馮 鑫 欒嘉明 楊東旭 張 敏 金英海 耿春銀*

(1.延邊大學農(nóng)學院，延吉133000；2.延邊大學東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉133002)

由于瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的復雜性和多樣性，反芻動物能夠利用單胃動物難以消化的部分飼料。瘤胃微生物獨特的酶和酶復合物可以將攝入的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為供機體利用的脂肪酸、微生物蛋白、維生素和微生物細胞等，這種獨特的消化方式使反芻動物能夠?qū)⑸攀忱w維轉(zhuǎn)化為對人類有益的動物產(chǎn)品(如肉類和奶類)?；钚愿山湍?active dry yeast,ADY)已廣泛應用于反芻動物，其可通過與瘤胃內(nèi)的其他微生物競爭，影響瘤胃發(fā)酵活動，提高飼料效率并防止瘤胃酸中毒，以有效地改善反芻動物的瘤胃環(huán)境，促進生長，預防健康障礙，部分酵母產(chǎn)品在歐洲已被正式授權(quán)為飼料添加劑[1-2]，但有關(guān)ADY對肉牛胴體性狀和肉品質(zhì)影響的報道仍然有限。肌肉的特征，如肌纖維的橫截面積、代謝酶活性、膠原蛋白含量和溶解度以及脂肪含量，都或多或少地解釋了肉品質(zhì)的可變性[3]。之前的研究表明，添加ADY提高了育肥公牛肉的嫩度和閹牛的胴體質(zhì)量等級[4-5]，其對牛肉嫩度的改善與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和減少氧化應激有關(guān)[6]。MMPs是一類可降解細胞外基質(zhì)成分的酶，參與調(diào)節(jié)可溶性膠原蛋白的比例、脂肪細胞的分化和牛肉大理石花紋的形成[6-7]?？紤]到酵母反應因所用酵母菌株、飲食性質(zhì)和動物生理狀態(tài)等因素而異，有關(guān)ADY對牛肉品質(zhì)的影響機制仍需要繼續(xù)深入探討。因此，本試驗通過研究補飼ADY對延邊黃牛生長性能、屠宰性能、肉品質(zhì)、血清和牛肉中MMPs濃度的影響，以進一步闡明ADY調(diào)控肉品質(zhì)的機制，并為其在肉牛生產(chǎn)中的應用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2020年11月至2021年2月在吉林省龍井市牧樂牧業(yè)有限公司進行。選取初生體重(485±38) kg的延邊黃牛(公牛)20頭，隨機分為2組，分別為CON組和ADY組，每組10頭。CON組飼喂基礎(chǔ)飼糧[為全混合日糧(TMR)形式]，ADY組在飼喂基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上補飼ADY[菌株為釀酒酵母CNCMI-1077(SaccharomycescerevisiaeCNCMI-1077)，活菌數(shù)≥8.0×109CFU/g]，ADY以制造商建議的1 g/(頭·d)的劑量提供。試驗期共計100 d，其中預試期10 d，正試期90 d。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

在試驗開始之前，對牛舍進行清掃、消毒，給牛打好耳號、驅(qū)蟲。所有牛采用栓系式飼養(yǎng)，每天飼喂2次，自由采食和飲水。飼喂后清掃圈舍，定期對牛舍通風和消毒，保證管理方式和飼養(yǎng)條件一致。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束前1天，待肉?？崭?2 h后，對每頭牛頸靜脈采血10 mL于采血管中，4 ℃靜置過夜，后經(jīng)20 min、3 000 r/min離心分離獲得血清。試驗結(jié)束后，試驗牛空腹12 h后進行屠宰，排酸24 h后進行胴體分割，取牛背最長肌(西冷)部分的肉樣。將采集到的樣品于-80 ℃保存，用于后續(xù)指標的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能

正式試驗開始及試驗結(jié)束的前1天，待肉?？崭?2 h進行稱重，試驗期間記錄每天的供料量和剩料量。測定的生長性能指標包括初始體重、終末體重、平均日增重、干物質(zhì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。

1.4.2 屠宰性能

試驗結(jié)束時，肉牛在禁食12 h后進行屠宰，記錄宰前活重和胴體重。每頭牛的屠宰率通過計算胴體重與最終活體重的比率獲得。在胴體切割過程中，用游標卡尺測量第12肋骨皮下脂肪厚度。在透明硫酸紙上繪制眼肌的橫截面圖后，使用QCJ-2000求積儀(哈爾濱光學儀器廠)測量眼肌面積。使用AUS-MEAT大理石花紋參考標準(2005)的0～9評分范圍評估大理石花紋評分。

1.4.3 肉品質(zhì)指標

物理指標：pH使用手持pH計(Eutech Instruments,美國)測定。肉色使用Minolta-CR400/410便攜式色差儀(日本)測定。剪切力使用Warner-bratzle-2356x剪切力儀(Salter Brecknell,美國)測定。將牛肉切成尺寸為15 mm×15 mm×30 mm的小塊，4 ℃懸掛24 h測定滴水損失。將牛肉真空包裝在聚乙烯袋中，于80 ℃下加熱直到內(nèi)部溫度達到70 ℃，用于計算蒸煮損失。取在10%甲醛溶液固定24 h以上的肌肉組織，流水沖洗24 h，梯度酒精脫水，1/2二甲苯+1/2無水乙醇和純二甲苯脫色，將處理好的組織浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色和中性樹膠封片，Olympus-DP73顯微鏡(日本)下拍照，觀察肌肉組織形態(tài)。使用圖片分析軟件ImageJ統(tǒng)計牛肉的肌纖維密度和肌纖維直徑。用肌纖維根數(shù)除以肌纖維束所占面積求得肌纖維密度。以肌纖維束所占面積除以肌纖維根數(shù)求得平均面積，將其擬合成圓求得肌纖維直徑。

化學指標：通過測量羥脯氨酸含量反映膠原蛋白含量。參照李華[8]和馬元婧等[9]的方法提取和測定肉樣中總羥脯氨酸和可溶性羥脯氨酸含量，按照Crouse等[10]推薦的系數(shù)計算總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白含量，并根據(jù)總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白含量計算膠原蛋白溶解度(膠原蛋白溶解度=100×可溶性膠原蛋白含量/總膠原蛋白含量)。牛肉中蛋白質(zhì)含量的測定使用凱氏定氮儀分析法(Kjeltec-8400,FOSS,丹麥)，水分含量的測定使用直接干燥法，肌內(nèi)脂肪含量的測定使用索氏提取法，灰分含量的測定使用稱重法。

1.4.4 MMPs濃度

血液和牛肉中MMP-2、MMP-9和MMP-13濃度根據(jù)制造商的說明采用雙抗體夾心法測定，所用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(貨號分別為ml063746、ml063748和ml002505)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。測定前，牛肉需用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L，pH=7.4)沖洗組織，去除殘留液體，稱重后將組織剪碎，按1 g組織樣本對應9 mL PBS的比例加入PBS，使用組織勻漿機于冰上進行研磨，將勻漿液于10 min、5 000 r/min離心，取上清液進行測定。

1.5 統(tǒng)計分析

生長性能數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件中的一般線性模式中的協(xié)方差分析，模型顯著時，平均值采用估計值，模型不顯著時，平均值采用真實值。屠宰性能、肉品質(zhì)和MMPs濃度數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 補飼ADY對延邊黃牛生長性能的影響

由表2可知，與CON組相比，ADY組的DMI顯著提高(P<0.05)，其他生長性能指標均無顯著變化(P>0.05)。

表2 補飼ADY對延邊黃牛生長性能的影響

2.2 補飼ADY對延邊黃牛屠宰性能的影響

由表3可知，與CON組相比，ADY組牛肉的大理石花紋評分顯著提高(P<0.05)，其他屠宰性能指標沒有顯著變化(P>0.05)。

表3 補飼ADY對延邊黃牛屠宰性能的影響

2.3 補飼ADY對延邊黃牛肉品質(zhì)的影響

由表4可知，在牛肉的物理指標方面，與CON組相比，補飼ADY顯著降低了剪切力(P<0.05)，趨于減小肌纖維直徑(P=0.071)，趨于增加肌纖維密度(P=0.067)，但對pH、蒸煮損失、滴水損失和肉色均無顯著影響(P>0.05)。在牛肉的化學指標方面，與CON組相比，補飼ADY顯著增加了膠原蛋白溶解度(P<0.05)，趨于增加肌內(nèi)脂肪含量(P=0.067)，但對水分、蛋白質(zhì)、灰分、總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白含量沒有顯著影響(P>0.05)。肌纖維組織形態(tài)見圖1。

表4 補飼ADY對延邊黃牛肉品質(zhì)的影響

圖1 肌纖維組織形態(tài)

2.4 補飼ADY對延邊黃牛血清和牛肉中MMPs濃度的影響

由表5可知，與CON組相比，補飼ADY顯著增加了延邊黃牛血清中MMP-2、MMP-9和MMP-13的濃度(P<0.05)。與CON組相比，ADY組牛肉中MMP-2濃度顯著升高(P<0.05)，MMP-9和MMP-13濃度無顯著變化(P>0.05)。

表5 補飼ADY對延邊黃牛血清和肌肉中MMPs濃度的影響

3 討 論

ADY對反芻動物的生產(chǎn)力和健康水平具有一定的促進作用。一些關(guān)于生長性能的研究顯示，添加ADY可以提高肉牛的終末體重、平均日增重和平均日采食量[4]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，補飼ADY會降低肉牛的采食量或?qū)θ馀５纳L性能無顯著影響[11-12]，造成結(jié)果差異的原因與動物的生理狀態(tài)、飼糧的組成和酵母菌株的種類等有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，補飼ADY顯著提高了延邊黃牛的DMI，這可能與其對纖維降解菌的調(diào)控作用和胃饑餓素(ghrelin)等采食相關(guān)激素的調(diào)節(jié)有關(guān)[13-14]。據(jù)報道，較低營養(yǎng)水平的飼糧中添加ADY，肉牛能夠產(chǎn)生與高營養(yǎng)水平飼糧相似的胴體重[15]，說明ADY能夠一定程度地改善肉牛的屠宰性能。本試驗條件下，補飼ADY后牛肉大理石花紋評分顯著上升，但未對延邊黃牛的宰前活重、胴體重、屠宰率、眼肌面積和第12肋骨皮下脂肪厚造成顯著影響，與Magrin等[16]和李月明[17]的研究結(jié)果相似，這提示添加ADY可能對牛肉脂肪的沉積具有一定的調(diào)控作用。

剪切力是衡量肉品嫩度的參數(shù)之一。通常，剪切力的數(shù)值越低，牛肉的嫩度越好。Geng等[4]研究發(fā)現(xiàn)，補飼ADY對牛肉的pH、滴水損失、蒸煮損失、肉色均無顯著影響，但顯著降低了牛肉的剪切力，這與本試驗結(jié)果一致。肌纖維的某些指標與肌理特性相關(guān)，也可以反映肉品的嫩度。研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維直徑與肌肉的剪切力和失水率成正比，與pH、大理石花紋評分和肌間脂肪含量成反比，而肌纖維密度則與之相反[18-19]。一般而言，肌纖維直徑較小，肌纖維密度較大，肉越嫩[20]。已有相關(guān)的研究報道，補飼酵母制劑可顯著降低肉雞[21]和肉鵝[22]的肌纖維直徑，改善肉品嫩度。在本研究中，與CON組相比，ADY組肌纖維密度增加，肌纖維直徑減小，這有利于牛肉嫩度的改善。據(jù)報道，補飼抗氧化劑可改善肉的嫩度并影響肌纖維特性[23]，牛肉中抗氧化酶的活性與肌纖維直徑呈負相關(guān)關(guān)系[18]，而補飼ADY能夠提高肉牛機體的抗氧化能力[17]，由此推測，ADY對肌纖維的調(diào)控可能與其對肉?？寡趸芰Φ母纳朴嘘P(guān)。

根據(jù)相關(guān)報道，補飼ADY可提高乳脂的含量，同時其還具備改善牛肉脂肪酸譜和肌內(nèi)脂肪沉積的功效[24-25]，說明ADY可以通過影響肉牛的脂代謝，進而影響畜產(chǎn)品的質(zhì)量，這可能是本研究中ADY組肉牛肌內(nèi)脂肪含量提高的原因。膠原蛋白是一種主要的細胞外基質(zhì)成分，其含量和溶解度是導致肉的嫩度和質(zhì)地變化的因素之一[26]。Warner等[27]提出總膠原蛋白含量在預測肉的嫩度時的價值有限，而膠原蛋白的溶解度預計會影響嫩度。氧化應激可能會減少肌肉中肌內(nèi)成纖維細胞對新膠原蛋白的合成，這可能導致膠原蛋白溶解度降低和肉的韌性增加[7]，而ADY對牛肉嫩度和肌內(nèi)脂肪含量的積極影響可能是通過提高肉牛機體抗氧化能力實現(xiàn)的[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，ADY組牛肉的膠原蛋白溶解度較CON組顯著提高，進一步說明補飼ADY對牛肉嫩度具有改善作用。

MMPs是一類可降解細胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，MMP-2和MMP-9(明膠酶)、MMP-13(膠原酶)已被證實參與肌肉、纖維、脂肪和結(jié)締組織的發(fā)育等生物學過程[7,28]?？寡趸瘎┛梢燥@著增加肌肉中MMPs的表達，并可能潛在地促進結(jié)締組織的周轉(zhuǎn)，改善肉的嫩度[7]，而結(jié)締組織蛋白、肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和可降解性是影響牛肉嫩度的關(guān)鍵的因素[29]。位于肌內(nèi)結(jié)締組織中的肌內(nèi)脂肪，可通過MMPs重塑結(jié)締組織，并由成纖維細胞合成新的細胞外基質(zhì)成分，這是肌束間和肌束內(nèi)脂肪沉積所必需的[28]。據(jù)報道，MMPs還參與脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)[30]，由于脂肪細胞和成纖維細胞來源于共同的間充質(zhì)細胞，促進脂肪的生成會導致更多的脂肪細胞和更少的成纖維細胞，這可能會使動物肌肉中形成更多大理石花紋，而減少結(jié)締組織的形成，并影響肉的嫩度[31]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，血清中MMP-2的濃度與牛肉的大理石花紋評分呈正相關(guān)，MMP-9和MMP-13的濃度與牛肉的剪切力呈負相關(guān)[32]。在本研究中，補飼ADY顯著增加了肉牛血清中MMP-2、MMP-9和MMP-13以及牛肉中MMP-2的濃度，與Geng等[6]的研究結(jié)果相似，強調(diào)補飼ADY后牛肉的肌內(nèi)脂肪沉積、嫩度、肌纖維特性和膠原蛋白溶解度的變化可能與MMPs濃度的增加有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，補飼1 g/(頭·d)的ADY可提高延邊黃牛的采食量和肌肉大理石花紋評分，ADY可能通過增加MMPs的濃度、膠原蛋白在牛肉中的溶解度以及肌內(nèi)脂肪的含量，改善肌纖維密度和肌纖維直徑，進而影響牛肉的嫩度。