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        油茶果自然霉變程度的可見/近紅外與中短波近紅外光譜檢測

        2023-03-06 12:49:30姜洪喆楊雪松李興鵬蔣雪松周宏平施明宏
        食品科學 2023年4期
        關鍵詞:中短波油茶波長

        姜洪喆,楊雪松,李興鵬,蔣雪松,周宏平,施明宏

        (南京林業(yè)大學機械電子工程學院,江蘇 南京 210037)

        油茶(Camellia oleiferaAbel.)是我國南方地區(qū)及少數(shù)東南亞國家特有的優(yōu)質木本油料作物[1]。油茶果內茶籽加工產(chǎn)品山茶油被譽為“東方橄欖油”,營養(yǎng)成分豐富、具有很好的養(yǎng)生保健功效[2]。油茶果成熟期一般在10月底11月初,此時南方產(chǎn)地多陰雨天,為完成油茶果堆漚后熟過程貯藏不當短時間內極易發(fā)生外部自然霉變,霉變油茶對山茶油出油率、酸價、油氣滋味等品質有很大影響[3]。

        油茶霉變主要由曲霉屬、青霉屬與鐮刀菌屬等霉變微生物引起[4],此類霉變微生物產(chǎn)出二級代謝產(chǎn)物,即真菌毒素,具有致癌、致畸和致基因突變的嚴重影響[5],其中黃曲霉毒素B1等已被世衛(wèi)組織列為一級致癌物,常出現(xiàn)在霉變糧油制品中[6]。霉變果與正常果混合脫蒲、加工會帶來山茶油品質下降、引入生物毒素等后果,因此在油茶籽榨油前對霉變油茶果“原材料”進行檢測剔除具有重要意義。

        常規(guī)的霉變農(nóng)產(chǎn)品檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法[7]、高效液相色譜法[8]、熒光染色法[9]、薄層色譜法[10]、高通量測序[11]等,此類方法操作繁瑣、樣品準備復雜且具有破壞性。近紅外光譜技術是一種快速、無損、成本低、操作簡便的現(xiàn)代光譜分析技術,近年已廣泛研究于各類農(nóng)產(chǎn)品品質安全檢測可行性,具有較強的在線檢測潛力[12-13]。目前,在油茶產(chǎn)業(yè)領域研究中,近紅外光譜已經(jīng)嘗試應用于茶油茶籽含油量[14-15]、產(chǎn)地鑒別[16]、脂肪酸含量[17]、摻假[18]等方面的檢測,但以上研究均以茶籽或茶油實驗室檢測為對象,對于直接產(chǎn)地采后的油茶果檢測分選并沒有實際意義。針對油茶果霉變的檢測剔除,確保后續(xù)處理步驟中規(guī)避生物毒素風險、提升產(chǎn)品品質安全、增加出口創(chuàng)匯,目前此方面相關研究鮮見報道。

        針對以上問題,為把好原材料關,本研究分別探索采用試可見/近紅外與中短波近紅外光譜結合化學計量學方法對不同霉變程度油茶果進行檢測判別,提取指示霉變的特征光譜信息,建立準確、魯棒的判別模型并對比結果,研究近紅外光譜檢測自然霉變油茶果的可行性,旨在為霉變油茶果剔除的產(chǎn)地處理需求提供一種快速、無損的檢測方案。

        1 材料與方法

        1.1 樣品及處理

        油茶果樣品采集自湖北省隨州市隨縣洪山鎮(zhèn)油茶園,采摘于2020年10月23日霜降節(jié)氣,采后即寄運至實驗室。油茶果等分為3 組,每組至少120 個樣品,為獲得實際貯藏環(huán)境真實自然霉變樣本,在果農(nóng)指導下模擬不同貯藏條件,分別在常溫常濕((25±2)℃、相對濕度(40±10)%)、常溫高濕度((25±2)℃、相對濕度(70±20)%)、通風、常溫高濕度((25±2)℃、相對濕度(70±20)%)不通風環(huán)境下貯藏2 周致其自然霉變[19-20],最終獲得輕度霉變、中度霉變和重度霉變3 組類別的外部霉變油茶果。輕度外部霉變表觀上不光滑顏色較鮮果略暗,中度外部霉變顏色較深、可聞到異味,重度外部霉變可以明顯觀測到生長的菌絲體、能聞到腐敗刺鼻氣味。

        1.2 近紅外光譜采集

        光譜采集均在室溫((25±2)℃)下進行,近紅外光譜采集使用儀器為Ocean Optics USB2000+(350~1000 nm)與Ocean Optics Flame-NIR(950~1650 nm)兩臺光譜儀,光譜儀應用前預熱30 min并進行黑白校正,應用OceanView軟件同時采集兩波段光譜,圖1為整套油茶果近紅外光譜采集系統(tǒng)示意圖,采用光纖漫反射模式進行光譜采集。本研究光譜儀配套光源使用海洋光學公司HL-2000鹵鎢燈光源,該光源適用于360~2000 nm,輸出功率為8.8 mW,色溫3000 K。光源應用SMA905光纖連接器與光纖進行連接,光纖采用海洋光學6繞1光纖束設計的FOP-UV型號光纖,入射光纖和接收光纖分布于同一探頭內,借助光纖探頭支架將光纖探頭與樣品表面充分貼合,經(jīng)參數(shù)優(yōu)化掃描次數(shù)設定為16 次,積分時間設定為100 ms。油茶果霉變不同于水果霉變從某一點展開,油茶果樣品表面各點霉變狀態(tài)基本一致,因此在油茶果赤道處采集3 測點光譜進行平均代表該樣品,減少采集光譜誤差,每測點間隔大致120°,確保采集到陽面、陰面以及接合面處。最終輕度、中度和重度霉變各采集180 個樣品光譜,其中每組隨機選取120 個樣品光譜進入建模訓練集(120×3=360),每組其余60 個放入預測集(60×3=180)。

        圖1 近紅外光譜采集系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of near-infrared spectral collection system

        1.3 光譜數(shù)據(jù)預處理

        主成分分析(principal component analysis,PCA)是挖掘光譜內部隱藏信息的有效方法,將存在線性相關的變量轉換為新的不相關變量,即PC,并基于累計的方差貢獻選取前幾個有效PC。PC得分圖可以用于反映不同樣本間的差異性和相似性,而PC載荷大小則可用來選取有效霉變程度判別波長。

        為消除近紅外光譜基線漂移、噪聲及散射效應等影響,應用標準正態(tài)變換(standard normal variate,SNV)、SNV結合去趨勢、一階導數(shù)和二階導數(shù)等預處理方法。其中,一階或二階導數(shù)預處理應用的是2 次5點Savitzky-Golay平滑求導。

        1.4 模型的建立與評價

        偏最小二乘判別分析(partial least squaresdiscriminant analysis,PLS-DA)是基于偏最小二乘回歸模型預測值對比閾值進行分類的判別分析方法[21],適用于變量較多且存在多重共線性的情況。為提高建立模型魯棒性和通用性,本研究中PLS-DA模型采用“留一法”百葉窗式交叉驗證確定最優(yōu)潛在變量(latent variable,LV)數(shù)量建立PLS-DA模型。

        對于定性模型建立后的評價,應用分類準確率,混淆矩陣的靈敏度、特異度以及Kappa系數(shù)進行模型評價。各參數(shù)越大說明模型分類效果越好,其中靈敏度和特異度分別代表真陽性率和真陰性率,Kappa系數(shù)用于評價分類結果一致性和可信度[22]。

        1.5 特征波長選取方法

        連續(xù)投影法(successive projections algorithm,SPA)的大體思路為在光譜矩陣中找尋含有最低限度的冗余信息的變量組,使得變量間的共線性達到最小,比較投影向量的大小,以投影向量最大的波長作為待選波長,然后基于模型選擇最終的特征波長[23]。一般SPA選取的波長數(shù)量不會太多,循環(huán)一次后進行多元線性回歸分析,得到預測的均方根誤差,最小的誤差值對應的波長即為所選。

        1.6 數(shù)據(jù)分析

        本研究中光譜數(shù)據(jù)分析以及繪圖主要應用了Matlab 2017b(The MathWorks Inc.,MA,USA)、Unscrambler X10.1(CAMO,Trondheim,Norway)以及OriginPro 2017(OriginLab Inc.,MA,USA)軟件。

        2 結果與分析

        2.1 不同霉變程度油茶果光譜特征

        不同霉變程度油茶果的400~1000 nm 和900~1700 nm兩波段漫反射光譜曲線以及各自對應光譜標準差如圖2所示。不管是400~1000 nm還是900~1700 nm區(qū)間范圍,不同霉變程度油茶果展現(xiàn)出類似的光譜輪廓,且光譜均隨著霉變程度加深可以發(fā)現(xiàn)反射強度逐漸降低。此種相似的輪廓主要是因為油茶果內共性的成分結構,而差異主要是霉變程度導致的內部有機物化學成分變化。最左側456 nm左右的反射谷與邵氏帶有關)[24],676 nm與植被固有的“紅邊”有關[25],948 nm和967 nm附近的波谷主要與水的O—H拉伸態(tài)的二階泛音有關[26],1215 nm與甲基(—CH3)的C—H鍵二階泛音有關[27],1488 nm則與水的O—H鍵拉伸態(tài)的一階泛音[26]。

        圖2 不同霉變程度油茶果帶標準差近紅外平均光譜圖Fig.2 Average infrared spectra with standard deviations of C.oleifera fruit with different mildew degrees

        通過對比發(fā)現(xiàn)不同霉變程度組光譜有一定的差別,這是可以進行判別的信息基礎。但還存在較多區(qū)域的模糊重疊,仍需后續(xù)從光譜數(shù)據(jù)角度結合化學計量學進行深度解析,作出準確判別。

        2.2 PC解釋性分析

        由于光譜變量的高維度性,不可避免存在冗余信息,本研究分別對可見/近紅外和中短波近紅外光譜進行全光譜PCA,對數(shù)據(jù)降維、觀測不同組間光譜異同。其中可見/近紅外光譜的PC1(96.13%)和PC2(3.38%)累計占有99.51%方差貢獻率,而中短波近紅外光譜PCA變換前兩個PC(PC1與PC2)分別占有98.20%、1.52%的方差貢獻率,前兩個PC合計占有99.72%方差貢獻率,這說明前兩個PC具有判別自然霉變程度的潛力。PC得分圖和載荷圖如圖3所示,在PC空間中可以初步看出不同自然霉變程度樣品具有一定聚類效果,圖3a、b中用橢圓標出3 組樣品聚類的大致覆蓋區(qū)域,PC得分圖顯示了不同霉變程度油茶果的可分性[28]。

        圖3 PC得分圖和載荷圖Fig.3 PC score plots and PC loading plots of PC1 versus PC2

        圖3c、d詳細的展示了前兩個PC的載荷曲線,其中背離水平線的峰和谷對判別自然霉變程度有效,針對可見/近紅外光譜選取4 個特征波長(461、650、674 nm和945 nm),中短波近紅外光譜選取5 個特征波長(973、1066、1146、1482 nm和1599 nm),這些波長也嘗試應用在后續(xù)簡化模型建立中。

        2.3 基于PLS-DA的全光譜判別模型

        針對原始以及4 種不同預處理后的全光譜,建立的最優(yōu)PLS-DA模型參數(shù)及判別結果如表1所示。整體上,兩個光譜集全光譜建立的PLS-DA模型性能差異不大。對于可見/近紅外光譜,SNV預處理全光譜預測集結果最優(yōu),分類準確率達85.0%。原始光譜建模預測集準確率達83.3%,而其他預處理如二階導數(shù)則降低了原始光譜建模性能。但原始全光譜建立的模型訓練集、交叉驗證集以及預測集3 者之間分類準確率差值最小,因此原始光譜建立模型最為魯棒。針對中短波近紅外光譜,原始光譜建立模型最優(yōu)LV為10,訓練集、交叉驗證集與預測集分類準確率分別達90.0%、86.7%和85.0%。結果發(fā)現(xiàn),無論400~1000 nm還是900~1700 nm,各種預處理方法并沒有對原始光譜起到明顯的模型改善作用,原始光譜具有足夠的有效信息,可以不需要對原始光譜數(shù)據(jù)進行額外的預處理[29],后續(xù)選取原始光譜建立的PLS-DA模型進行分析。

        表1 不同預處理方式全光譜PLS-DA模型性能比較Table 1 Performance comparison of full-spectral PLS-DA models with different spectral pre-processing methods

        2.4 波長篩選

        全光譜模型的使用會由于信息冗余帶來過擬合、噪聲等風險,導致模型較為復雜,不適合實際應用。從全光譜中進行有效波長的選取,找到攜帶重要信息的波長建立簡化模型將很有實際意義。圖4的SPA中,根據(jù)以往文獻設定所選變量最小數(shù)量設定為5,為了實際應用的需要最大數(shù)量設定為15[30]。對于兩組光譜集,分別在變量選取8 個和7 個時均方根誤差達到最小,最終分別選取了8 個和7 個波長,如圖4所示。綜合分析,不同方法選取的波長見表2。

        圖4 應用SPA方法選取波長Fig.4 Wavelength selection using SPA

        表2 根據(jù)不同方法選取波長匯總Table 2 Summary of wavelengths selected using different methods

        2.5 簡化模型

        表3中列出了不同波長選擇方法選取的特征波長建立簡化PLS-DA模型性能對比,在400~1000 nm波段,PC-PLS-DA模型表現(xiàn)略差,訓練集、交叉驗證集以及預測集3 者判別準確率均沒有超過80%。SPA-PLS-DA模型獲得了最好的分類準確率,預測集達到了84.4%。對于900~1700 nm波段,同樣是SPA-PLS-DA模型表現(xiàn)最好,在訓練集、交叉驗證集和預測集分別獲得84.7%、84.2%和84.4%的分類準確率。因此SPA選擇的波長可以兼顧降低變量個數(shù)以及保持模型性能,波長數(shù)分別由1506 個和128 個下降到8 個和7 個,而PC選取的波長有效性不足的原因可能是二者選取波長過程僅針對光譜變量(X變量)沒有考慮霉變組別(Y變量),選取的有效波長較少,難以覆蓋識別中的所有有效信息[31]。

        表3 不同波長選擇方法選擇變量建模結果對比Table 3 Comparison of modeling results using different wavelength selection methods

        為進一步直觀解析最優(yōu)的簡化SPA-PLS-DA模型,表4中列出了預測集混淆矩陣以及靈敏度、特異度、Kappa系數(shù)計算結果。兩組簡化模型的Kappa系數(shù)均為0.7667,說明在一致性分類精度上兩簡化模型能力相似。兩模型可以較為準確地判別出輕度霉變和重度霉變果,可見/近紅外光譜均判別正確60中的57 個(靈敏度≥0.95),中短波近紅外光譜此兩組靈敏度≥0.88,特異性兩模型均超過0.84。但兩組簡化模型對中度霉變油茶果判別準確率均不足,主要原因是該組樣品既有可能誤判為輕度霉變和重度霉變,而此方面中短波近紅外光譜模型(靈敏度0.72)優(yōu)于可見/近紅外光譜(靈敏度0.63)。

        表4 最優(yōu)簡化模型預測集混淆矩陣Table 4 Confusion matrices for prediction set using optimal simplified models

        3 討論與結論

        采集540 個不同自然霉變程度油茶果近紅外光譜,包括可見/近紅外以及中短波近紅外兩個波段分別進行判別可行性分析。獲取的光譜PCA發(fā)現(xiàn)前兩個PC得分圖上具有一定的聚類效果,說明光譜具有判別不同霉變程度油茶果的能力。建模中發(fā)現(xiàn)采用SNV、SNV+去趨勢、一階導數(shù)、二階導數(shù)等預處理后全光譜建立的PLS-DA模型效果不如原始光譜,說明原始全光譜具有足夠的有效信息,不需要再進行額外的預處理。另外兩個光譜集建模能力相當,最優(yōu)全光譜模型的預測集判別準確率均在82%以上。為了進一步適用于實際,應用PC載荷和SPA選取特征波長,建立的簡化模型結果顯示無論400~1000 nm還是900~1700 nm波段均為SPA-PLS-DA模型性能最佳,預測集判別準確率相比于全光譜沒有顯著下降(84.4%),說明SPA選取的特征波長因考慮了目標組別信息在判別霉變程度中更為有效。

        結合混淆矩陣對最優(yōu)簡化模型進行深入分析,兩模型Kappa系數(shù)均為0.7667,靈敏度和特異度相差無幾,900~1700 nm對中度霉變樣品分辨力更強,但是從儀器制造成本上400~1000 nm更便宜更實用。綜合分析,本研究表明近紅外光譜為油茶果產(chǎn)地處理提供了一種快速、原位、無損的現(xiàn)場檢測方法,克服了以往常規(guī)化學測定方法費時費力、試劑污染以及儀器昂貴等缺點,也為木本糧油林果霉變的快速無損檢測提供了有效借鑒。未來為了提高簡化模型的實際應用性和魯棒性,還需要加大近紅外光譜采集樣品量不斷進行模型的修正。

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