張雯，唐雅倫，叢曉東，何沂，王冰，金沐陽，周瑞玲，張瓊

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是一類以肺動脈壓力升高、肺血管阻力增加、肺血管重塑為主要特征，進而導(dǎo)致右心衰竭和死亡的難以逆轉(zhuǎn)和治療的疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球約有1%的人口受到PH的困擾，其中死于右心衰竭的PH患者高達70%，且呈逐年上升趨勢，該病的高殘死率嚴重降低患者生活質(zhì)量，易給社會造成巨大經(jīng)濟負擔(dān)[1-2]。近年來，多數(shù)學(xué)者的研究指出，PH發(fā)病與炎癥因子、巨噬細胞以及多種離子通道(K+通道、Ca2+通道)相關(guān)，可能涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝、離子通道等多個途徑，這些復(fù)雜機制導(dǎo)致本病無特效治療藥物及公認治療準則，且具有不良預(yù)后[3-4]。因此，探究PH的發(fā)病機制及有效干預(yù)措施具有重要意義。

中醫(yī)藥防治肺動脈高壓具有多靶點、整體雙向調(diào)節(jié)、毒副作用低等優(yōu)勢[5]。根據(jù)PH臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“肺脹”“喘證”“水腫”等范疇，肺絡(luò)虛損、毒瘀損絡(luò)是其致病關(guān)鍵病機[6]。本課題組前期基于毒瘀理論設(shè)計以紅花為君藥的復(fù)方治療慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD，簡稱慢阻肺)并發(fā)肺動脈高壓患者的隨機對照試驗，證實該方在改善患者臨床癥狀、增加活動耐力、提高生活質(zhì)量上有顯著作用，且無不良反應(yīng)[6]。中藥紅花系菊科植物紅花的干燥花，始載于《開寶本草》，有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅花具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、擴張血管等作用。近年來，紅花及其提取物已被廣泛應(yīng)用于肺動脈高壓、肺源性心臟病、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等心肺系統(tǒng)疾病，療效甚佳[7]，但紅花治療肺動脈高壓的作用機制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時代中信息科學(xué)和醫(yī)學(xué)生命科學(xué)交叉形成的創(chuàng)新突破口，更是中醫(yī)藥領(lǐng)域用于揭示藥物系統(tǒng)性藥理機制、探索潛在信號通路、指導(dǎo)新藥開發(fā)的重要工具[8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，以紅花為研究對象，預(yù)測其主要活性化學(xué)成分、治療PH潛在關(guān)鍵靶點、可能作用的信號通路，以期為揭示紅花治療PH作用機制提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 紅花化學(xué)成分及靶點篩選應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)[9]、本草組鑒數(shù)據(jù)庫(HERB，http：//drug.ac.cn/)、中醫(yī)綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID，http：//bidd.group/TCMID/)、中國知網(wǎng)(China national knowledge infrastructure，CNKI，https：//www.cnki.net/)檢索篩選以獲取中藥紅花的活性化學(xué)成分。TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選條件設(shè)置為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nl.nih.gov)中獲得紅花活性成分的相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(Canonical SMILES)，將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測相關(guān)靶標，并在UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//ebi14.uniprot.org/)[10]對相關(guān)靶標名稱進行標準化。

1.2 PH相關(guān)靶點篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)、TTD數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//omim.org)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)中檢索PH疾病靶標，以相關(guān)性分值Relevance score>10作為限定條件，經(jīng)篩選、整合、去重后得到PH疾病靶標。

1.3 紅花活性成分抗PH的潛在靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析在STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)依次分別導(dǎo)出紅花活性成分靶點及PH疾病靶標的相互作用網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定最低相互作用閾值(highest confidence)≥0.9，物種設(shè)置為人類相關(guān)(Homo sapiens)，隱藏孤立節(jié)點，將以上兩個網(wǎng)絡(luò)作用圖以tsv格式導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件[11]，然后整合、美化，得到紅花抗PH的所有潛在交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。按照度中心性(degree)、中間性中心性(betweenness centrality)、鄰近度中心度(closeness centrality)均大于平均值，平均最短路徑長度(average shortest path length)小于平均值的條件在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選紅花治療PH的潛在核心靶點。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)及Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/)對潛在核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。查閱相關(guān)文獻[12-13]，結(jié)合兩位正高級專家意見，依據(jù)P值及富集分數(shù)(enrichment)大小篩選生物過程和信號通路，并導(dǎo)入生物信息學(xué)工具(http：//www.bioinformatics.com.cn/)，繪制氣泡圖和柱狀圖。在KEGG(https：//www.genome.jp/kegg)網(wǎng)站導(dǎo)出關(guān)鍵信號通路圖。為了更清楚展示紅花治療PH各組分間關(guān)系，根據(jù)以上通路富集結(jié)果，回溯PPI網(wǎng)絡(luò)中紅花治療PH的所有交集靶點，補充相關(guān)信息，構(gòu)建“紅花-活性成分-靶點-通路-PH”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 紅花活性成分與潛在靶點分子對接根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及KEGG通路分析結(jié)果，篩選出度值靠前的活性化學(xué)成分、關(guān)鍵通路核心靶點。在PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/pdb/)[14]依次下載獲取藥物活性成分對應(yīng)的配體化合物結(jié)構(gòu)及靶蛋白對應(yīng)的活性位點三維晶體結(jié)構(gòu)。利用PyMOL軟件，通過加氫、計算電荷、去除目標蛋白多構(gòu)象、轉(zhuǎn)化格式等來處理3D結(jié)構(gòu)文件后在AutoDock Vina 4.6.2軟件進行分子對接，并保留結(jié)合能絕對值最高及相對穩(wěn)定的構(gòu)象，繪制3D結(jié)合模式圖[15-16]。

2 結(jié)果

2.1 紅花活性成分及相關(guān)靶點及PH疾病靶點Swiss Target Prediction預(yù)測分析后，共獲取紅花成分相關(guān)靶點607個。合并TTD、DrugBank、DisGeNET、GeneCards、OMIM五大數(shù)據(jù)庫，共得到1 613個與PH相關(guān)的靶基因。經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選及文獻補充后，共得到紅花的主要活性成分20種，見表1。

表1 紅花主要活性成分信息表

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件分析、合并、美化后，得到了紅花抗PH的所有潛在交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。拓撲分析結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)包括175個節(jié)點，1 748個相互作用關(guān)系，聚類系數(shù)為0.395，度值中位數(shù)及平均數(shù)依次為12和3.65，平均相鄰節(jié)點數(shù)為9，平均最短路徑中位數(shù)為2.879。綜合以上參數(shù)，對PPI網(wǎng)絡(luò)進行進一步篩選，最終得到關(guān)聯(lián)度最高的48個核心靶點，這些核心靶點可能為紅花抗PH的關(guān)鍵靶蛋白，見圖2。

圖1 紅花治療PH的潛在交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 紅花治療PH的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 KEGG信號通路富集分析結(jié)果及GO功能富集分析結(jié)果KEGG富集分析共得到信號通路144條(P<0.05)。48個核心靶點主要參與NOD樣受體、C型凝集素受體、Janus激酶(janus kinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號通路等免疫相關(guān)信號通路，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)等炎癥相關(guān)信號通路，脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、黏著斑、松弛素等心血管相關(guān)信號通路及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)-AGEs受體(receptor of AGEs，RAGE)、Rap1等代謝相關(guān)信號通路。保留P值及富集分數(shù)靠前的20條通路，以氣泡圖形式可視化，見圖3。其中NOD樣受體信號通路如圖4所示。補充與該20條富集通路相關(guān)的活性成分及靶點信息，得到“紅花-活性成分-靶點-通路-PH”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5，圖中紅色三角形代表藥物紅花，粉色菱形代表前20條信號通路相關(guān)的活性成分，黃色倒箭頭形代表前20條信號通路相關(guān)的靶點，紫色菱形代表前20條信號通路，紫色三角形代表疾病PH。

圖3 KEGG通路分析氣泡圖

注：圖中紅色節(jié)點為紅花治療PH的潛在靶點；綠色節(jié)點為通路中的相關(guān)靶點

GO功能分析共獲得54個條目(P<0.05)，包括生物過程(biological process，BP)20條、細胞組分(cellular component，CC)14條及分子功能(molecular function，MF)20條，見圖6，即紅花治療PH可能涉及對機械刺激的反應(yīng)(response to mechanical stimulus)、對活性氧反應(yīng)(response to reactive oxygen species)、調(diào)節(jié)細胞對壓力的反應(yīng)(regulation of cellular response to stress)、平滑肌細胞增殖的調(diào)節(jié)(regulation of smooth muscle cell proliferation)等生物過程，有黏著斑(focal adhesion)、囊泡(vesicle lumen)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)等細胞成分參與，影響蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、激酶綁定(kinase binding)、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、腫瘤壞死因子受體結(jié)合(tumor necrosis factor receptor binding)等分子功能。

圖6 GO功能分析條目圖

2.4 分子對接結(jié)果分子對接是一項通過算法計算模擬給定靶點蛋白質(zhì)和配體小分子發(fā)生的物理化學(xué)反應(yīng)，從而達到預(yù)測兩者結(jié)合模式及親和力的新型研究技術(shù)[17]。配體和受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定性稱為結(jié)合能(kcal·mol-1)，結(jié)合能絕對值大于0 kcal·mol-1則具有結(jié)合位點且可自發(fā)結(jié)合，絕對值大于5 kcal·mol-1則有較好的活性結(jié)合位點，且結(jié)合親和力高。本研究選取的10個靶點分別是PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前4位的靶點原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、MAPK3及NOD樣受體通路中其它度值排名靠前的關(guān)鍵靶點，如熱休克蛋白90a(heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90AA1)、NOD樣受體家族的吡啶結(jié)構(gòu)域 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1，CASP1)、白細胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，BCL2)、RELA。對接配體化合物為“紅花-活性成分-靶點-通路-PH”網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的7位，MOL ID依次為MOL002694、MOL002714、MOL002719、MOL002680、MOL002757、MOL002690、MOL002776。結(jié)果顯示，紅花大部分活性成分與靶標有較強結(jié)合能力，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定，其中結(jié)合能絕對值最高可達10.4 kJ·mol-1，為羥基紅花黃色素A(MOL002690)與NLRP3，此組合具有8種結(jié)合模式，最高可含7個氫鍵連接。綜合分析表明，紅花的活性成分羥基紅花黃色素A、黃芩苷(MOL002776)和毛莨黃素(MOL002680)可能通過作用靶點NLRP3、HSP90AA1、IL-1β、MAPK3發(fā)揮抗PH作用。見圖7、圖8。

圖7 紅花活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果熱圖

3 討論

本課題組前期曾對197例COPD并發(fā)PH的住院患者進行檢驗指標分析，發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白、白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、纖維蛋白原濃度、D-二聚體等炎癥因子和凝血指標都具有異常升高趨勢，患者同時存在炎癥和高凝狀態(tài)，且這類患者中醫(yī)證型分布主要以毒瘀互結(jié)為主?；诖?，本團隊認為“毒瘀損肺”是COPD相關(guān)PH形成的關(guān)鍵病機，治療上以清熱解毒、活血化瘀為法，可達到達抗炎、擴張血管、抗凝血等作用[18-21]。目前多項研究已經(jīng)證實，解毒祛瘀中藥具有很好的抗炎作用，能夠減輕急性肺損傷的肺水腫，提高動脈氧分壓，減少肺部中性粒細胞浸潤。張瓊教授結(jié)合臨床PH診治經(jīng)驗及現(xiàn)代藥理研究，擬方“解毒祛瘀方”用于治療COPD并發(fā)PH患者發(fā)現(xiàn)，該方在改善患者臨床癥狀、增加活動耐力、提高生活質(zhì)量上有顯著作用，且無不良反應(yīng)，具有一定的研究意義[6]。

紅花為“解毒祛瘀方”的君藥，味辛性溫，《本草綱目》言其“活血、潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)”，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛之功效。藥理學(xué)研究顯示，紅花有效成分具有擴張血管、改善微循環(huán)狀態(tài)、降血壓、消炎、增強免疫、調(diào)節(jié)體內(nèi)微量元素水平等作用，臨床應(yīng)用廣泛[7]。多項臨床研究顯示，紅花及其多種制劑在治療PH上有顯著作用，可減輕氣道慢性炎癥狀態(tài)，降低肺血管重塑，調(diào)節(jié)肺動脈壓力[22-25]。本課題組前期研究及目前多項實驗皆表明，紅花治療PH具有顯著優(yōu)勢及良好前景。基于以上基礎(chǔ)，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選紅花治療PH的可能活性化學(xué)成分、潛在作用靶點及相關(guān)信號通路，并采用分子對接技術(shù)預(yù)測蛋白-配體復(fù)合物的結(jié)合模式及親和力，以期為后續(xù)紅花治療PH的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)分析及分子對接結(jié)果顯示，紅花抗PH的主要活性成分涉及羥基紅花黃色素A、黃芩苷、毛莨黃素、黃芩素和6-羥基柚皮素等，作用于NLRP3、CASP-1、IL-1β、RELA、HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、SRC等關(guān)鍵靶點，經(jīng)黏著斑、囊泡、線粒體外膜等細胞成分，參與對外界刺激如機械刺激、活性氧反應(yīng)、細胞應(yīng)激反應(yīng)、肺血管平滑細胞增殖等生物學(xué)過程，調(diào)控蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶綁定、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合等分子功能，調(diào)節(jié)NOD樣受體、C型凝集素受體、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、MAPK等信號通路，發(fā)揮抗PH作用。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織和歐洲呼吸病協(xié)會(European Respiratory Journal)指南，PH定義為靜息狀態(tài)下平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或肺動脈收縮壓(systolic pulmonary artery pressure，sPAP)≥30mm Hg或活動狀態(tài)下mPAP≥30mm Hg，是一種罕見而難以治愈的慢性肺血管病變，5年病死率可達53.6%[1-2]。近年大量研究發(fā)現(xiàn)，單純抗血管內(nèi)皮障礙、舒張血管來治療PH的遠期獲益并不顯著，而炎癥作為判斷PH的新指標，已逐漸在醫(yī)學(xué)界得到廣泛重視[26]。肺血管內(nèi)炎癥反應(yīng)是引發(fā)肺動脈高壓肺血管重塑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NOD樣受體家族的吡啶結(jié)構(gòu)域 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)所形成的模式識別受體是迄今為止特征最豐富的蛋白復(fù)合物，其過度激活狀態(tài)下可調(diào)節(jié)下游IL-1β、IL-6、IL-18等炎性因子分泌，導(dǎo)致PH模型大鼠肺組織發(fā)生血管內(nèi)皮損傷，聚集大量免疫細胞及炎性細胞浸潤，引起線粒體功能異常，誘發(fā)肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡[27-29]。多項臨床及動物模型研究證據(jù)表明，炎癥持續(xù)存在于PH整個病理進程中，促炎因子水平直接影響PH患者血流動力學(xué)參數(shù)，更是預(yù)測患者住院、甚至死亡的重要生物標志物[30]。因此，調(diào)節(jié)PH患者炎癥反應(yīng)，認識重要炎癥調(diào)節(jié)因子NLRP3在PH中的病理過程可能為抑制炎癥聯(lián)級反應(yīng)、減慢疾病發(fā)展進程、治療PH提供思路及策略。

本研究KEGG網(wǎng)絡(luò)中與NLRP3相關(guān)的NOD樣受體通路顯示，K+外流、細胞外高濃度的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate，ATP)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式及腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)、IL-1β等細胞促炎因子，皆可構(gòu)成啟動信號識別NF-κB、激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)。其中RELA屬NF-κB最重要功能亞基，是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞炎癥、免疫、凋亡等多種生物過程，可直接刺激并促進NLRP3炎性小體的組裝[31]。NLRP3炎性小體結(jié)構(gòu)由傳導(dǎo)器NLRP3、效應(yīng)器CASP-1前體及接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)共同組成，其中HSP90AA1作為一種具有分子伴侶作用的小分子熱休克蛋白，常在NLRP3轉(zhuǎn)錄過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生，可防止底物蛋白變性。炎性小體通過引起Caspase-1前體自動剪切、活化、成熟，進而加工裂解IL-1β前體和IL-18前體為有活性的促炎性因子IL-1β和IL-18，以促進下游炎性反應(yīng)。CASP-1是一種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，活化后可裂解經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體共有的關(guān)鍵下游效應(yīng)蛋白gasdermin D(GSDMD)，引起細胞焦亡，還可直接刺激大量促炎性細胞因子的釋放。Villegas等[32]研究表明，抑制PH模型小鼠體內(nèi)巨噬細胞中NLRP3炎性小體的激活，可直接改善其肺部炎癥，降低肺動脈壓力。由此可見，NLRP3炎癥小體通過炎癥反應(yīng)參與PH的發(fā)病。肺血管重塑是PH患者的主要病理基礎(chǔ)，肺血管內(nèi)皮及平滑肌細胞的惡性增殖、炎性細胞的浸潤是造成肺血管阻力增加、血管重塑的主要原因。已有研究證據(jù)顯示[33-35]，CASP-1的上調(diào)可觸發(fā)肺動脈血管內(nèi)皮細胞焦亡，還可促進IL-1β等促炎因子的釋放，進而引起血管內(nèi)皮功能障礙，誘發(fā)缺氧型PH；而CASP-1基因的敲除可直接減弱PH模型小鼠肺動脈的肌化及肺血管平滑肌細胞的惡性增殖；敲除白細胞介素1受體I型(interleukin 1 receptor type I，IL-1R1)基因后，IL-1β介導(dǎo)的肺血管平滑肌細胞增殖亦得到明顯抑制。因此，NLRP3炎性小體、CASP1及IL-1β等可能成為抗PH較為有前景的靶點，應(yīng)用其相關(guān)抑制劑治療PH可能對PH患者臨床癥狀的改善、遠期存活率的提高有積極作用。

Maneesai等[36]研究顯示，紅花提取物具有一定的降壓作用，可協(xié)同卡托普利等藥物增強降血壓效果。羥基紅花黃色素A作為紅花提取物的主要成分之一，已有多項研究證實其在肺動脈高壓治療上的優(yōu)勢，特別是針對COPD相關(guān)性PH。Li等[37]通過將羥基紅花黃色素A用于PH模型大鼠，觀察并評估其肺動脈壓力變化、肺動脈重塑及肺動脈平滑肌細胞增殖等情況，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A可顯著降低PH大鼠平均右心室收縮壓，并抑制肺動脈平滑肌細胞增殖，進而減弱肺動脈血管重塑及右心室重構(gòu)，且具有一定的濃度依賴性。黃芩苷是一種類黃酮化合物，現(xiàn)代藥理顯示其具有抗炎、抗氧化、降血壓、抗變態(tài)反應(yīng)及抑制血管平滑肌增殖等活性，被廣泛應(yīng)用于肺部及心血管疾病的研究[38]。吳佩亮等[39]通過肺動脈高壓小鼠體內(nèi)外實驗研究證實，黃芩苷能減輕PH小鼠的肺動脈壓力，通過顯著抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，降低其細胞增殖相關(guān)蛋白表達水平而改善低氧誘導(dǎo)的PH肺動脈血管重塑。更有研究進一步證實黃芩苷降低肺動脈壓力、減輕肺損傷及改善右心室肥厚等與NF-κB信號傳導(dǎo)下調(diào)相關(guān)[40]。PH患者肺血管重構(gòu)多與肺動脈各種細胞惡性增殖相關(guān)，內(nèi)皮細胞凋亡也是其發(fā)展的重要因素。黃芩素是一種黃酮類化合物，具有抑制肺動脈平滑肌細胞增殖的生物活性。朱迪穎等[41]運用黃芩素治療PH大鼠后觀察其肺血管壁厚度，證實黃芩素具有顯著抗PH作用，且可能與抑制MAPK信號通路改善抗增殖作用相關(guān)。Shi等[42]研究野百合堿誘導(dǎo)的PH大鼠發(fā)現(xiàn)，PH肺血管重塑發(fā)生于激活的炎癥級聯(lián)反應(yīng)之后，而黃芩素可通過抑制PH肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)，下調(diào)炎性細胞聚集及IL-1β、TNF-α等炎性因子表達，從而逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，且黃芩素治療PH發(fā)揮抗增殖及抗炎效應(yīng)主要涉及NF-κB和MAPK信號通路，其中MAPK主要包括 P38 MAPK、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和 應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase SAPK，JNK)，是細胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要酶。

GO分析的MF結(jié)果顯示，紅花治療PH與調(diào)控蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶綁定、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合等分子功能相關(guān)。NLRP3炎性小體的形成屬于NLRP3與pro-CASP1、ASC蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合過程，其啟動信號由TNF-α等促炎性細胞因子構(gòu)成，腫瘤壞死因子受體結(jié)合參與該激活過程[43]。蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶參與協(xié)同刺激信號的啟動，這類激酶一般在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中下游發(fā)揮作用，可激活MAPK、AKT等信號通路，刺激肺血管內(nèi)皮細胞炎性分子的分泌[44]。紅花可抑制TNF-α啟動信號的生成、NLRP3炎性小體的形成及促炎性細胞因子的釋放，從而調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)皮功能障礙，緩解血管重構(gòu)。BP分析發(fā)現(xiàn)，紅花抗PH過程中對外界刺激如機械刺激、活性氧反應(yīng)、細胞應(yīng)激反應(yīng)等皆有調(diào)節(jié)作用，同時通過調(diào)節(jié)細胞凋亡信號傳導(dǎo)，參與調(diào)控肺血管平滑肌細胞增殖，進而對心臟病變有一定干預(yù)作用。CC分析顯示，紅花主要影響?zhàn)ぶ摺⒛遗?、線粒體外膜等細胞組成部分而參與抗PH。黏著斑是調(diào)控細胞黏附、機械傳感和控制細胞生長及分化的信號，可通過相關(guān)通路作用于人肺動脈平滑肌細胞[45]。囊泡是免疫識別、分泌蛋白的重要載體，可由肺動脈內(nèi)皮細胞病理狀態(tài)下過度分泌釋放至肺平滑肌細胞，從而引起肺平滑肌細胞增殖，最終促進肺動脈高壓的形成[46]。肺動脈高壓血管重構(gòu)的重要細胞中，線粒體的功能異?？芍苯蛹せ頝F-κB途徑介導(dǎo)的炎性分子表達，促進細胞增殖[47]。因此本研究認為，紅花可能通過抑制PH患者黏著斑相關(guān)通路，調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制肺血管內(nèi)皮細胞分泌囊泡，發(fā)揮抗血管平滑肌細胞增殖作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究紅花治療PH的作用機制，發(fā)現(xiàn)紅花主要化學(xué)成分羥基紅花黃色素A、黃芩苷、黃芩素等共同作用于NLRP3、CASP-1、IL-1β、HSP90AA1、MAPK3、RELA等靶點蛋白，調(diào)節(jié)NOD樣受體、MAPK等信號通路，抑制細胞凋亡及炎癥反應(yīng)，改善肺血管內(nèi)皮功能障礙，逆轉(zhuǎn)肺動脈平滑肌的惡性增殖而發(fā)揮抗PH作用，該研究進一步揭示了紅花可通過多成分-多靶點-多通路共同調(diào)控PH的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為中藥紅花的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及參考依據(jù)，后續(xù)紅花提取物羥基紅花黃色素A治療PH的機制研究將在此基礎(chǔ)上展開，以期為治療PH找到新的靶點抑制劑提供思路。