戰(zhàn) 楠，孫 青，郝瑞霞，郭 峰,*

（1.國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，自然資源部生態(tài)地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；2.北京大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院，北京 100871）

有機(jī)酸廣泛分布于植物的根、莖、葉、果實(shí)等部位，對(duì)于維持植物自身的新陳代謝具有重要作用：植物根系通過(guò)分泌有機(jī)酸影響周?chē)寥篮偷V物中元素的釋放，改善根系環(huán)境，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力；植物莖和葉通過(guò)分泌有機(jī)酸參與植物光合作用、呼吸作用等過(guò)程，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；植物果實(shí)中積累的有機(jī)酸不僅與其風(fēng)味、色澤密切相關(guān)，同時(shí)也是判斷果實(shí)成熟度的重要指標(biāo)[1-3]。植物中的一些天然有機(jī)酸具有疾病預(yù)防和維護(hù)人體健康的功效。例如，檸檬酸和蘋(píng)果酸能促進(jìn)體內(nèi)三羧酸循環(huán)，幫助營(yíng)養(yǎng)元素吸收、提升人體新陳代謝速度[2-3]；沒(méi)食子酸具有抑菌、抗炎、抗氧化等生理學(xué)活性，可幫助調(diào)節(jié)腸道菌群組成[4]；琥珀酸具有抑菌、鎮(zhèn)靜、止血的功效，可增強(qiáng)人體免疫力[5]。

目前，有機(jī)酸的分析方法主要包括氣相色譜（gas chromatography，GC）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[6-8]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[9-11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）法[12-19]。GC主要用于測(cè)定低分子質(zhì)量、易揮發(fā)的有機(jī)酸，對(duì)于沸點(diǎn)較高的有機(jī)酸通常需要衍生化處理，但衍生化過(guò)程會(huì)增加操作難度和前處理時(shí)間，并且可能導(dǎo)致誤差加劇，從而限制了GC和GC-MS法的應(yīng)用[6-8]。IC[9-11]和HPLC[12,14-16]是有機(jī)酸分析最常用的方法，但非特異性檢測(cè)器易受到樣品基質(zhì)的干擾，因此對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，往往需要采用相對(duì)復(fù)雜的前處理去除干擾，以保證分析的靈敏度和準(zhǔn)確度。質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)HPLC定性能力不足的缺點(diǎn)，HPLC-MS也因此成為目前公認(rèn)的有機(jī)酸高效檢測(cè)方法[13,17-19]，并被2021年最新發(fā)布的有機(jī)酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所選用[19]。近年來(lái)，高分辨質(zhì)譜以其精準(zhǔn)識(shí)別、精確定量的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在食品分析領(lǐng)域受到了越來(lái)越多的關(guān)注。Scordo等[20]利用液相色譜-四極桿-離子阱高分辨質(zhì)譜建立了測(cè)定草莓和橄欖中全氟烷基酸的分析方法，為有機(jī)酸的分析提供新思路。

大多數(shù)低分子質(zhì)量的天然有機(jī)酸易溶于水，因此通常采用水、甲醇、乙醇等溶劑或混合溶劑提取植物中的有機(jī)酸[2,10,12,19-22]。如今，除了常規(guī)的蒸餾法[2-3]、超聲提取法[3]、液液萃取法[3,14]、固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）法[3,7,23]外，一些新型前處理技術(shù)如固相微萃取[8]、基質(zhì)固相分散萃取[24]、QuEChERS法[20]也開(kāi)始應(yīng)用于有機(jī)酸的提取。在線固相微萃取是一種可與儀器連接的在線全自動(dòng)前處理技術(shù)，它與HPLC-MS聯(lián)用時(shí)，可通過(guò)柱切換實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)富集、純化、洗脫和分離分析，簡(jiǎn)化前處理程序，提高分析效率[25-26]。迄今，在線SPE與HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)已成功地應(yīng)用于食品和環(huán)境領(lǐng)域有機(jī)污染物的分析[26-29]，但相關(guān)技術(shù)對(duì)于有機(jī)酸的分析鮮有報(bào)道。

本研究采用在線SPE技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high resolution mass spectrometry，HPLC-Q-Orbitrap-HRMS）技術(shù)，建立一種快速測(cè)定植物中11 種水溶性有機(jī)酸的新方法。方法簡(jiǎn)單、快速、精準(zhǔn)、可靠、自動(dòng)化程度高，適用于植物中有機(jī)酸類(lèi)化合物的批量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merk公司；甲酸（LC-MS級(jí)），有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：L-乳酸、香豆酸、沒(méi)食子酸、檸檬酸、香草酸、阿魏酸、新綠原酸（純度均大于98%） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸銨（分析純） 美國(guó)Fisher Chemical公司；富馬酸、琥珀酸、L-蘋(píng)果酸、DL-酒石酸（純度均大于98%）德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；內(nèi)標(biāo)：檸檬酸2,2,4,4-D4（＞99%） 加拿大CDN公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-Q-Orbitrap-HRMS聯(lián)用儀Q Extractive（配備DGP-3600RS雙梯度快速分離泵、自動(dòng)在線SPE系統(tǒng)及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo Fisher公司；A11-研磨機(jī) 德國(guó)IKA公司；THC-超聲波提取器 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；3-15型高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；Premier BEH C18AX色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Oasis MAX在線SPE柱（20 mm×2.1 mm，30 μm） 美國(guó)Waters公司；0.22 μm親水性尼龍濾膜 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 mg內(nèi)標(biāo)物，用甲醇定容至10 mL，配制成1000 mg/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃密封貯存。使用前，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配成10.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱(chēng)取11 種有機(jī)酸單一標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，用甲醇-水（1∶1，V/V）定容至10 mL，配制成1000 mg/L有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃密封儲(chǔ)存。

空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇-水（1∶1，V/V）將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)溶液，使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：小白菜和芡實(shí)樣品溶液，稀釋100 倍后，配制質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)溶液，使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。

1.3.2 樣品前處理

以白蘿卜、胡蘿卜、土豆、小白菜、香蕉、蘋(píng)果、葡萄、芡實(shí)作為植物根、莖、葉、果實(shí)、種子的代表性樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。前7 種樣品采購(gòu)自北京某超市，新鮮芡實(shí)采摘自蘇州芡實(shí)種植基地。

取適量樣品洗凈、去核、切塊，放入研磨機(jī)中制成勻漿。稱(chēng)取2.00 g勻漿液于離心管，加入18 mL甲醇-水（1∶1，V/V），渦旋振蕩后，超聲提取15 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.22 μm親水濾膜，濾液用超純水稀釋數(shù)倍后，加入內(nèi)標(biāo)溶液，待上機(jī)分析。

1.3.3 儀器分析條件

在線SPE與HPLC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)示意圖如圖1所示。

圖1 在線SPE-HPLC-MS/MS質(zhì)譜分析系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of online SPE-HPLC-Q-Orbitrap-HRMS system

1.3.4 在線SPE條件

通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)在線SPE，左泵為樣品富集泵，右泵為分析泵。具體參數(shù)見(jiàn)表1。預(yù)處理的樣品在左泵流動(dòng)相的帶動(dòng)下，經(jīng)Oasis MAXSPE柱在線富集，以0.50 mL/min流速等梯度洗脫，清洗2.0 min后，六通閥與分析柱連通，右泵流動(dòng)相將目標(biāo)組分及內(nèi)標(biāo)物洗脫至BEH C18AX分析柱，洗脫4.5 min后，六通閥自動(dòng)切換回初始位置，左泵進(jìn)行在線SPE柱再生。與此同時(shí)，右泵流路進(jìn)行目標(biāo)組分的分離和質(zhì)譜檢測(cè)。

表1 在線SPE及HPLC條件參數(shù)Table 1 Mobile phase parameters for online SPE and HPLC

1.3.5 色譜條件

Premier BEH C18AX色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1.0 mL，流速0.25 mL/min；流動(dòng)相A：含10 mmol/L甲酸銨的0.9%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.9%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；Full MS/dd-MS2負(fù)離子模式掃描；探針溫度450 ℃；離子傳輸管溫度300 ℃；噴霧電壓2.8 kV；S-Lens電壓60 V；鞘氣流速48 arb；輔助氣流速12 arb；吹掃氣流速2 arb；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；一級(jí)全掃描分辨率為70000 FWHM，二級(jí)子離子掃描分辨率為17500 FWHM；歸一化碰撞能30 eV。11 種水溶性有機(jī)酸的化學(xué)性質(zhì)及質(zhì)譜離子信息見(jiàn)表2。

表2 11 種水溶性有機(jī)酸的化學(xué)性質(zhì)及質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Chemical properties and mass spectrometric parameters of 11 water-soluble organic acids

1.3.7 基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算

在線SPE不僅可以富集目標(biāo)組分，還可以在一定程度上對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化，降低基質(zhì)干擾[26]。為了評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析過(guò)程的影響，采用下式計(jì)算[20]：

式中：S1為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；S2為空白標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

反相C18色譜柱具有高穩(wěn)定性、疏水選擇性以及較好的分離能力，是目前有機(jī)酸分析常用的色譜柱[2,3,14,20]，也是GB 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》推薦使用的色譜柱[21]。但采用在線SPE上樣時(shí)，洗脫液直接注入分析柱，進(jìn)樣體積遠(yuǎn)大于常規(guī)HPLC的進(jìn)樣量（1～10 μL），因此色譜柱需要更耐酸、耐水，于是本研究選用一種性能更好的新型反相色譜柱（BEH C18AX），其固定相混合填料經(jīng)過(guò)末端封閉比C18色譜柱更穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，BEH C18AX色譜柱在低pH值條件下，可以實(shí)現(xiàn)11 種有機(jī)酸的良好分離，且柱流失較低，故選其作為分析柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

11 種目標(biāo)有機(jī)酸均屬于弱酸（表2），其在水中存在離解平衡，但離子態(tài)的有機(jī)酸在色譜柱上保留較弱，因此常在流動(dòng)相中加入酸性添加劑，降低流動(dòng)相pH值促進(jìn)有機(jī)酸向分子形式轉(zhuǎn)換，增加其在色譜柱上的保留[2,12,14]。實(shí)驗(yàn)考察水-乙腈體系中，甲酸添加量（0.1%、0.5%、0.9%）對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著甲酸添加量的增加，11 種有機(jī)酸的響應(yīng)更強(qiáng)，峰形更尖銳，但考慮到儀器管路和色譜柱的酸堿耐受區(qū)間為pH 2～10，0.90%甲酸溶液pH值已達(dá)到2.2，故不再進(jìn)一步增加甲酸的量，初步確定流動(dòng)相中甲酸添加量為0.9%。為進(jìn)一步提高有機(jī)酸離子化效率、促進(jìn)脫氫準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-的形成、減少色譜峰拖尾，嘗試在流動(dòng)相中加入適量甲酸銨，增加目標(biāo)組分的響應(yīng)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明，在0.9%甲酸溶液中，隨著甲酸銨添加量（5、10、20 mmol/L）的增大，11 種有機(jī)酸的峰形逐漸尖銳，但[M-H]-的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸降低。綜合考慮，確定甲酸銨的添加量為10 mmol/L，故流動(dòng)相A的組成為含10 mmol/L甲酸銨的0.9%甲酸溶液。

2.1.3 柱溫的選擇

柱溫升高可以降低流動(dòng)相黏度、提高傳質(zhì)效率、增加分離度，同時(shí)縮短分析時(shí)間；但柱溫過(guò)高不利于組分的分離，且會(huì)影響色譜柱的使用壽命。實(shí)驗(yàn)考察柱溫在25～45 ℃下，11 種有機(jī)酸的分離效果及儀器壓力情況。結(jié)果表明，隨著色譜柱溫升高，HPLC系統(tǒng)壓力降低，目標(biāo)組分出峰更快，但分離度降低。當(dāng)柱溫大于40 ℃時(shí)，琥珀酸、檸檬酸和沒(méi)食子酸的色譜峰部分重疊；當(dāng)柱溫降至35 ℃時(shí)，三者可基本分離；而當(dāng)柱溫小于30 ℃時(shí)，三者的分離度大于1.5。但考慮到分離度也可由流速調(diào)節(jié)，而液相系統(tǒng)的壓力則主要由溫度控制，為了避免HPLC系統(tǒng)運(yùn)行壓力超過(guò)Oasis MAX柱壓上限（413 bar/6000 psi），最終選取柱溫為35 ℃。

2.1.4 流速的選擇

考察流動(dòng)相流速在0.15～0.30 mL/min下，11 種有機(jī)酸的分離效果及保留時(shí)間。結(jié)果表明，當(dāng)流速小于0.20 mL/min時(shí)，有機(jī)酸的峰寬較大，且出峰時(shí)間靠后，分析時(shí)間延長(zhǎng)；提高流速至0.25 mL/min時(shí)，能獲得較好的峰形和靈敏度，且分析時(shí)間也相應(yīng)縮短；當(dāng)流速提高至0.30 mL/min時(shí)，各組分的分離度下降，且液相系統(tǒng)壓力在運(yùn)行過(guò)程中超過(guò)了Oasis MAX柱壓上限（413 bar），故確定流速為0.25 mL/min。

另外，對(duì)梯度洗脫程序也進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)不斷調(diào)整，最終確定的洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 提取條件的優(yōu)化

選取11 種有機(jī)酸均易溶于水（表2），故采用超聲法提取植物樣品中的有機(jī)酸，而不必采用加熱回流的方式進(jìn)行提取，以此簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，縮短分析時(shí)間。實(shí)驗(yàn)比較了純水、50%甲醇溶液、甲醇3 種溶劑體系對(duì)11 種有機(jī)酸提取效率的影響（圖2）。結(jié)果表明，11 種有機(jī)酸在50%甲醇溶液中的回收率最佳（85.2%～99.2%），比在純水中回收率（75.4%～95.7%）和甲醇中回收率（80.8%～96.5%）更好，故選擇50%甲醇溶液作為提取液。

圖2 提取溶劑對(duì)植物中11 種有機(jī)酸回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries of 11 organic acids

2.3 在線SPE條件的優(yōu)化

目前，商品化的在線SPE柱類(lèi)型較少、尺寸單一，且缺乏相關(guān)的參考文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)比較了2 種適合分析酸性化合物的在線SPE柱：Thermo Retain AX（2.1 mm×20 mm，60 μm）和Waters Oasis MAX（2.1 mm×20 mm，30 μm）。結(jié)果表明，2 種在線SPE柱對(duì)11 種有機(jī)酸的保留能力相似，但Oasis MAX得到的色譜峰形更窄、響應(yīng)強(qiáng)度更高，故選擇Oasis MAX作為在線SPE柱。

在線SPE過(guò)程的洗脫流速、洗脫時(shí)間直接影響目標(biāo)組分的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)考察洗脫流速?gòu)?.20～1.00 mL/min對(duì)11 種有機(jī)酸的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以0.9%甲酸為清洗流動(dòng)相，流速為0.50 mL/min時(shí)，11 種有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度最高，色譜峰形良好，當(dāng)流速進(jìn)一步增大時(shí)，蘋(píng)果酸和酒石酸會(huì)從在線SPE柱上過(guò)早洗脫，造成目標(biāo)物的損失，并且其余色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度降低、峰形變差，故確定洗脫流速為0.50 mL/min。

實(shí)驗(yàn)考察洗脫時(shí)間（1.0～4.0 min）對(duì)洗脫效果的影響。結(jié)果表明，隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)組分的出峰面積逐漸增大，當(dāng)洗脫時(shí)間不小于2 min時(shí)，峰面積變化趨于穩(wěn)定，說(shuō)明11 種有機(jī)酸的洗脫已基本充分。并且，植物樣品中的一些極性雜質(zhì)可在前2.0 min內(nèi)基本去除，故選擇在線SPE柱與分析柱串聯(lián)的閥切換時(shí)間點(diǎn)為2.0 min。

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，11 種有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)物的色譜圖如圖3所示，各組分的分離度和響應(yīng)強(qiáng)度均較好。

圖3 優(yōu)化條件下的11 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)物的HPLC-MS色譜圖Fig.3 HPLC-MS chromatograms of 11 organic acids and internal standard under the optimized conditions

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍和檢出限結(jié)果

將7 個(gè)系列質(zhì)量濃度梯度的11 種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液由低到高依次進(jìn)樣分析。以被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)（y），以被測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)? 倍和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各組分的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。結(jié)果表明（表3），11 種有機(jī)酸在1～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。11 種有機(jī)酸的LOD為0.1～3.2 μg/kg，LOQ為0.3～9.6 μg/kg，遠(yuǎn)低于現(xiàn)行GB/T 40179—2021《植物中有機(jī)酸的測(cè)定》[19]中LOQ（0.82～3.25 mg/kg），可以滿足實(shí)際樣品分析的需要。

表3 11 種有機(jī)酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQTable 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs,and LOQs for 11 organic acids

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果

在已知有機(jī)酸含量的新鮮芡實(shí)、小白菜樣品中，添加2 個(gè)不同質(zhì)量濃度水平的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。每個(gè)添加水平進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果取平均值。從表4可知，小白菜中11 種有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率在94.2%～110%之間，RSD范圍為0.8%～5.6%；芡實(shí)中11 種有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率在92.2%～111%之間，RSD范圍為1.4%～4.9%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表4 小白菜和芡實(shí)中11 種有機(jī)酸的回收率、日內(nèi)精密度和基質(zhì)效應(yīng)（n=5）Table 4 Recoveries,intraday RSDs and matrix effects of 11 organic acids in spiked pakchoi and E.ferox seeds (n=5)

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)

在質(zhì)譜離子化時(shí)，雜質(zhì)組分（如糖類(lèi)、酚類(lèi)、水溶性色素）會(huì)與目標(biāo)組分發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，使目標(biāo)組分的離子化效率增加或降低，影響方法的LOD、LOQ、準(zhǔn)確度和精密度[2,3,20]。為了降低基質(zhì)干擾，通常采用稀釋樣品、SPE凈化、使用同位素內(nèi)標(biāo)或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線降低其影響[2,3,13,23]。

本實(shí)驗(yàn)采用空白標(biāo)準(zhǔn)曲線法（純?nèi)軇┖突|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)法（樣品溶液）考察小白菜和芡實(shí)樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。分別配制空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照計(jì)算公式得出各組分的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)[20]，結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)表明，小白菜樣品的基質(zhì)效應(yīng)在-13.6%～25.3%之間，7 種有機(jī)酸（富馬酸、蘋(píng)果酸、阿魏酸、香豆酸、檸檬酸、香草酸和新綠原酸）呈現(xiàn)基質(zhì)抑制，4 種有機(jī)酸（乳酸、琥珀酸、酒石酸和沒(méi)食子酸）呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)；芡實(shí)樣品的基質(zhì)效應(yīng)在-18.0%～15.6%之間，除乳酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)外，其余8 種有機(jī)酸均呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)。整體而言，只有小白菜樣品中沒(méi)食子酸呈現(xiàn)出中等強(qiáng)度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（25.3%），其余10 種有機(jī)酸的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值均小于20%，說(shuō)明小白菜和芡實(shí)的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析無(wú)顯著干擾。但對(duì)于基質(zhì)十分復(fù)雜的樣品，建議采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，以確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用本方法，對(duì)市售的白蘿卜、胡蘿卜、土豆、小白菜、香蕉、鴨梨、葡萄、芡實(shí)8 種不同類(lèi)型的植物樣品進(jìn)行分析，每種樣品測(cè)5 組，每一樣品平行測(cè)定3 次，結(jié)果取其平均值（表5）。結(jié)果表明，11 種有機(jī)酸（圖4）在8 種植物樣品中均有不同程度的檢出，但有機(jī)酸的種類(lèi)和含量在不同植物間的差異較大。蘋(píng)果酸和檸檬酸是所有樣品中含量最高的2 種酸，酒石酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸含量次之，而香豆酸、阿魏酸、香草酸和新綠原酸則含量較低或未檢出，檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的濃度水平在同一數(shù)量級(jí)[2,22,30]。對(duì)于芡實(shí)樣品，采用GB 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[21]進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，但本方法自動(dòng)化程度更高、用時(shí)更短、檢測(cè)效率更高。

表5 8 種植物樣品中11 種有機(jī)酸的含量Table 5 Contents of 11 organic acids in eight plant samples mg/kg

圖4 土豆（實(shí)線）和鴨梨（虛線）樣品中11 種有機(jī)酸的HPLC-MS色譜圖Fig.4 HPLC-MS chromatograms of 11 organic acids in potato (solid line) and pear (dashed line) samples

3 結(jié)論

采用在線SPE結(jié)合HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術(shù)，建立一種快速測(cè)定植物中11 種水溶性有機(jī)酸的新方法。與已有方法相比，本方法引入了在線SPE技術(shù)，使樣品富集、凈化高度自動(dòng)化，簡(jiǎn)化了操作，縮短了分析時(shí)間，并避免了離線操作的人為誤差和樣品損失，提高了方法的準(zhǔn)確度和分析效率，符合當(dāng)今分析方法逐漸自動(dòng)化的趨勢(shì)。此外，在線SPE柱可重復(fù)使用幾十次，重復(fù)性和靈敏度依然良好，檢測(cè)成本比普通SPE柱更低，十分適合批量樣品的分析。方法LOD為0.1～3.2 μg/kg，定量限為0.3～9.6 μg/kg，滿足現(xiàn)有國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10,19,21]中有機(jī)酸的分析要求。方法已應(yīng)用于8 種不同類(lèi)型植物中有機(jī)酸的測(cè)定，在此基礎(chǔ)上，可推廣至更多植物中有機(jī)酸的分析，并為其他水溶性化合物的快速、精準(zhǔn)分析提供方法參考。