潘中藝，王曦廷，張秀平，倪勝樓，劉旎，傅延齡

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

雷諾病是肢端小血管痙攣性或功能性閉塞引起的局部缺血現(xiàn)象，表現(xiàn)為陣發(fā)性四肢末端(手指為主)對(duì)稱性間歇發(fā)白與發(fā)紺，感覺(jué)異常，伴有指(趾)疼痛[1]。其發(fā)病率與性別、地域及氣候條件、職業(yè)環(huán)境等因素相關(guān)[2-3]，最新數(shù)據(jù)顯示，該病全球發(fā)病率為3%～5%[4]。

雷諾病屬于自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病范疇，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，一般認(rèn)為與交感神經(jīng)功能紊亂、血管敏感性因素、血管壁結(jié)構(gòu)因素、炎癥介導(dǎo)的內(nèi)分泌因素以及遺傳因素等有關(guān)?，F(xiàn)代研究表明，雷諾病好發(fā)部位如手指、腳趾等處具有豐富的微小動(dòng)脈和微小靜脈吻合，繞過(guò)毛細(xì)血管而直接連接。微血管具有較多的交感神經(jīng)分布，環(huán)境寒冷時(shí)，交感神經(jīng)活動(dòng)反射性增加，引起微血管痙攣。雷諾病患者的血管對(duì)寒冷刺激的敏感性增高，微血管痙攣更加強(qiáng)烈，引起肢端局部缺血，皮膚蒼白；痙攣后血管擴(kuò)張，動(dòng)脈、靜脈及動(dòng)靜脈吻合口的血流紊亂，血液瘀滯，皮膚呈現(xiàn)藍(lán)色或發(fā)紺[5]。此外，內(nèi)分泌因素也被認(rèn)為是雷諾病的重要發(fā)病因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，導(dǎo)致血管舒張劑如一氧化氮和前列環(huán)素的活性降低，血管收縮內(nèi)皮素-1釋放增加。炎性介導(dǎo)途徑激活導(dǎo)致上游動(dòng)脈血管舒張功能受到影響，局部毛細(xì)血管血供受阻[6]。皮膚血管中α-2腎上腺素能的增加也會(huì)使血管舒縮功能受到影響[7-8]。

本病的西醫(yī)常規(guī)治療包括藥物治療和非藥物治療。首選非藥物治療，如規(guī)避寒冷環(huán)境、心理壓力過(guò)大等誘發(fā)因素。當(dāng)非藥物治療無(wú)法有效降低血管痙攣發(fā)作的嚴(yán)重程度并改善生活質(zhì)量時(shí)，可進(jìn)行藥物治療。西醫(yī)常用藥物有鈣通道阻滯劑以及人工合成前列環(huán)素(伊洛前列素)[9]，但目前尚缺乏高質(zhì)量的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)[10-11]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，雷諾病屬于“厥逆”“寒厥”“痰厥”“水厥”“血痹”等范疇[12]，其核心病機(jī)為血虛寒凝，目前可見(jiàn)到臨床醫(yī)家使用當(dāng)歸四逆湯治療雷諾病的成功案例[13-15]，對(duì)于久病頑疾患者，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯亦有奇效[16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，該方能促進(jìn)外周血液循環(huán)，使末梢循環(huán)障礙改善，對(duì)慢性疼痛及疼痛伴有肢冷畏寒的多種寒性疼痛有鎮(zhèn)痛效果[17]。筆者通過(guò)文獻(xiàn)總結(jié)，預(yù)測(cè)本方治療雷諾病機(jī)制可能與抑制交感神經(jīng)興奮，改善微循環(huán)，增加血流量，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮舒縮功能，提高機(jī)體免疫，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子等途徑有關(guān)，其起效作用途徑有待進(jìn)一步探討。

在本研究中，筆者基于網(wǎng)絡(luò)分析、富集分析、分子對(duì)接和藥效團(tuán)模擬方法，對(duì)當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯進(jìn)行了系統(tǒng)藥理學(xué)研究。通過(guò)檢索在線中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取并篩選此方中的中藥、中藥化合物及靶點(diǎn)信息，通過(guò)富集分析揭示該方的系統(tǒng)藥理機(jī)制，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和分子對(duì)接，實(shí)現(xiàn)了有效活性成分的篩選和虛擬驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方可調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、酪氨酸代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、肌萎縮性側(cè)束硬化等，方中的(-)-Medicocarpin、Semilicoisoflavone B、Yinyanghuo D等成分，可以作為治療雷諾病的先導(dǎo)化合物進(jìn)行下一步研究。

1 資料與方法

1.1 中藥化合物成分收集與篩選從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(traditional Chinese medicine intergrated database，TCMID)檢索中藥化合物成分。檢索詞為：“當(dāng)歸”“桂枝”“白芍”“細(xì)辛”“通草”“甘草”“大棗”“吳茱萸”“生姜”。使用薛定諤軟件(Schr dinger，Maestro 11.9)的ADMET分析模塊，預(yù)測(cè)各化合物的類藥性等分子屬性，將其計(jì)算的口服吸收百分?jǐn)?shù)(percent human oral absorption，PHOA)及類藥性五原則(Rule of Five，ROF)指數(shù)作為潛在活性成分而篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)文獻(xiàn)研究[18]，篩選閾值為PHOA>80%，并滿足類藥性五原則。

1.2 化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)分析針對(duì)虛擬篩選后的中藥化合物，從TCMSP中獲取化合物的靶點(diǎn)信息。使用Cytoscape 3.6軟件，構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。使用Network Analysis模塊，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖分析。

1.3 通路富集與上游調(diào)控因子預(yù)測(cè)分析在“化合物-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，選擇Human注釋庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行過(guò)濾。使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//metascape.org/gp/index.html)對(duì)本方調(diào)控的靶點(diǎn)集合進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)通路分析及基因本體富集分析以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。使用ChEA3數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//maayanlab.cloud/chea3/)將處方的靶點(diǎn)進(jìn)行上游轉(zhuǎn)錄因子分析。

1.4 分子對(duì)接首先，從TCMSP及PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取化合物核心成分3D分子結(jié)構(gòu)；從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.pdbus.org/)獲取AGTR1結(jié)構(gòu)。其次，使用薛定諤軟件，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，生成多個(gè)化合物構(gòu)象。對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加工(去除水分子，添加氫原子)，使用Sitmap模塊探索并定義蛋白結(jié)構(gòu)中結(jié)合位點(diǎn)。隨后，使用LigandDock模塊，對(duì)化合物及蛋白進(jìn)行分子對(duì)接模擬，使用Docking score函數(shù)進(jìn)行對(duì)接結(jié)合能打分。一般分值越低則結(jié)合情況越好。同時(shí)，使用可視化分析模塊，觀察分子與AGTR1的結(jié)合姿態(tài)。

1.5 藥效團(tuán)模擬通過(guò)檢索文獻(xiàn)，收集目前治療雷諾氏病的一般藥物。從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)收集藥物的結(jié)構(gòu)。使用薛定諤軟件中的Phrase模塊，將這些藥物作為陽(yáng)性藥物組，設(shè)置藥效團(tuán)的數(shù)量為2～7。生成藥效團(tuán)假設(shè)模型。選擇假設(shè)的藥效團(tuán)模型，對(duì)經(jīng)過(guò)PHOA與ROF篩選的中藥化合物進(jìn)行藥效團(tuán)模型篩選。

2 結(jié)果

2.1 中藥化合物核心成分檢索到“當(dāng)歸”中化合物88個(gè)，“桂枝”中187個(gè)，“白芍”中41個(gè)，“細(xì)辛”中161個(gè)，“通草”中8個(gè)，“甘草”中165個(gè)，“大棗”中74個(gè)，“吳茱萸”中125個(gè)，“生姜”中199個(gè)，共收集1 024個(gè)化合物。去除中藥間的重復(fù)化合物后，共獲得751個(gè)化合物。隨后，基于PHOA與ROF值篩選，初步篩選得到696個(gè)化合物成分作為潛在活性成分。

2.2 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)696個(gè)化合物，使用TCMSP獲取“化合物-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)，共得到6 624對(duì)原始數(shù)據(jù)。通過(guò)靶點(diǎn)去重過(guò)濾，共獲得401個(gè)特異性靶點(diǎn)，形成“化合物-靶點(diǎn)”5 446調(diào)控對(duì)。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”藥理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

圖1 當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯的“化合物-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 富集通路對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析。統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中所包括的差異基因個(gè)數(shù)，并用超幾何分布算法計(jì)算每個(gè)GO條目中差異基因富集的顯著性。計(jì)算的結(jié)果會(huì)返回一個(gè)富集顯著性的P值，值越低說(shuō)明差異越顯著?？梢愿鶕?jù)GO分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義，挑選用于后續(xù)研究的基因。本次結(jié)果共計(jì)基因 401 個(gè)，其中有生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)注釋的基因共計(jì)217 個(gè)；細(xì)胞組分(cellular component，CC)注釋的基因共計(jì)221個(gè)；分子功能(molecular function，MF)注釋的基因共計(jì)224個(gè)。對(duì)GO富集分析結(jié)果中生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞組分，分子功能中的條目繪制條形圖，在同一張圖中展示GO三大類結(jié)果中最顯著的GO條目，見(jiàn)圖2。對(duì)GO富集分析結(jié)果中P值最小的30個(gè)條目繪制氣泡圖，展示GO富集分析結(jié)果中最顯著的條目，以及對(duì)應(yīng)的分類(BP，CC，MF；見(jiàn)圖3)。KEGG富集分析利用超幾何分布計(jì)算KEGG Pathway中每個(gè)通路與本次差異基因的關(guān)聯(lián)度，對(duì)差異基因KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示，見(jiàn)圖4。利用KEGG數(shù)據(jù)對(duì)差異基因進(jìn)行通路分析，并利用超幾何分布算法計(jì)算每個(gè)通路中差異基因富集的顯著性，P值越小，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的通路與本次差異基因的關(guān)聯(lián)程度越高。通過(guò)差異基因的通路分析，可以獲取差異基因顯著相關(guān)的通路，從而推斷實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件可能和哪些通路的改變有關(guān)。

注：圖中Y軸為-log10(pvalue)，條形圖高度越高，對(duì)應(yīng)的P值越小。不同的顏色分布對(duì)應(yīng)BP，CC，MF

注：圖中Y軸對(duì)應(yīng)GO的條目，X軸對(duì)應(yīng)EnrichmentScore，不同的形狀對(duì)應(yīng)不同的GO分類(BP，CC，MF)，點(diǎn)的大小對(duì)應(yīng)GO條目中差異基因的多少，氣泡顏色由紫-藍(lán)-綠-紅變化，其富集pValue值越小，顯著程度越大

注：圖中X軸表示富集度，Y軸表示富集的通路。圖中點(diǎn)越大表示落入該通路的基因越多，氣泡顏色由紫-藍(lán)-綠-紅變化，其富集pValue值越小，顯著程度越大

2.4 活性成分分子對(duì)接與藥效團(tuán)模擬驗(yàn)證由于目前治療雷諾病尚無(wú)特定的靶向藥物，因此我們使用藥效團(tuán)模擬方法，在整合了目前治療雷諾病的一般治療小分子藥物基礎(chǔ)上，構(gòu)建了陽(yáng)性藥物藥效團(tuán)模型，見(jiàn)表1。選擇第一個(gè)藥效團(tuán)模型AAH，對(duì)本方的化合物進(jìn)行篩選。隨后，結(jié)合有關(guān)雷諾病的機(jī)制文獻(xiàn)，確定以AGTR1靶點(diǎn)作為調(diào)節(jié)雷諾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，采用分子對(duì)接模擬，分析潛在調(diào)節(jié)AGTR1有效成分。結(jié)果表明，共94個(gè)活性成分分值低于-5，表明較好的結(jié)合活性，表2。觀察(-)-Medicocarpin與AGTR1結(jié)合模式，見(jiàn)圖5，(-)-Medicocarpi與AGTR1的氨基酸殘基ASP263和ASP281可以形成較好的鍵合力，且其對(duì)接得分為-8.691，表明(-)-Medicocarpin與AGTR1具有較好的結(jié)合活性。

表1 目前治療雷諾病的一般小分子藥物

注：A：(-)-Medicocarpin；B：Semilicoisoflavone B；C：Yinyanghuo D

表2 方劑中的潛在活性化合物

3 討論

雷諾病發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究認(rèn)為，交感神經(jīng)功能紊亂、炎癥介導(dǎo)的內(nèi)分泌因素等在其發(fā)病中起重要作用。中醫(yī)對(duì)雷諾病具有獨(dú)到見(jiàn)解，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病屬本虛標(biāo)實(shí)，以稟賦不足、飲食失調(diào)、情志不暢等為病因，氣血失榮失暢，寒邪痹阻經(jīng)絡(luò)，四肢失于溫養(yǎng)為核心病機(jī)，臨床常運(yùn)用當(dāng)歸四逆湯、黃芪桂枝五物湯、陽(yáng)和湯等進(jìn)行治療，取得一定的治療效果，值得進(jìn)一步研究[19]。

當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯出自《傷寒論》，全方由當(dāng)歸、芍藥、炙甘草、通草、桂枝、細(xì)辛、生姜、吳茱萸、大棗9味組成。方中當(dāng)歸甘溫，補(bǔ)血通脈；通草通利血脈；細(xì)辛溫化寒飲；吳茱萸溫中化飲；合生姜止嘔，具有溫陽(yáng)、養(yǎng)血、通絡(luò)的功效，用于治療太陽(yáng)太陰合病，寒飲內(nèi)停、頭痛、腹痛、寒疝等病[16]。臨床經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯可廣泛應(yīng)用于手足冷證、帕金森病、痛經(jīng)、老年類風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)伴骨質(zhì)疏松、寒冷性多形性紅斑、更年期障礙等許多疾病，亦有不少醫(yī)家運(yùn)用本方治療雷諾病[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸可促進(jìn)造血細(xì)胞的分化和增殖，對(duì)造血微環(huán)境形成刺激，促使其釋放造血生長(zhǎng)因子，并具有一定的抗炎作用[20]；吳茱萸具有抗炎、鎮(zhèn)痛、中樞保護(hù)、抗?jié)儭⒅雇轮篂a等藥理作用[21]；細(xì)辛具有良好的鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)的作用[22]。由于雷諾病發(fā)病與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能紊亂等因素密切相關(guān)，因此當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯治療雷諾病具有較為明確的理論基礎(chǔ)與臨床經(jīng)驗(yàn)，但其具體生物學(xué)機(jī)制尚未明確。

為了初探當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯治療雷諾病的潛在生物學(xué)機(jī)制，本研究對(duì)當(dāng)歸、芍藥、炙甘草、通草、桂枝、細(xì)辛、生姜、吳茱萸、大棗的活性成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。在所得到的696種活性成分中，分子對(duì)接模擬表明有94個(gè)化合物的分子對(duì)接得分較好，這些化合物或可通過(guò)調(diào)節(jié)AGTR1，進(jìn)而介導(dǎo)外周血管收縮，增加外周血管阻力，使心肌收縮力增強(qiáng)，心排血量增強(qiáng)，增強(qiáng)微循環(huán)以調(diào)節(jié)雷諾氏現(xiàn)象。其中，(-)-Medicocarpin、Semilicoisoflavone B及Yinyanghuo D等小分子化合物與AGTR1的對(duì)接得分表現(xiàn)出較好的結(jié)合活性。其中(-)-Medicocarpi與AGTR1的氨基酸殘基ASP263、ASP281可以形成較好的鍵合力，可為未來(lái)藥物研發(fā)提供研究支持。隨后進(jìn)一步使用藥效團(tuán)模型篩選方法觀察本方組分的潛在藥效團(tuán)位點(diǎn)，結(jié)果表明，(-)-Medicocarpin具有較好的陽(yáng)性藥相似藥效團(tuán)位點(diǎn)。

通過(guò)對(duì)當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯的GO分析，得到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能GO富集條目中結(jié)果最顯著的10條。由此可推測(cè)，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯對(duì)雷諾病的治療作用與吡哆醛磷酸結(jié)合、甘氨酸結(jié)合、氨基酸結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性等生物學(xué)過(guò)程及線粒體基質(zhì)、線粒體、外泌體、細(xì)胞連接等細(xì)胞組分相關(guān)，受預(yù)激抑制、乙醇應(yīng)激反應(yīng)、多巴胺代謝過(guò)程、谷胱甘肽代謝過(guò)程、抑制性突觸后電位等分子功能影響。研究結(jié)果與自主神經(jīng)功能紊亂、血管異常、血流動(dòng)力學(xué)改變等雷諾病常見(jiàn)發(fā)病機(jī)制一致[23]。

通過(guò)對(duì)當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯的KEGG通路富集分析，得到關(guān)聯(lián)度較高的信號(hào)通路條目30條，包括HIF-1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、酪氨酸代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、肌萎縮性側(cè)束硬化等。KEGG信號(hào)通路富集分析中，Count值較高的通路與氨基酸代謝、免疫反應(yīng)等相關(guān)，提示氨基酸代謝紊亂與神經(jīng)免疫反應(yīng)或是引發(fā)雷諾病的重要因素。

此外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CGRP 具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用，與G蛋白偶聯(lián)的CGRP受體結(jié)合，可激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷升高，進(jìn)而使血管平滑肌松弛，在雷諾病的發(fā)病過(guò)程中有著重要作用[24]。富集通路中的HIF-1信號(hào)通路，是對(duì)缺氧(低氧水平)應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)通路，缺氧與人類諸多重大疾病的病理生理都有關(guān)聯(lián)，包括心肌和腦缺血、癌癥、肺動(dòng)脈高壓、先天性心臟病和慢性阻塞性肺疾病等。有研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1作為一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由缺氧誘導(dǎo)因子-1α和缺氧誘導(dǎo)因子-1β兩個(gè)亞單位組成，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α可能為雷諾病抗缺血治療的新標(biāo)記物[25]。環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路與細(xì)胞外刺激如神經(jīng)遞質(zhì)、激素、炎癥刺激、應(yīng)激、腎上腺素、去甲腎上腺素等密切相關(guān)。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘闡述了當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯的活性化合物、調(diào)節(jié)靶點(diǎn)以及對(duì)雷諾病治療的多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的機(jī)制，初步推斷當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等血管擴(kuò)張而改善雷諾病。分子對(duì)接和藥效團(tuán)模擬結(jié)果顯示，甘草中的(-)-Medicocarpi、Yinyanghuo D與吳茱萸中的Goshuyuamide II等可以作為治療雷諾病的潛在有效成分，可進(jìn)一步進(jìn)行先導(dǎo)化合物的藥物研發(fā)。本研究聯(lián)合采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接與藥效團(tuán)模擬的方法，揭示了當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯調(diào)節(jié)雷諾病的系統(tǒng)藥理學(xué)機(jī)制，并有助于進(jìn)一步研發(fā)先導(dǎo)化合物。