active transmembrane transporter activity: 初級活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性；P-P-bond-hydrolysis-driven transmembrane transporter activity: P-P-鍵水解驅(qū)動(dòng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性；ATPase activity, coupled to transmembrane: ATP酶活性，偶聯(lián)到跨膜。

2.5 KEGG富集分析

2.5.1 牦牛犢牛胸腺差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

將DEGs進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，如圖7所示，SS組與CON組胸腺共富集到38條差異信號通路，DEGs主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、金黃色葡萄球菌感染、蛋白質(zhì)消化和吸收、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、焦點(diǎn)黏附、軸突導(dǎo)向、組氨酸代謝、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、破骨細(xì)胞分化等代謝途徑、造血細(xì)胞譜系、核因子-κB(NF-κB)信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、瘧疾、細(xì)胞黏附分子、軍團(tuán)桿菌病、阿米巴病、癌癥中的微小核糖核酸、腫瘤壞死因子信號通路等信號通路。

GeneRatio：表示該通路中差異基因富集程度 represents the enrichment degree of differential genes in this pathway；Count:總量；P-adjust：P值矯正之后的數(shù)值 the P-value is the value after correction；TNF signaling pathway: 腫瘤壞死因子信號通路；MicroRNAs in cancer: 癌癥中的微RNAs；Amoebiasis: 阿米巴病；Legionellosis: 軍團(tuán)桿菌病；Cell adhesion molecules (CAMs):細(xì)胞黏附分子；Malaria: 瘧疾；Cytokine-cytokine receptor interaction: 細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；NF-kappa B signaling pathway: NF-κB信號通路；Hematopoietic cell lineage: 造血細(xì)胞譜系；Osteoclast differentiation: 破骨細(xì)胞分化；Pl3K-Akt signaling pathway: Pl3K-Akt信號通路；Histidine metabolism: 組氨酸代謝；Axon guidance: 軸突導(dǎo)向；Focal adhesion: 焦點(diǎn)黏附；Viral protein interaction with cytokines and cytokine receptors: 病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用；Protein digestion and absorption: 蛋白質(zhì)的消化和吸收；Staphylococcus aureus infection: 金黃色葡萄球菌感染；AGE-RAGE signaling pathway in complications of diabetes: 糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路；Proteoglycans in cancer: 癌癥中的蛋白多糖；ECM-receptor interaction: ECM-受體相互作用。

其中與免疫相關(guān)的主要信號通路有PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等信號通路。表6為SS組和CON組胸腺組織主要免疫信號通路對應(yīng)的DEGs。PI3K-Akt信號通路中DEGs數(shù)有52個(gè)，其中上調(diào)的基因主要有白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、G蛋白βγ亞基(Gβγ)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)等，下調(diào)的基因主要有Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)和ECM等；NF-κB信號通路中DEGs數(shù)有42個(gè)，其中上調(diào)的基因主要有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、T細(xì)胞受體(TCR)、泛素結(jié)合酶(ELC)和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)等，下調(diào)的基因主要有腫瘤壞死因子受體超家族成員5(CD40)、腫瘤壞死因子受體作用因子3(TRAF3)、腫瘤壞死因子β-R(LT-βR)和TLR4等。

表6 SS組和CON組胸腺主要免疫信號通路對應(yīng)的差異表達(dá)基因

2.5.2 牦牛犢牛脾臟差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

如圖8所示，SS組與CON組脾臟組織共富集到13條差異信號通路，DEGs主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、果糖和甘露糖代謝、抗原處理和呈遞、逆行內(nèi)源性大麻素信號、糖胺聚糖降解、碳代謝、軍團(tuán)桿菌病、生熱作用、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨生物合成等信號通路。

GeneRatio：表示該通路中差異基因富集程度 represents the enrichment degree of differential genes in this pathway；Count:總量；P-adjust：P值矯正之后的數(shù)值 the P-value is the value after correction；N-glycan biosynthesis:N-聚糖的生物合成；Huntington disease:亨廷頓??；Pentose and glucuronate interconversions:戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化；Biosynthesis of amino acids: 氨基酸的生物合成；Parkinson disease: 帕金森??；Galactose metabolism: 半乳糖代謝；Hematopoietic cell lineage:造血細(xì)胞譜系；Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis:糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨生物合成；Glycine, serine and threonine metabolism:甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；Thermogenesis:生熱作用；Legionellosis:軍團(tuán)桿菌??；Carbon metabolism:碳代謝；Glycosaminoglycan degradation:糖胺聚糖的降解；Retrograde endocannabinoid signaling:逆行內(nèi)源性大麻素信號；Antigen processing and presentation:抗原處理和呈遞；Fructose and mannose metabolism:果糖和甘露糖代謝；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism:乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；Complement and coagulation cascades:補(bǔ)體和凝血級聯(lián)；Oxidative phosphorylation:氧化磷酸化；Protein processing in endoplasmic reticulum:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。

其中與免疫相關(guān)的主要信號通路有補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、抗原處理和呈遞等信號通路。表7為SS組和CON組脾臟組織主要免疫信號通路對應(yīng)的DEGs。補(bǔ)體和凝血級聯(lián)信號通路中DEGs數(shù)有8個(gè)，其中上調(diào)的基因主要有尾鞘蛋白(FI)、血清補(bǔ)體C1q受體(C1qrs)、補(bǔ)體1抑制因子[C1INH(SERPING1)]和補(bǔ)體C3A受體1(C3AR1)，其中下調(diào)的基因主要有血管性血友病因子(VWF)、膜輔蛋白(MCP)、痘病毒磷脂酶蛋白(F13)和纖維蛋白原(FGB)；抗原加工和呈遞信號通路中DEGs數(shù)有9個(gè)，其中上調(diào)的基因主要有熱休克蛋白70(HSP70)、T細(xì)胞表面糖蛋白CD8α鏈(CD8A)、T細(xì)胞表面糖蛋白CD8β鏈(CD8B)、102272312、102278697和102273821，其中下調(diào)的基因主要有肌球蛋白重鏈Ⅰ類分子(MHCⅠ)、novel.1911和102273886。

表7 SS組和CON組脾臟主要免疫信號通路對應(yīng)的差異表達(dá)基因

2.6 DEGs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

2.6.1 SS和CON組胸腺DEGs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證DEGs數(shù)據(jù)，根據(jù)P-adjust≤0.05和|log2FC|≥1，胸腺挑選5個(gè)DEGs，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR檢測到的TLR4、LBP、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3激酶催化亞基β(PIK3CB)、CD40和TNF-α基因相對表達(dá)水平與RNA-Seq數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的一致性(圖9)，表明RNA-Seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效，可用于后續(xù)分析。

TLR4：Toll樣受體4 Toll-like receptor 4；LBP：脂多糖結(jié)合蛋白 LPS-binding protein；PIK3CB：磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3激酶催化亞基β phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit β；CD40：腫瘤壞死因子受體超家族成員5 tumor necrosis factor receptor superfamily member 5；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α。

2.6.2 SS組和CON組脾臟DEGs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證DEGs數(shù)據(jù)，根據(jù)P-adjust≤0.05和|log2FC|≥1，脾臟組織挑選5個(gè)DEGs，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR檢測到的HSP70、NADH脫氫酶亞單位6(ND6)、C3AR1、母體單倍體Ⅰ類分子(MHⅠ)和CD8B基因相對表達(dá)水平與RNA-Seq數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的一致性(圖10)，表明這些RNA-Seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效，可用于后續(xù)分析。

HSP70：熱休克蛋白70 heat shock protein 70；ND6：NADH脫氫酶亞單位6 NADH dehydrogenase subunit 6；C3AR1：補(bǔ)體C3A受體1 complement C3A receptor 1；MHⅠ：母體單倍體Ⅰ類分子 parent haploid class Ⅰ molecule；CD8B：T細(xì)胞表面糖蛋白CD8β鏈 CD8 beta chain of T cell surface glycoprotein。

3 討 論

3.1 補(bǔ)飼開食料對早期斷奶牦牛犢牛生長性能的影響

幼齡時(shí)期是動(dòng)物機(jī)體生長發(fā)育的重要階段，直接影響成年牛的生長性能表現(xiàn)。體重是反映牦牛犢牛生長性能的重要指標(biāo)之一。牦牛傳統(tǒng)放牧生產(chǎn)模式下，犢牛出生后采用隨母哺乳加放牧的方式進(jìn)行培育，此時(shí)放牧草地牧草隨季節(jié)變化，其數(shù)量和營養(yǎng)品質(zhì)大幅降低，導(dǎo)致帶犢母牦牛泌乳量逐漸下降。母乳和天然牧草中的能量、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足牦牛犢牛生長發(fā)育所需，會(huì)造成犢牛生長發(fā)育緩慢，同時(shí)不利于消化道更好發(fā)育[13]。哺乳期犢牛的胃腸道發(fā)育未完善，對粗纖維飼糧利用能力較差，適當(dāng)補(bǔ)充開食料可加快犢牛適應(yīng)植物飼料，提高犢牛采食量從而促進(jìn)其生長發(fā)育，充分發(fā)揮其快速生長的潛力[5,14]，與本試驗(yàn)中補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛的生長性能的研究結(jié)果一致。開食料是一種飼用品質(zhì)優(yōu)良的固體飼料，適口性好，適時(shí)補(bǔ)飼開食料能提高幼齡反芻家畜瘤胃細(xì)菌活性，促進(jìn)粗纖維的降解，加快瘤胃排空速率[15]，提高幼齡動(dòng)物的采食量。已有研究表明，補(bǔ)飼開食料是牦牛犢牛從液體向固體飼料采食的一個(gè)重要過渡，較早采食開食料可以顯著提高犢牛的采食量和生長性能[16]，與本試驗(yàn)補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛的生長性能和平均日采食量結(jié)果相一致。

3.2 補(bǔ)飼開食料調(diào)節(jié)早期斷奶牦牛犢牛胸腺發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

胸腺作為中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化和成熟的場所，對機(jī)體抵抗細(xì)菌、病毒繁殖與新陳代謝有著重要作用[17]。犢牛時(shí)期新陳代謝旺盛，對營養(yǎng)需求高。已有研究證明，在生命早期營養(yǎng)不良時(shí)可觀察到胸腺萎縮和胸腺細(xì)胞凋亡增加[18-19]。開食料營養(yǎng)價(jià)值高，可以刺激犢牛瘤胃及消化道的發(fā)育，補(bǔ)充多種犢牛所需的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，在犢牛時(shí)期補(bǔ)飼開食料提高犢牛營養(yǎng)水平對維持胸腺的正常發(fā)育具有重要意義。本試驗(yàn)應(yīng)用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組方法研究牦牛犢牛補(bǔ)飼開食料胸腺DEGs表達(dá)變化的規(guī)律。在牦牛犢牛生長發(fā)育過程中，補(bǔ)飼開食料和未補(bǔ)開食料胸腺組織基因表達(dá)存在顯著差異。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，胸腺變化的相關(guān)DEGs主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)，信號分子和相互作用過程(ECM-受體相互作用、焦點(diǎn)黏附)，細(xì)胞群落作用過程(黏著斑、緊密連接、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路)，免疫系統(tǒng)(NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路)等通路。

整合素和ECM相互作用，在協(xié)調(diào)細(xì)胞黏附、遷移和增殖等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞遷移影響使ECM誘導(dǎo)的胸腺T細(xì)胞分化[20]。胸腺發(fā)生炎癥時(shí)，ECM成分積累，損害胸腺微環(huán)境，進(jìn)而影響胸腺免疫功能[21]，本研究中，ECM-受體相互作用信號通路下調(diào)，說明補(bǔ)飼開食料提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平不會(huì)損害胸腺的微環(huán)境、影響胸腺免疫功能。PI3K-Akt信號通路參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，可被多種理化因子激活，發(fā)揮其在免疫、腫瘤、代謝和心血管疾病等方面的調(diào)控作用[22]。TLRs是促炎細(xì)胞因子釋放的主要通路之一，可活化下游PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路[23]，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，TLR2主要識別細(xì)胞宿主外脂蛋白和糖脂，TLR4主要識別病原菌細(xì)胞壁的脂多糖[24]。劉楠等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，機(jī)體抑制PI3K-Akt信號通路，降低促炎因子生成，提高機(jī)體免疫力；王卓[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，提高機(jī)體營養(yǎng)水平，上調(diào)TLRs抑制劑可以保護(hù)腸道免受TLRs介導(dǎo)產(chǎn)生的免疫損傷。而開食料富含多種犢牛所需營養(yǎng)素，營養(yǎng)全面，本研究中牦牛犢牛補(bǔ)飼開食料提高機(jī)體營養(yǎng)水平，胸腺組織中TLR2、TLR4基因下調(diào)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)與上述研究結(jié)果一致。補(bǔ)飼開食料牦牛犢牛胸腺中編碼細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6等)的基因顯著上調(diào)，但編碼其受體(IL-2R、IL-4R、IL-6R)的基因顯著下調(diào)，最后可能導(dǎo)致免疫因子在蛋白水平上差異并不顯著，說明補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛蛋白質(zhì)水平的攝入不會(huì)導(dǎo)致胸腺中細(xì)胞因子含量的變化。ⅠB類PI3K(PI3Kγ)是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥的脂質(zhì)激酶，是中樞促炎傳導(dǎo)器，通過免疫系統(tǒng)影響胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]，抵抗胰島素，易造成肥胖疾病影響機(jī)體健康[28]。GPCR的Gβγ復(fù)合物激活PI3Kγ，PI3Kγ和ⅠA類PI3K都通過激活PIP3，激活下游信號分子AKT參與PI3k-Akt信號通路[29]，促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)中，GPCR、Gβγ基因均上調(diào)，ⅠA類PI3K基因下調(diào)，PI3Kγ和PIP3基因變化不顯著，說明牦牛犢牛補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛營養(yǎng)水平的攝入雖然上調(diào)了GPCR、Gβγ基因的表達(dá)，但未促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)。薛靜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kγ過表達(dá)會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，說明該基因下調(diào)會(huì)抑制PI3K-Akt信號通路從而抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)。

NF-κB信號通路是免疫器官及免疫細(xì)胞正常發(fā)育和生成、識別炎性因子和抗原、啟動(dòng)免疫反應(yīng)的重要信號通路[31]。研究表明，相關(guān)啟動(dòng)因子與NF-κB因子結(jié)合，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子，如TNF-α等的基因轉(zhuǎn)錄，從而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞發(fā)育，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和炎癥，TNF-α基因上調(diào)，激活I(lǐng)κB激酶(IKK)，降解磷酸化核因子κB抑制蛋白(IκB)，活化NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抗凋亡基因的表達(dá)[32]。有研究表明，降低飼糧蛋白質(zhì)水平顯著減少NF-κB信號通路的mRNA相對表達(dá)量[33]。補(bǔ)飼開食料可以增加蛋白質(zhì)的攝入量，有助于機(jī)體蛋白質(zhì)的合成。本研究中，牦牛犢牛補(bǔ)飼開食料提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平，胸腺組織中TNF-α基因上調(diào)，激活I(lǐng)KK復(fù)合物基因表達(dá)，最終上調(diào)NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抗胸腺細(xì)胞的凋亡與上述研究結(jié)果一致。LBP是促進(jìn)LPS與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合的關(guān)鍵載體蛋白，具有抗炎與促炎雙重作用[34]。研究表明，激活TLR4/髓樣分化因子88(MyD88)/NF-κB信號通路，可啟動(dòng)天然免疫和炎性反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[35]。本研究中，補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛營養(yǎng)水平的攝入，胸腺LBP基因上調(diào)，與CD14受體結(jié)合，激活TLR4基因的表達(dá)，發(fā)揮炎癥正反饋調(diào)節(jié)作用促進(jìn)炎癥反應(yīng)與上述研究結(jié)果一致。CD40配體、LT-βR、BAFF-R特異性激活，IKKα磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，激活NF-κB信號通路[36]。在本試驗(yàn)中，CD40、LT-βR、TRAF3基因顯著下調(diào)，激活下游基因ELC、ICAM的表達(dá)，上調(diào)NF-κB信號通路，與上述研究結(jié)果一致，說明補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛營養(yǎng)水平的攝入會(huì)促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，胸腺需要抵抗炎癥因子的侵襲維持健康，進(jìn)而提高胸腺的部分免疫機(jī)能。

3.3 補(bǔ)飼開食料調(diào)節(jié)早期斷奶牦牛犢牛脾臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

脾臟是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要部位，同時(shí)還兼具濾血、造血、儲(chǔ)血等功能[37]。研究表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)缺乏時(shí)，脾臟的質(zhì)量會(huì)下降，甚至出現(xiàn)萎縮，出現(xiàn)免疫抑制[38]；飼料能量缺乏時(shí)，會(huì)減少脾臟分泌的免疫球蛋白和免疫細(xì)胞的數(shù)量[39]。因此，補(bǔ)飼開食料提高蛋白質(zhì)和能量的攝入對維持脾臟的正常發(fā)育具有重要意義。凝血系統(tǒng)作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分[40]，當(dāng)機(jī)體營養(yǎng)不良時(shí)，凝血系統(tǒng)會(huì)發(fā)生病理性改變[41]，補(bǔ)飼開食料提高機(jī)體營養(yǎng)水平可減少凝血系統(tǒng)的病理性改變，發(fā)揮其免疫功能；當(dāng)病毒、細(xì)菌等病原體侵入機(jī)體，同時(shí)激活凝血系統(tǒng)引起血液凝固，進(jìn)一步阻止病原體入侵機(jī)體。研究表明，補(bǔ)體和凝血級聯(lián)系統(tǒng)通過抗體依賴和非抗體依賴等途徑激活酶聯(lián)反應(yīng)，是機(jī)體的第1道防線和先天性免疫的重要組成部分[42]。當(dāng)細(xì)胞損傷或激活時(shí)，會(huì)促進(jìn)VWF的表達(dá)，VWF是內(nèi)皮損傷的一個(gè)重要標(biāo)志且有增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[43]；VWF會(huì)與白細(xì)胞結(jié)合參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。研究表明，當(dāng)機(jī)體營養(yǎng)不良時(shí)，VWF等內(nèi)皮細(xì)胞分子表達(dá)增多[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼開食料提高機(jī)體營養(yǎng)水平，脾臟組織中VWF基因下調(diào)，說明脾臟細(xì)胞并未出現(xiàn)損傷，且與白細(xì)胞結(jié)合的VWF減少，使機(jī)體的炎癥反應(yīng)得到抑制。研究表明，病原體感染機(jī)體會(huì)同時(shí)激活凝血系統(tǒng)引起血液凝固，血液凝固會(huì)進(jìn)一步限制病原體入侵機(jī)體[45]，C4結(jié)合蛋白抑制補(bǔ)體2和補(bǔ)體4的合成，調(diào)節(jié)控制補(bǔ)體C5R1和C3AR1合成，間接作用于機(jī)體炎性反應(yīng)和巨噬細(xì)胞聚合等過程[46]；補(bǔ)飼開食料牦牛犢牛胸腺組織中FⅠ、C1qrs、C1INH等基因均顯著上調(diào)，導(dǎo)致C3AR1基因上調(diào)，激活補(bǔ)體和凝血級聯(lián)路徑抑制炎癥反應(yīng)和限制病原體入侵機(jī)體，從而增強(qiáng)脾臟的免疫能力，與上述研究結(jié)果一致。補(bǔ)飼開食料提高牦牛犢牛營養(yǎng)水平攝入激活補(bǔ)體和凝血級聯(lián)路徑，增強(qiáng)脾臟對炎癥的抵御能力。

當(dāng)機(jī)體受到感染之后，脾臟會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？乖幚砗统蔬f是脾臟發(fā)揮免疫功能的重要信號通路。HSP70可提高M(jìn)HCⅠ類分子與抗原結(jié)合的效率，HSP70在不增加靶細(xì)胞表面MHCⅠ類分子數(shù)量的前提下介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(CTL)的發(fā)生[47]。補(bǔ)飼開食料牦牛犢牛脾臟組織中HSP70、CD8基因表達(dá)上調(diào)、MHCⅠ基因表達(dá)下調(diào)，說明補(bǔ)飼開食料提高營養(yǎng)水平促進(jìn)HSP70基因表達(dá)，激活MHCⅠ類免疫途徑，將抗原信息傳遞給CD8細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為致敏的CTL發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，增強(qiáng)脾臟的免疫能力，與Rosenzweig等[48]、Li等[49]研究發(fā)現(xiàn)HSP70活化免疫細(xì)胞，激活機(jī)體細(xì)胞免疫的研究結(jié)果一致。研究表明，HSP70促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，能夠通過MHCⅡ類分子呈遞過程增強(qiáng)機(jī)體的特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，使CD4+輔助性T細(xì)胞活化、增殖并表達(dá)相應(yīng)的淋巴因子，激活體液免疫[50]，補(bǔ)飼開食料牦牛犢牛脾臟組織中HSP70基因顯著上調(diào)，但并沒有激活MHCⅡ路徑，很好解釋了CD4基因并未上調(diào)這一現(xiàn)象，可能補(bǔ)飼開食料并未提高牦牛犢牛脾臟的體液免疫，只激活了細(xì)胞免疫，進(jìn)而促進(jìn)了脾臟的部分免疫機(jī)能。

4 結(jié) 論

補(bǔ)飼開食料能增加早期斷奶牦牛犢牛的營養(yǎng)攝入水平，提高其生長性能；補(bǔ)飼開食料可能主要通過下調(diào)PI3K-Akt信號通路和上調(diào)NF-κB信號通路來啟動(dòng)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)胸腺的部分免疫機(jī)能；補(bǔ)飼開食料可能通過上調(diào)抗原處理和呈遞、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)等信號通路來增強(qiáng)脾臟的細(xì)胞免疫，加強(qiáng)機(jī)體對炎癥的抵御能力。