周蓉，黃柳向

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000

功能性便秘(functional constipation，F(xiàn)C)和功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)均是臨床上常見的功能性疾病。FC是指排除藥物及器質(zhì)性等因素，表現(xiàn)為糞質(zhì)干硬、排便不盡感、排便費(fèi)力等，每周自主排便少于3次的一種功能性腸病[1]，其病因可能與生活飲食習(xí)慣、腸道菌群失調(diào)、生理性括約肌障礙、精神心理等因素有關(guān)[2]。促動(dòng)力藥、促分泌劑、瀉藥、膳食纖維制劑和中成藥等治療是FC的主要治療手段，生物反饋治療、改善心理狀態(tài)有助于提高治療效果[3]。近年來，腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)對FC的效果明顯，說明腸道微生態(tài)紊亂可能是FC發(fā)病的關(guān)鍵因素[4]。FD是一種主要表現(xiàn)為腹部脹滿、疼痛、早飽、餐后飽脹，常伴有食欲減退、噯氣、惡心嘔吐等不適，并需排除器質(zhì)性運(yùn)輸影響的疾病[5]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括幽門螺旋桿菌感染、胃腸道功能障礙、內(nèi)臟高敏感性[6]，治療方法主要為H2受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑、促動(dòng)力藥物、消化酶制劑、精神心理治療及適當(dāng)Hp根除治療[7]。

FC中醫(yī)屬于“便秘”，病位看似在大腸，實(shí)則在脾、胃，并與肝關(guān)系密切[8]。邱健行認(rèn)為FC多因寒熱外邪、飲食不節(jié)、年老體衰引起，病機(jī)為氣血陰陽虧虛、冷熱積滯等[9]。FD中醫(yī)可歸屬于“痞滿”，病因包括感受外邪、情志失調(diào)、飲食不節(jié)、稟賦不足和勞倦過度等，基本病機(jī)為脾虛氣滯，其病位在胃，與肝脾密切相關(guān)[10]。FC和FD均為典型的慢性功能性胃腸道疾病，其病因相似，與脾胃關(guān)系密切，兩者往往伴隨出現(xiàn)，兼有腹痛、腹脹等不適[11]。枳術(shù)丸是由白術(shù)和枳實(shí)(21)兩味藥組成的經(jīng)典方劑，方中白術(shù)健脾燥濕，助脾胃之運(yùn)化；枳實(shí)破氣消積除痞，二者配伍，一補(bǔ)一消，白術(shù)的用量是枳實(shí)2倍，補(bǔ)重于消，以健脾為主，兼以理氣，共奏理氣和胃、消痞除滿之功[12]。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明，枳術(shù)丸治療消化系統(tǒng)疾病有確切的療效，體現(xiàn)了該方“異病同治”的特點(diǎn)[13-17]。

中藥復(fù)方治療FC和FD療效好、安全性高，且具有多靶點(diǎn)、多層次的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以使藥物與疾病之間的聯(lián)系具有整體性、系統(tǒng)性，對發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)、指導(dǎo)新藥研發(fā)、揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論均具有一定的指導(dǎo)性[18]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討枳術(shù)丸對FC和FD“異病同治”的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 枳術(shù)丸活性成分及靶點(diǎn)的獲取本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索白術(shù)和枳實(shí)的化學(xué)成分，并根據(jù)人體口服藥物的生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18對白術(shù)和枳實(shí)的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，采用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫對篩選出的相關(guān)作用靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行規(guī)范化。將篩選后的藥物活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取以“functional constipation”和“functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞，選擇參數(shù)“Relevance score”大于其中位數(shù)，在Gene Cards疾病數(shù)據(jù)庫分別篩選出FC及FD的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.3 枳術(shù)丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)及FC、FD交集靶點(diǎn)的搜集使用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)在線作圖平臺，分別輸入枳術(shù)丸活性成分靶點(diǎn)與FC和FD的疾病靶點(diǎn)，得到枳術(shù)丸治療FC及FD的潛在靶點(diǎn)和韋恩圖，以展示其交互作用關(guān)系。

1.4 潛在靶點(diǎn)的蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)導(dǎo)入潛在靶點(diǎn)，設(shè)定物種為人類“Homo sapiens”，蛋白相互關(guān)系置信度≥0.4，利用Cytoscape3.7.2軟件，使用“Network Analyze”得出其PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析為深入研究枳術(shù)丸對FC和FD“異病同治”的作用途徑及機(jī)制，將枳術(shù)丸治療FC、FD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org)，設(shè)定參數(shù)為H species且P<0.01，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，并使用微生信平臺繪制出GO簇狀條形圖與KEGG氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 枳術(shù)丸活性成分及其靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共搜集到枳術(shù)丸的活性成分120種，其中白術(shù)55種，枳實(shí)65種，篩選后共得到活性化學(xué)成分29種，其中白術(shù)7種，枳實(shí)22種，見表1?；赥CMSP獲得活性成分相關(guān)靶點(diǎn)329個(gè)，其中白術(shù)23個(gè)，枳實(shí)306個(gè)，借助UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化并去重后得到126個(gè)靶點(diǎn)。將藥物活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

表1 枳術(shù)丸藥物活性成分

圖1 “藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 FC、FD疾病靶點(diǎn)以“functional constipation”和“functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞通過Gene Cards疾病數(shù)據(jù)庫搜索FC靶點(diǎn)2 597個(gè)、FD靶點(diǎn)2 523個(gè)，選擇參數(shù)“Relevance score”大于其中位數(shù)，篩選出FC和FD的潛在靶點(diǎn)分別有1 299個(gè)和1 263個(gè)。

2.3 枳術(shù)丸治療FC、FD的潛在靶點(diǎn)在微生信在線作圖平臺中將FC和FD疾病的靶點(diǎn)及枳術(shù)丸藥物活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射，最終得到枳術(shù)丸與FC的交集靶點(diǎn)70個(gè)，枳術(shù)丸與FD的交集靶點(diǎn)81個(gè)，枳術(shù)丸、FC及FD三者交集靶點(diǎn)63個(gè)，這些靶點(diǎn)可能是枳術(shù)丸治療FC和FD的潛在靶點(diǎn)，導(dǎo)出得到的Venn圖。見圖2。

圖2 枳術(shù)丸、FC、FD交集靶點(diǎn)Venn圖

2.4 潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入63個(gè)潛在靶點(diǎn)，并在Cytoscape 3.7.2軟件中利用“Network Analyze”作出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，圖中共63個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 784條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白之間相互作用關(guān)系，顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大則度值越大，表明該靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)越多、作用越關(guān)鍵。根據(jù)度值(degree)排序，并以度值大于中位數(shù)(32)為條件篩選出核心靶點(diǎn)蛋白32個(gè)，這32個(gè)靶點(diǎn)蛋白可能是枳術(shù)丸治療FC和FD的關(guān)鍵靶蛋白，見表2。

表2 核心靶點(diǎn)蛋白信息

圖3 枳術(shù)丸治療FC、FD的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析通過Metascape數(shù)據(jù)庫，對枳術(shù)丸治療FC和FD的63個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，設(shè)定P<0.01，共得到生物學(xué)過程(biological process，BP)1 262個(gè)、分子功能(molecular function，MF)98個(gè)和細(xì)胞學(xué)組分(cellular components，CC)62個(gè)。BP主要包括對激素的反應(yīng)(response to hormone)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、對脂質(zhì)的反應(yīng)(cellular response to lipid)、對肽的反應(yīng)(response to peptide)、對炎癥調(diào)節(jié)的反應(yīng)(regulation of inflammatory response)等；MF包括磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、信號傳導(dǎo)受體調(diào)節(jié)活性(signaling receptor regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)等；CC主要包括核包膜(nuclear envelope)、膜筏(membrane raft)、受體復(fù)合物(receptor complex)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑復(fù)合物(transcription regulator complex)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)等。根據(jù)參數(shù)Count進(jìn)行排序，對BP、MF、CC排名前10位的條目用簇狀條形圖表示，見圖4。

圖4 潛在靶點(diǎn)GO富集分析條形圖

2.6 KEGG富集分析結(jié)果KEGG富集分析共得到173條通路，根據(jù)P值將KEGG富集分析結(jié)果排序，將排名前20位通路作氣泡圖，見圖5。枳術(shù)丸治療FC和FD的潛在靶點(diǎn)參與的關(guān)鍵通路有癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、CLR信號通路、TCR信號通路、細(xì)胞凋亡、鞘脂類信號通路、IL-17信號通路、Th17細(xì)胞分化等，表明枳術(shù)丸可通過不同的信號通路協(xié)調(diào)發(fā)揮對FC和FD的“異病同治”作用。

圖5 潛在靶點(diǎn)KEGG信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

FC和FD是消化系統(tǒng)兩種常見的功能性胃腸病，隨著生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)等的改變，二者發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，中醫(yī)藥在治療功能性疾病中具有一定的優(yōu)勢[19-20]。異病同治是指不同疾病發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)了相同的病機(jī)，便可以采用相同的治療方法來治療，異病同治是辨證論治的具體體現(xiàn)[21]。枳術(shù)丸對FC和FD異病同治作用的本質(zhì)即在于辨證論治，F(xiàn)C和FD均為典型的慢性功能性胃腸道疾病，病因相似，且均與脾胃關(guān)系密切，而枳術(shù)丸臨床上常用于治療脾虛證[17，22]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，枳術(shù)丸臨床治療的優(yōu)勢病種包括FC、FD、IBS等，且多用于脾胃虛弱和脾虛氣滯之證[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢傳輸型便秘中，磷脂酶C-γ(PLC-γ)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的表達(dá)水平升高[22-24]，表明枳術(shù)丸可有效促進(jìn)脾虛證慢傳輸型便秘腸道運(yùn)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，在FD大鼠中，枳術(shù)丸可促進(jìn)胃腸道排空，減輕胃腸道敏感性，可能與5-羥色胺受體(5-HT receptor，5-HTR)和胃促生長素含量升高、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)含量降低有關(guān)[25]。

本研究設(shè)置參數(shù)OB≥30%、DL≥0.18獲得枳術(shù)丸活性成分29個(gè)，白術(shù)的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油類、多糖類、內(nèi)酯類等，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的作用，常用于胃腸道疾病的治療[26]。枳實(shí)的主要有效成分為黃酮類、揮發(fā)油類及生物堿類化合物，其具有胃腸道調(diào)節(jié)作用及抗癌、抗氧化、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、抗菌、抗炎等作用[27]。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龉驳贸?2個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，排名前10位的基因包括AKT1、TNF、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、EGFR等。AKT1與血管生成有關(guān)，可抑制細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移等過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活[28]。在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中，TNF和IL-6起著重要作用，在功能性消化不良患者中血清IL-6和TNF-α水平會升高[29]。TP53與炎癥相關(guān)，可使損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在胃腸道中可保持黏膜的完整性[30]。VEGFA具有抗抑郁效應(yīng)[31]，抑郁小鼠體內(nèi)VEGF表達(dá)水平明顯降低[32]。MAPK3與應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可增加腸道水分、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，恢復(fù)慢傳輸型便秘大鼠的腸道功能[33]。EGFR與腸道結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，具有促進(jìn)消化吸收、影響酶活性、修復(fù)受損腸道組織和促進(jìn)腸道發(fā)育等作用[34]。PPARG可減少炎癥因子的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)，腸道感染會影響PPARγ的表達(dá)及活性[35]。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2是一種誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶，在FD中，可促進(jìn)炎性反應(yīng)并能損傷部分組織，與慢性炎癥密切相關(guān)[36]。枳術(shù)丸通過以上核心靶點(diǎn)通過不同途徑調(diào)控炎癥因子并參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，減少對黏膜、血管的損傷，從多個(gè)途徑干預(yù)FC和FD。

GO富集分析與KEGG富集分析表明，枳術(shù)丸通過調(diào)控體內(nèi)多種信號通路對FC、FD發(fā)揮共同治療作用。枳術(shù)丸“異病同治”FC和FD主要通過參與調(diào)節(jié)癌癥通路、細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、TCR信號通路、CLR信號通路、AGE-RAGE信號通路、鞘脂類信號通路、Th17細(xì)胞分化及IL-17信號通路等途徑發(fā)揮調(diào)控作用。AGE-RAGE信號通路可以激活并促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，兩者相互作用，可引起二酰甘油增多，使肝臟、骨骼肌處于高血糖環(huán)境，導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[37]，而FC和FD是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，其中功能性便秘的發(fā)生率占25%[38]。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一組亞型，IL-17在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，主要通過募集和激活中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子從而引起炎癥的發(fā)生[39-40]。TNF-α是TNF家族中的主要因子，是一種促炎細(xì)胞因子，與機(jī)體免疫和細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，TNF信號通路改變會增加消化系統(tǒng)炎癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[41-42]。本研究表明，枳術(shù)丸對FC和FD的“異病同治”作用主要是通過減少細(xì)胞炎癥、激活機(jī)體免疫、抑制細(xì)胞凋亡等途徑而發(fā)揮的。

綜上所述，枳術(shù)丸對FC和FD的異病同治作用機(jī)制是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討其干預(yù)FC和FD的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，其主要通過減少炎癥反應(yīng)、激活機(jī)體免疫、抑制細(xì)胞凋亡，減少胃腸黏膜損傷，改善癥狀，為今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床運(yùn)用奠定了基礎(chǔ)。