王小偉 張力莉 徐曉鋒

(寧夏大學農(nóng)學院，銀川750021)

反芻動物胃腸道微生物群及其與宿主之間相互作用機制一直是國內(nèi)外的研究熱點。所有的哺乳動物胃腸道微生物群都由細菌、真菌、古生菌、原生動物和病毒等組成，它們參與宿主的新陳代謝、胃腸道發(fā)育及其免疫功能等方面[1-3]。當然，隨著諸多因素的變化，例如飲食、年齡、疾病和環(huán)境因素等，幼齡反芻動物胃腸道微生物群會呈現(xiàn)一個動態(tài)的變化過程，而這種變化表現(xiàn)在胃腸道微生物的單一物種的數(shù)量增加、微生物多樣性的增加和微生物與胃腸道相互作用機制的成熟等[4-5]。伴隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，人們對其研究與了解更深，可以通過人為技術(shù)手段，使其宿主的生產(chǎn)性能提高、促進胃腸道發(fā)育和預(yù)防疾病等[6]。本文以幼齡反芻動物為對象，綜述了胃腸道微生物的定植過程及其功能、影響定植的因素和調(diào)控措施，為幼齡反芻動物胃腸道微生物相關(guān)研究提供參考。

1 幼齡反芻動物胃腸道微生物的定植過程

幼齡反芻動物胃腸道微生物定植是一個動態(tài)的過程，且在動物早期生活中有相當大的波動。定植過程可以一直持續(xù)到斷奶，在整個斷奶前階段，胃腸道微生物的多樣性、豐富度、結(jié)構(gòu)和組成經(jīng)常在不斷變化。在斷奶之后，微生物群變得穩(wěn)定，并具有調(diào)整彈性，僅通過飲食的暫時變化而改變，但通過自身調(diào)整極易恢復(fù)到以前的狀態(tài)。

1.1 定植

在早期研究中，人們認為胎兒在發(fā)育過程中，胎兒受胎盤屏障的保護，在出生前胃腸道是無菌狀態(tài)，直至出生時接觸到外界環(huán)境。但有研究表明，在羔羊出生前對母體進行無菌解剖，在羔羊的腸道發(fā)現(xiàn)有微生物的存在，胎兒腸道微生物群主要由變形菌門、放線菌門和厚壁菌門組成，其中變形菌門的相對豐度最高[7]，其次腸道還發(fā)現(xiàn)有沙門氏菌、肺炎鏈球菌、陰溝腸桿菌、阿爾伯氏大腸桿菌和索氏志賀氏菌等，這與先前研究[8-9]報道結(jié)果類似；也有研究報道，在胎兒剛出生的胎糞中也發(fā)現(xiàn)了低豐度的微生物群[10-11]。Guzman等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠5～7個月，胎兒胃腸道和羊水中已經(jīng)存在高密度的細菌遺傳物質(zhì)，這表明母牛在產(chǎn)前可能通過胎盤屏障傳播給胎兒。以上研究說明，反芻動物在胎兒期已經(jīng)存在胃腸道微生物定植現(xiàn)象。

犢牛胃腸道首先由兼性厭氧菌定植，然后由專性厭氧腸道微生物群(如雙歧桿菌和類桿菌)創(chuàng)造定植所需的厭氧條件[13]。在犢牛出生20 min后，在新生犢牛瘤胃中出現(xiàn)了纖維分解菌和產(chǎn)甲烷菌，并且隨著出生時間的推移，瘤胃微生物數(shù)量也在迅速增加，在出生1 d后，在犢牛瘤胃中檢測到纖維分解菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌，其主要作用參與機體的能量攝取[14]。纖毛原生動物的定植取決于是否與成年反芻動物接觸，如果與成年反芻動物發(fā)生接觸，原生動物種群會在犢牛15～20日齡發(fā)育[15]。Malmuthuge等[16]在犢牛的瘤胃中發(fā)現(xiàn)不到0.1%的真菌，卻未檢測到古生菌和原生動物。Virgínio-Júnior等[17]在60日齡斷奶犢牛瘤胃中也沒有發(fā)現(xiàn)原生動物，并將其歸因于與成年反芻動物沒有發(fā)生接觸。Malmuthuge等[18]在探索幼齡犢牛整個胃腸道的細菌組成時，瘤胃和大腸區(qū)域主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成，而小腸內(nèi)容物中95%的細菌由厚壁菌門組成；相比之下，小腸中與黏膜相關(guān)的細菌群落主要由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門組成。Yeoman等[19]觀察到在幼齡犢牛整個胃腸道中變形菌門(41%)、厚壁菌門(29%)和擬桿菌門(23%)的豐度更高，且在管腔和黏膜附著微生物之間存在顯著差異。

1.2 來源

幼齡反芻動物胃腸道微生物的來源也是一直研究的熱點?，F(xiàn)有證據(jù)表明，胎兒腸道的微生物定植可能是通過從陰道上升、母體腸道以及口腔微生物群的血液傳播而建立的。有研究報道，在母羊哺乳的羔羊中，羔羊腸道微生物群與母羊乳頭中的微生物群(43%)和環(huán)境中的微生物群(28%)相似；相比之下，奶瓶喂養(yǎng)的羔羊與母羊陰道(46%)、環(huán)境空氣(31%)和圍欄地板(12%)中的微生物相似[20]。當動物通過陰道時，首次接觸子宮外的微生物，Klein-Klein-J?bstl等[21]觀察到48 h內(nèi)犢牛糞便微生物群發(fā)生了變化，但更接近母牛的陰道微生物群，而不是母牛的口腔或糞便微生物群，甚至是初乳。但人類口腔和胎盤微生物群之間存在顯著相似性，其中胎盤微生物群與口腔微生物群比任何其他身體部位更相似(包括陰道和腸道)，其中一些口腔微生物(如具核梭桿菌)可與血管內(nèi)皮結(jié)合并增加通透性，允許其他微生物(如大腸桿菌)穿過內(nèi)皮屏障，促進胎盤形成期間的血液傳播[22]。在懷孕期間某些陰道微生物可以上升到子宮并侵入羊膜腔，并且羊水中含有胎兒在懷孕期間攝入的微生物，最終定植在胎兒腸道中[23-24]。有研究報道，圍產(chǎn)期母牛胎盤、臍帶、羊水、初乳和糞便中的微生物均是犢牛腸道微生物的主要來源，其中臍帶微生物對胎糞微生物的定植貢獻最大[25]。

2 幼齡反芻動物胃腸道微生物的功能

相比于成年反芻動物，幼齡反芻動物胃腸道微生物數(shù)量少、種屬水平豐度低，以及胃腸道發(fā)育不完全，使其對營養(yǎng)吸收和胃腸道機能成熟受阻。因此，了解幼齡反芻動物胃腸道微生物的功能顯得尤為重要。

2.1 促進瘤胃發(fā)育與營養(yǎng)吸收

瘤胃生物群主要由細菌、古生菌、原生動物和真菌組成，瘤胃細菌在瘤胃微生物群中占主導地位，也被廣泛研究[26-27]。瘤胃細菌主要參與揮發(fā)性脂肪酸和瘤胃微生物蛋白的產(chǎn)生，而揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)對瘤胃發(fā)育，特別對瘤胃乳頭發(fā)育具有重要的作用[28]。隨著犢牛日齡的增長和固體飼料的攝入，犢牛消化和吸收部位也會發(fā)生變化，從腸道轉(zhuǎn)移到瘤胃，犢牛的能量代謝發(fā)生了變化，開始使用更多的短鏈脂肪酸和更少的葡萄糖，并且隨著腸道酶活性的變化(乳糖酶活性的降低、麥芽糖酶活性的增加)，犢牛唾液系統(tǒng)開始發(fā)育，犢牛反芻行為也隨即發(fā)生[29-30]。

在犢牛斷奶前，由于食道溝反射牛奶繞過瘤胃，在此期間犢牛的瘤胃絨毛尚未發(fā)育，無法更好地參與營養(yǎng)吸收[31]。犢牛的胃腸道發(fā)育、從代謝牛奶葡萄糖到代謝短鏈脂肪酸的功能轉(zhuǎn)變、生長和免疫力都可能會受到斷奶前和斷奶后階段(出生后3～70 d)攝入固體飼料和苜蓿干草的影響[32]。而在斷奶前添加苜蓿干草和固體飼料對各種生物功能有著至關(guān)重要的長期影響，這可能是由于早期胃腸道微生物群的改變、瘤胃發(fā)酵以及腸道營養(yǎng)物質(zhì)利用的增強[33]。有研究報道，在斷奶前(7周齡)、斷奶過渡期(8周齡)和斷奶后(9～11周齡)階段，添加苜蓿干草和其他纖維性碳水化合物可以增加類桿菌的瘤胃豐度，類桿菌是一種重要的纖維素分解細菌，進一步提高瘤胃pH，促進瘤胃健康和瘤胃上皮發(fā)育[34]。同時，在斷奶前階段，添加固體飼料可以增加巨球蛋白和其他蛋白含量，這些蛋白可以加快瘤胃對碳水化合物的發(fā)酵反應(yīng)速度，并進一步增強瘤胃發(fā)酵和促進反芻動物的生長。

2.2 參與機體免疫系統(tǒng)的建立

生命初期的腸道微生物定植對犢牛免疫系統(tǒng)的成熟和犢牛的健康至關(guān)重要，并且可能具有長期健康影響[35-36]。微生物或微生物代謝產(chǎn)物可能會驅(qū)動胎兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育和腸上皮成熟。例如，在孕婦的胎盤和羊水中檢測到益生菌(雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌GG)，并且在胎兒腸道中Toll樣受體相關(guān)基因的表達受到顯著調(diào)節(jié)，表明微生物與胎兒腸道先天免疫發(fā)育的變化有關(guān)[37]。而羊水中的炎性細胞因子水平與羊水中微生物的存在也有關(guān)，這可能會影響發(fā)育中的胎兒免疫系統(tǒng)[38]。

犢牛的免疫系統(tǒng)是具有抗原性的，適應(yīng)性免疫細胞無法識別外來抗原[39]。從出生到8周齡斷奶，犢牛的健康問題發(fā)生率很高，這也表明犢牛的免疫系統(tǒng)的不成熟[30]。腸道微生物群對于腸道黏液的分泌至關(guān)重要，腸道黏液是整個胃腸道的重要物理屏障[40]。已知在腸黏膜表面發(fā)現(xiàn)的腸上皮細胞與腸道微生物群相互作用以影響免疫應(yīng)答和維持穩(wěn)態(tài)[41]。在反芻動物中，研究共生微生物群的定植與調(diào)節(jié)腸道組織的免疫功能以及組織功能的變化之間如何互相影響的是非常有趣的一個話題。一些研究報告了從3～5周齡與6個月齡犢牛的小腸分離的細胞中黏膜白細胞亞群數(shù)量和分布的年齡依賴性變化，以及mRNA的下調(diào)Toll樣受體和抗菌肽的表達[42-43]。在犢牛腸黏膜轉(zhuǎn)錄組的變化研究中，發(fā)現(xiàn)在犢牛早期，空腸和回腸之間出現(xiàn)了快速的轉(zhuǎn)錄差異，這項研究表明，犢牛出生后的第1周是腸黏膜免疫系統(tǒng)的動態(tài)發(fā)育期，這可能與定植微生物組的豐富性和多樣性有關(guān)[44]。

3 影響幼齡反芻動物胃腸道微生物定植的營養(yǎng)因素

關(guān)于影響胃腸道微生物定植的因素，在人類上的研究頗多，而在畜牧業(yè)上的研究較少。胃腸道中的可利用營養(yǎng)物質(zhì)、微生物利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力以及促進微生物附著的因素，是胃腸道微生物定植階段的主要因素[45]。例如，黏液層中存在的黏蛋白聚糖為微生物群提供結(jié)合位點和能量來源，是介導腸道微生物群宿主選擇的機制之一[46]。目前研究表明，飼糧是影響幼齡反芻動物胃腸道微生物定植的主要因素之一，隨著犢牛日齡增長和固體飼料的攝入，犢牛胃腸道微生物群落的個體差異在減小，多樣性在增加[18,47]。

3.1 初乳

由于奶牛的上皮絨毛胎盤有6層組織(胎兒側(cè)為3層，母體側(cè)為3層)，阻礙了母體血液供應(yīng)與胎兒血液供應(yīng)的接觸，造成母體免疫球蛋白無法更好地傳遞給胎兒；以及由于胎盤孕酮和前列腺素、母體皮質(zhì)醇和雌激素以及胎兒皮質(zhì)醇的作用，犢牛在子宮內(nèi)開始發(fā)育的先天性和適應(yīng)性免疫在分娩期間受到抑制，犢牛出生后免疫機能低下，初乳作為新生犢牛胃腸道微生物定植的營養(yǎng)基質(zhì)，使得及時飼喂初乳顯得尤為重要。相較于牛的常乳，初乳含有更大比例的總固體、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素、激素、細胞因子和生長因子[48-49]。研究表明，與缺乏初乳的犢牛相比，喂食新鮮或熱處理的初乳會增加梭狀芽孢桿菌和雙歧桿菌豐度，并減少犢牛結(jié)腸中大腸桿菌的豐度[50]。已知初乳中的維生素A、維生素D和維生素E以及許多生物活性化合物會影響胃腸道上皮成熟、膜完整性、基因表達和免疫調(diào)節(jié)，這些可能會共同影響胃腸道中微生物定植[51-52]。

3.2 仔畜補料

在瘤胃細菌中，濃縮料對擬桿菌屬、副桿菌屬、副球菌屬和鏈球菌屬的影響最為明顯，有研究表明，這些細菌在第7天為優(yōu)勢菌群，并在開始攝入發(fā)酵濃縮料的28 d后，被大皰菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬和琥珀酸桿菌屬的成員所取代，說明濃縮料可以促進相關(guān)細菌的定植[27]。除此之外，有研究報道，在斷奶前提供發(fā)酵濃縮料能增加甲烷球菌的豐度，甲烷球菌是一種能有效產(chǎn)生腸道甲烷的古菌，為細菌提供生長底物，具有顯著的效果；并且通過改變盲腸微生物群，增加Allistipes、副擬桿菌屬、Parassutterella和丁酸單胞菌屬的豐度，這些微生物參與纖維和碳水化合物的消化并與產(chǎn)生丁酸有關(guān)，降低了與炎癥因子相關(guān)的基因表達，例如白細胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[53]。在犢牛斷奶前，后腸道淀粉降解菌的定植也至關(guān)重要，因為犢牛瘤胃利用淀粉的能力有限。而在成年牛中，未經(jīng)瘤胃降解的淀粉到達小腸后，在α-淀粉酶和麥芽糖酶的作用下進行水解，但這些水解酶在犢牛的后腸道中活性并不高[54]。也有研究報道，犢牛對淀粉的利用主要是由小腸和大腸的微生物降解，而非宿主酶[55]。

4 幼齡反芻動物胃腸道微生物的調(diào)控措施

相較于成年反芻動物，幼齡反芻動物胃腸道微生物群具有較強的可塑性，可以通過人為干預(yù)使其有利于胃腸道更好的發(fā)育，但調(diào)控添加劑的選擇和在胃腸道中的作用機制，一直是國內(nèi)外學者探究的熱點問題。常見的調(diào)控添加劑有：益生菌、益生元、抗菌肽、有機酸。

4.1 益生菌

人們對于益生菌的定義歷經(jīng)多次修改，2014年由國際益生菌和益生元科學協(xié)會(ISAPP)提出最新定義：嚴格選擇的微生物菌株，如果給予足夠的量，能夠為宿主帶來健康益處[56]。相比于仔豬和雛雞，益生菌在幼齡反芻動物胃腸道上的研究較少。國外一項研究表明，從北美駝鹿瘤胃中分解出纖維分解菌，經(jīng)過培養(yǎng)篩選益生菌的候選物后，在代乳粉中添加解淀粉芽孢桿菌H57、小孔芽孢桿菌VTM4R85、堅強芽孢桿菌VTM2R84、地衣芽孢桿菌VTM2R66、地衣芽孢桿菌VTM1R74和腐生葡萄球菌VTM2R84等益生菌，可以提高羔羊瘤胃中普雷沃氏菌科、瘤胃球菌科相對豐度，而毛螺菌科相對豐度降低[57]。也有研究表明，在代乳粉中添加布拉迪酵母CNCMI-1079，犢牛瘤胃中瘤胃球菌科相對豐度降低，盲腸中致病性菌屬(黏膜鏈球菌菌屬)和回腸中病原菌(黏膜艱難梭菌屬)相對豐度降低，回腸中黏膜纖維桿菌屬、歐氏菌屬、羅斯氏菌屬相對豐度提高[58]；其中歐氏菌是一種乳酸菌，能夠耐膽汁酸和利用黏蛋白，而羅斯氏菌是一種產(chǎn)丁酸菌，為消化道細胞供能，且具有抗炎和維持正常免疫功能[59]。

4.2 益生元

益生元被定義為允許特定變化的選擇性發(fā)酵成分，無論是腸道微生物組成或活性方面，都對宿主的健康有益[60]。為了實現(xiàn)益生菌在胃腸道的定植和生長，開發(fā)了不同類型的益生元。通常乳酸桿菌和雙歧桿菌是益生元所針對的細菌屬，例如低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)[61]。FOS和GOS會增加乳酸和短鏈脂肪酸的濃度并抑制病原體(如大腸桿菌、沙門氏菌)的生長[62-63]。有研究表明，向新生犢牛補充益生元(低聚半乳糖)，其與2周齡犢牛結(jié)腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度增加有關(guān)，這種影響在4周的犢牛身上不太明顯，這表明與益生菌一樣，對犢牛補充益生元在早期定植期更容易操縱微生物群[64]。

4.3 抗菌肽

抗菌肽又稱抗微生物肽，是生物機體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的一類抗微生物的短肽[65]。張萌萌[66]研究發(fā)現(xiàn)，在24日齡的雄性羔羊飼糧中添加抗菌肽CC34，可以增加羔羊瘤胃中琥珀酸弧菌屬的含量。也有研究表明，在羔羊飼糧中添加抗菌肽(PBD-mI、LUC-n)，瘤胃中纖維桿菌屬、厭氧弧菌屬和琥珀酸菌屬的相對豐度提高，Paraprevotellaceae-CF23、琥珀弧菌屬、硒單胞菌屬和密螺旋體屬的相對豐度降低[67]。Liu等[68]研究表明，抗菌肽可以增加山羊瘤胃微生物多樣性。

4.4 有機酸

有機酸不僅包括短鏈脂肪酸，還包括乳酸、甲酸和其他長鏈脂肪酸。其作用機制為：1)降低胃pH，從而減少間接存在的酸敏感細菌；2)促進蛋白水解酶活性和營養(yǎng)消化率、增強胰腺分泌物、促進消化酶活性、創(chuàng)造微生物群落的穩(wěn)定性和刺激有益細菌的生長以及抑菌來改善胃腸道的狀況，對病原菌有殺菌作用[69-70]。而在早期補充丁酸鈉可以促進羔羊腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的定植，并抑制腸道中大腸桿菌的定植[71]。O’hara等[72]研究發(fā)現(xiàn)，包被丁酸鈉可提高犢牛后腸道揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生菌和有益菌的豐度，減少損害腸道的艱難桿菌屬的豐度。

除此之外，瘤胃菌群移植(RMT)作為一種干預(yù)幼齡反芻動物胃腸道微生物早期定植的技術(shù)，值得深入研究與探討。有研究表明，相比于斷奶期間口服成年羊瘤胃液，斷奶前接種成年羊瘤胃液，更能促進羔羊瘤胃中產(chǎn)琥珀酸菌屬、普雷沃氏菌屬和變形菌綱S24-7菌屬的定植[73]。在類似研究中，Yu等[74]在飼喂羔羊凍干瘤胃液后，發(fā)現(xiàn)改變了埃氏巨型球菌和反芻月型單胞菌的組成，并降低了瘤胃中黃色瘤胃球菌的豐度。也有研究表明，給斷奶前犢?？诜屑毦驮鷦游锏慕臃N物對瘤胃微生物群沒有顯著影響，但是會減少犢牛腹瀉[75]。相比于瘤胃菌群移植，糞便菌群移植(FMT)是改變腸道菌群最前沿的方法，但糞便菌群移植多數(shù)用于治療人類疾病，而在反芻動物上的研究較少。在關(guān)于糞便菌群移植的報道中，糞便菌群移植可以改善斷奶前犢牛的腹瀉情況，而這種情況的改善，與糞便菌群移植導致的犢牛腸道微生物的變化和促進腸道微生物的成熟有關(guān)[76]。

5 小 結(jié)

胃腸道微生物一直是國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域，無論是幼齡反芻動物還是成年反芻動物。相比于成年反芻動物，幼齡反芻動物胃腸道微生物具有可塑性，并且通過人為技術(shù)干預(yù)，可以改善早期胃腸道微生物定植情況，起到提高生產(chǎn)性能、促進胃腸道發(fā)育和預(yù)防疾病等作用。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于幼齡反芻動物胃腸道微生物的研究收獲頗豐，但仍有許多問題未解決。未來研究方向應(yīng)闡明：反芻動物妊娠期母體與胎兒如何進行胃腸道微生物定植；幼齡反芻動物胃腸道微生物與宿主之間相互作用機制；熟練掌握幼齡反芻動物早期人為干預(yù)技術(shù)等。