趙 旭 莊佳榮 李洪濤 于 娟* 張金紅 侯彥茹

(1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，臨沂276000；2.山東布恩飼料集團(tuán)有限公司，臨沂276000)

家禽的消化道中存在著大量的微生物，它們對(duì)于維持家禽腸道環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收均具有非常重要的作用。對(duì)于家禽而言，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門[1]。之前有研究表明，腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度與宿主的體重密切相關(guān)，其中，厚壁菌門相對(duì)豐度與體重呈正相關(guān)關(guān)系，而擬桿菌門相對(duì)豐度與體重呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[2-3]。因此，通過(guò)外源添加益生菌來(lái)改變家禽腸道微生物區(qū)系不失為提高家禽生長(zhǎng)性能的好方法，這將對(duì)于應(yīng)對(duì)目前抗生素被禁用的現(xiàn)狀具有重要意義。丁酸梭菌是屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科、梭菌屬的一種產(chǎn)丁酸、厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[4]；枯草芽孢桿菌是屬于厚壁菌門、桿菌綱、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬的一種需氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[5]。2種菌目前均已被批準(zhǔn)可作為飼料添加劑應(yīng)用于肉雞飼糧中。丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌均可產(chǎn)芽孢，因此兩者對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，對(duì)飼料加工過(guò)程中的高溫、高壓以及動(dòng)物胃腸道中的胃酸、膽汁酸等均具有較強(qiáng)的耐受性[6-7]。之前研究表明，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌均具有提高肉雞生長(zhǎng)性能以及改善肉雞腸道微生物區(qū)系的作用[2,8-10]，但兩者配伍應(yīng)用于肉雞上的研究卻尚少。如前面所述，枯草芽孢桿菌為需氧菌，其被肉雞采食后可在腸道中形成局部的厭氧環(huán)境，這將為丁酸梭菌的繁殖和生長(zhǎng)提供有力的條件，所以丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍理論上會(huì)起到協(xié)同的作用。因此，本研究旨在通過(guò)研究丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及盲腸微生物區(qū)系的影響，為丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌在肉雞生產(chǎn)上的配伍應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌菌粉中活菌數(shù)均為1×1010CFU/g，均由山東某農(nóng)牧科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用1日齡羅斯308肉雞600只(公母各占1/2)，隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，其為參照NRC(1994)雞的營(yíng)養(yǎng)需要配制的配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1；試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加2×108CFU/kg丁酸梭菌和1×109CFU/kg枯草芽孢桿菌(公司推薦劑量)的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為42 d。肉仔雞采用3層籠養(yǎng)，自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

于試驗(yàn)結(jié)束，每個(gè)重復(fù)選取1只體重接近于該重復(fù)平均體重的健康肉雞空腹12 h后稱重，然后翅靜脈采血分離血清，-20 ℃保存，用于測(cè)定血清甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量；之后相同肉雞飼喂2 h后頸靜脈放血處死，分離左側(cè)相同部位肝臟組織樣品-20 ℃保存，用于測(cè)定肝臟TG和TC含量；采集左側(cè)盲腸內(nèi)容物于7 mL滅菌離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存，用于盲腸微生物區(qū)系檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間以重復(fù)為單位記錄本試驗(yàn)用肉雞的采食量、始重、末重以及健康狀況，并計(jì)算對(duì)照組和試驗(yàn)組肉雞的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 肝臟和血清脂類含量

肝臟和血清中的TG和TC含量均通過(guò)南京建成生物工程研究所對(duì)應(yīng)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定過(guò)程與說(shuō)明書相一致。

1.4.3 盲腸微生物區(qū)系

盲腸微生物區(qū)系通過(guò)16S rDNA測(cè)序的方法進(jìn)行測(cè)定，由北京諾禾致源科技股份有限公司基于Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌顯著提高了1～42日齡肉雞的ADFI和ADG(P<0.05)，顯著降低了1～42日齡肉雞的F/G(P<0.05)。

表2 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞肝臟和血清脂類含量的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌顯著降低了42日齡肉雞肝臟中的TG含量(P<0.05)，但對(duì)42日齡肉雞肝臟中的TC含量以及血清中的TG和TC含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞肝臟和血清脂類含量的影響

2.3 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞盲腸微生物區(qū)系的影響

2.3.1 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞盲腸微生物α多樣性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對(duì)42日齡肉雞盲腸微生物的Chao1、Shannon以及Simpson指數(shù)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞盲腸微生物α多樣性的影響

2.3.2 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，對(duì)照組42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌門由高到低分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、謎古菌門(Aenigmarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)和梭桿菌門(Fusobacteria)。試驗(yàn)組42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌門由高到低分別為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、彎曲桿菌門、脫硫菌門、藍(lán)藻門、謎古菌門、疣微菌門和梭桿菌門。

Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Proteobacteria:變形菌門;Campilobacterota:彎曲桿菌門;Actinobacteriota:放線菌門;Desulfobacterota:脫硫菌門;Aenigmarchaeota:謎古菌門;Cyanobacteria:藍(lán)藻門;Verrucomicrobiota:疣微菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Others:其他。

由圖2可知，與對(duì)照組相比，飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌顯著提高了42日齡肉雞盲腸排名前10菌門中的厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度(P<0.05)，顯著降低了42日齡肉雞盲腸排名前10菌門中的擬桿菌門、彎曲桿菌門、脫硫菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度(P<0.05)。

Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Campilobacterota:彎曲桿菌門;Actinobacteriota:放線菌門;Desulfobacterota:脫硫菌門;Cyanobacteria:藍(lán)藻門。

由圖3可知，對(duì)照組42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌屬由高到低分別為擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、另枝菌屬(Alistipes)、梭狀芽孢桿菌vadinBB60群(Clostridia_vadinBB60_group)、梭狀芽孢桿菌UCG-014(Clostridia_UCG-014)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、螺桿菌屬(Helicobacter)、CHKCI001、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群(Eubacterium_coprostanoligenes_group)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。試驗(yàn)組42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌屬由高到低分別為糞桿菌屬、擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌vadinBB60群、另枝菌屬、梭狀芽孢桿菌UCG-014、CHKCI001、雙歧桿菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群、螺桿菌屬和副擬桿菌屬。

Bacteroides:擬桿菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Alistipes:另枝菌屬;Clostridia_vadinBB60_group:梭狀芽孢桿菌vadinBB60群;Clostridia_UCG-014:梭狀芽孢桿菌UCG-014;Helicobacter:螺桿菌屬;Bifidobacterium:雙歧桿菌屬;Parabacteroides:副擬桿菌屬;Eubacterium_coprostanoligenes_group:產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群;Others:其他。

由圖4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌顯著提高了42日齡肉雞盲腸排名前10菌屬中的雙歧桿菌屬和產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群的相對(duì)豐度(P<0.05)，顯著降低了42日齡肉雞盲腸排名前10菌屬中的螺桿菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)。

Helicobacter:螺桿菌屬;Bifidobacterium:雙歧桿菌屬;Parabacteroides:副擬桿菌屬;Eubacterium_coprostanoligen-es_group:產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群。

2.3.3 盲腸微生物與肉雞生長(zhǎng)性能間的相關(guān)性

由圖5可知，在42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌門里，厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度與肉雞ADG呈正相關(guān)(P<0.05)，擬桿菌門、彎曲桿菌門和脫硫菌門的相對(duì)豐度與肉雞ADFI呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；擬桿菌門、彎曲桿菌門、脫硫菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度與肉雞ADG呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，放線菌門的相對(duì)豐度與肉雞ADG呈正相關(guān)(P<0.05)；放線菌門的相對(duì)豐度與肉雞的F/G呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，藍(lán)藻門的相對(duì)豐度與肉雞的F/G呈正相關(guān)(P<0.05)。

Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Proteobacteria:變形菌門;Campilobacterota:彎曲桿菌門;Actinobacteriota:放線菌門;Desulfobacterota:脫硫菌門;Aenigmarchaeota:謎古菌門;Cyanobacteria:藍(lán)藻門;Verrucomicrobiota:疣微菌門;Fusobacteria:梭桿菌門；ADFI:平均日采食量 average daily feed intake; ADG:平均日增重 average daily gain; F/G:料重比 feed/gain。

由圖6可知，在42日齡肉雞盲腸中排名前10的菌屬里，擬桿菌屬、螺桿菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度與肉雞ADFI和ADG均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CHKCI001和雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度與肉雞ADFI和ADG均呈正相關(guān)(P<0.05)，此外，產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群的相對(duì)豐度與肉雞ADG呈正相關(guān)(P<0.05)；雙歧桿菌屬和產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群的相對(duì)豐度與肉雞F/G呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，副擬桿菌屬的相對(duì)豐度與肉雞F/G呈正相關(guān)(P<0.05)。

Bacteroides:擬桿菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Alistipes:另枝菌屬;Clostridia_vadinBB60_group:梭狀芽孢桿菌vadinBB60群;Clostridia_UCG-014:梭狀芽孢桿菌UCG-014;Helicobacter:螺桿菌屬;Bifidobacterium:雙歧桿菌屬;Parabacteroides:副擬桿菌屬;Eubacterium_coprostanoligen-es_group: 產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群; ADFI:平均日采食量 average daily feed intake; ADG:平均日增重 average daily gain; F/G:料重比 feed/gain。

3 討 論

3.1 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

ADFI、ADG和F/G是反映肉雞生長(zhǎng)性能的常用指標(biāo)。目前，關(guān)于丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)禽生長(zhǎng)性能影響的研究大多集中在鵝和地方雞上，而在快大型白羽肉雞方面的研究甚少。韋區(qū)[11]研究表明，飼糧中同時(shí)添加2×108CFU/kg丁酸梭菌和4.5×109CFU/kg枯草芽孢桿菌可顯著提高散養(yǎng)模式下廣西黎村三黃雞的ADG，但對(duì)F/G無(wú)顯著影響。李修宇[12]研究指出，飼糧中同時(shí)添加2.56×105CFU/kg丁酸梭菌和6.44×106CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)靈山土雞的ADFI、ADG和F/G均無(wú)顯著影響。于潔等[13]研究表明，飼糧中同時(shí)添加7.5×105CFU/kg丁酸梭菌和5×106CFU/kg枯草芽孢桿菌可顯著提高1～70日齡肉鵝的總增重和總采食量，但對(duì)F/G無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中同時(shí)添加2×108CFU/kg丁酸梭菌和1×109CFU/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了1～42日齡羅斯308肉雞的ADFI和ADG，降低了F/G。這些試驗(yàn)結(jié)果的差異可能與各試驗(yàn)所采用的動(dòng)物品種和年齡、飼糧組成、飼養(yǎng)管理水平以及益生菌的添加量不同有關(guān)。本試驗(yàn)中，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍組肉雞生長(zhǎng)性能較高，可能是因?yàn)槎∷崴缶涂莶菅挎邨U菌促進(jìn)了肉雞健康的腸道微生態(tài)環(huán)境[14-15]。

3.2 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞肝臟和血清脂類含量的影響

對(duì)于肉雞而言，肝臟是其脂肪合成的最主要器官，脂肪酸的合成幾乎只能在肝臟中完成[16]。肉雞肝臟中蓄積脂肪的能力較低，如果不能及時(shí)運(yùn)出，多余的脂肪將堆積在肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂肪肝，并伴有全身的代謝紊亂[17]。肝臟中合成的脂肪通常以脂蛋白的形式在血中轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)入肝臟外組織被貯存[16]。因此，血清脂類含量可作為反映機(jī)體代謝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，尤其可反映肝臟與脂肪組織間脂肪酸循環(huán)的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)情況[2]。本試驗(yàn)中，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍組肉雞血清TG和TC含量無(wú)顯著變化，表明同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞脂肪代謝穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。韋區(qū)[11]研究表明，飼糧中同時(shí)添加2×108CFU/kg丁酸梭菌和4.5×109CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)散養(yǎng)模式下廣西黎村三黃雞的血清TG和TC含量均無(wú)顯著影響。李修宇[12]研究指出，飼糧中同時(shí)添加2.56×105CFU/kg丁酸梭菌和6.44×106CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)靈山土雞的血清TG和TC含量均無(wú)顯著影響。范雪[18]研究表明，飼糧中同時(shí)添加7.5×105CFU/kg丁酸梭菌和5×106CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)70日齡揚(yáng)州鵝血清TG和TC含量均無(wú)顯著影響。這些結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果相類似，其原因可能與肉雞的體內(nèi)平衡機(jī)制有關(guān)。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍組肉雞肝臟TG含量降低，表明丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌的聯(lián)合添加可降低肉雞得脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，其原因可能是這2種益生菌的聯(lián)合添加促進(jìn)了肉雞肝源性脂肪向外周組織的轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積，這正與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌的聯(lián)合添加促進(jìn)了42日齡肉雞ADG的結(jié)果相一致。

3.3 丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍對(duì)肉雞盲腸微生物區(qū)系的影響

家禽盲腸中存在大量的微生物，其對(duì)于維持家禽腸道微生態(tài)的穩(wěn)定、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收發(fā)揮著非常重要的作用[16]。近年來(lái)，隨著抗生素的禁用，益生菌作為微生物調(diào)節(jié)劑越來(lái)越引起人們的重視。目前關(guān)于丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞盲腸微生物區(qū)系影響的研究多集中于單菌的作用上[8-10,19-22]，關(guān)于復(fù)合菌方面的研究較少。李修宇[12]研究指出，飼糧中同時(shí)添加2.56×105CFU/kg丁酸梭菌和6.44×106CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)靈山土雞盲腸微生物的Chao1、Shannon以及Simpson指數(shù)均無(wú)顯著影響，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。農(nóng)斯偉等[23]研究表明，飼糧中同時(shí)添加2×108CFU/kg丁酸梭菌和4.5×109CFU/kg枯草芽孢桿菌對(duì)廣西黎村黃雞盲腸中的厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門相對(duì)豐度以及擬桿菌屬、另枝菌屬相對(duì)豐度均無(wú)顯著影響，這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌顯著提高了42日齡肉雞盲腸中的厚壁菌門和放線菌門相對(duì)豐度，降低了盲腸中的擬桿菌門相對(duì)豐度，但對(duì)變形菌門以及擬桿菌屬、另枝菌屬相對(duì)豐度均無(wú)顯著影響的結(jié)果不一致，其原因可能是2個(gè)試驗(yàn)所采用的試驗(yàn)動(dòng)物品種和日齡、飼養(yǎng)管理水平、飼糧組成、益生菌的添加量等存在差異。此外，本試驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍引起的42日齡肉雞盲腸差異菌門和菌屬相對(duì)豐度與肉雞的生長(zhǎng)性能存在密切的相關(guān)性，其中擬桿菌門相對(duì)豐度與肉雞生長(zhǎng)性能呈負(fù)相關(guān)以及放線菌門相對(duì)豐度與肉雞生長(zhǎng)性能呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果與Zhao等[2]和Hu等[24]的研究結(jié)果相一致，同時(shí)也與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍顯著提高了肉雞生長(zhǎng)性能的結(jié)果相一致，表明丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍具有完善42日齡肉雞盲腸微生物區(qū)系的作用，且這可能是其提高肉雞生長(zhǎng)性能的原因之一。

4 結(jié) 論

① 飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌可以提高42日齡肉雞的生長(zhǎng)性能。

② 飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌可以降低42日齡肉雞肝臟中的TG含量。

③ 飼糧中同時(shí)添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌可以完善42日齡肉雞盲腸的微生物區(qū)系。