溫青玉，張 雨，李天齊，張康逸,*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南省全谷物小麥制品加工國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南省全谷物鮮食加工工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省安康食品科技研究院，河南 鄭州 450047；3.河南省安康未來食品科技有限公司，河南 鄭州 450066）

咸味是食品的5 種基本口味之一[1]。食鹽作為目前最基礎(chǔ)、應(yīng)用最廣泛的咸味劑，可以維持機(jī)體正常生理功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓[2]。但過多攝入會(huì)對(duì)心、腦、腎等器官產(chǎn)生損害，增加高血壓的發(fā)病率[3-4]和抑郁癥的患病風(fēng)險(xiǎn)[5]。世界衛(wèi)生組織建議成人鹽攝入量不超過6 g/d，而調(diào)查顯示我國(guó)居民實(shí)際鹽攝入量在12 g/d左右[6]。目前，食鹽替代物主要有咸味肽、咸味增強(qiáng)肽、風(fēng)味改良劑等[7]。其中，咸味肽作為一種可呈現(xiàn)咸味的多肽，是一種較為理想的食鹽替代物[8]，其來源于天然動(dòng)植物，開發(fā)與應(yīng)用前景廣闊，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

近年來，通過生物酶法制備呈味肽或生物活性肽成為大宗低值蛋白深加工的研究熱點(diǎn)[9]，咸味肽的開發(fā)逐漸被研究者重視起來。吳迪等[10]通過響應(yīng)面分析優(yōu)化酶水解小黃魚（Larimichthys polyactis）蛋白制備咸味肽。楊文君等[11]通過風(fēng)味蛋白酶深度酶解豌豆蛋白制備咸味肽，其中小分子肽（＜1 kDa）占比65.60%，為植物蛋白酶解制備咸味肽提供了理論依據(jù)。然而，酶解物一般為蛋白質(zhì)、肽和氨基酸的混合物，其中咸味肽占比低，咸味不突出，高純度的咸味肽需要經(jīng)過分離純化獲得。目前，肽的分離純化主要有膜分離技術(shù)、色譜技術(shù)、電泳技術(shù)等。其中，膜分離技術(shù)以及色譜技術(shù)具有分離效率高、產(chǎn)物純度高、分離速度快等特點(diǎn)，是制備純化天然產(chǎn)物的極好手段[12-15]。李迎楠等[16]將牛骨粉碎酶解，通過超濾膜過濾，使用SephadexG-25凝膠色譜和制備型高效液相色譜儀對(duì)酶解液逐級(jí)純化，最終得到分子質(zhì)量小于1000 Da的短肽咸味肽。吳陽[17]通過分離純化技術(shù)從雙孢菇中分離出濃厚感風(fēng)味物質(zhì)，并利用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定得到序列Gly-His-Gly-Asp。彭增起等[18]從大豆蛋白中分離純化得到高純度咸味肽，并通過蛋白質(zhì)測(cè)序儀得到咸味肽氨基酸序列為Gly-Lys。面筋蛋白中谷氨酸和脯氨酸含量尤為豐富，一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含呈味肽序列，是制備呈味肽和咸味香精的良好原料[19]，但小麥中的咸味肽序列還未見報(bào)道。

本研究利用食品級(jí)蛋白酶復(fù)合對(duì)面筋蛋白粉進(jìn)行酶解，通過逐級(jí)純化酶解液對(duì)小麥中的咸味肽進(jìn)行分離，選用超濾膜過濾、Sephadex G-15凝膠色譜對(duì)凍干后咸味組分進(jìn)行純化并收集，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對(duì)純化后的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析，旨在為咸味肽的開發(fā)利用提供一定技術(shù)支持，有利于咸味肽在食品加工中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白 河南省封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；混合酶（46000 U/mL風(fēng)味蛋白酶∶28000 U/g堿性蛋白酶∶44000 U/g復(fù)合蛋白酶＝0.45∶0.36∶0.19）諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉（食品級(jí)）天津市津華化工廠；鹽酸（食品級(jí)） 河南省開封市旭信化工有限公司；食鹽 河北綠?？敌哦嗥贩N食鹽有限公司；甲醛、甲醇、乙腈（均為色譜純） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；大孔樹脂DA201-C 天津市海光化工有限公司；平膜UE001、UE003、UE005 中科瑞陽膜技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP-N型電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司；DSHZ-300型多用途恒溫水浴振蕩器 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；JW1042低速離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀 山東省濟(jì)南海能儀器有限公司；SXJD-V6-10箱式電阻爐馬弗爐 江蘇省蘇州江東精密儀器有限公司；101-3EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FD-100S真空冷凍干燥機(jī) 北京惠城佳儀科技有限公司；SA402B型電子舌 日本INSENT公司；1260（四元泵）高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；MSM2011實(shí)驗(yàn)用膜分離裝置 上海摩速科學(xué)器材有限公司；玻璃層析柱（2.6 cm×60 cm） 上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Easy-nLC 1200高效液相色譜儀、Q ExactiveTMHybrid Quadrupole-Orbitrap? MS儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 面筋蛋白咸味酶解液的制備

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]，在最優(yōu)條件下制備面筋蛋白咸味酶解液。配制5 g/100 mL小麥蛋白懸濁液，按照3800 U/g酶活力加入混合酶，在pH 7.5、55 ℃條件下酶解6 h。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴15 min滅酶，4000 r/min離心25 min，獲得上清液為咸味酶解液。

1.3.2 咸味酶解液脫鹽

采用大孔樹脂DA201-C對(duì)面筋蛋白咸味酶解液進(jìn)行脫鹽處理。用無水乙醇將大孔樹脂DA201-C浸泡24 h，使樹脂充分溶脹，用去離子水洗至上清液在220 nm波長(zhǎng)處無吸收峰且無乙醇?xì)馕?，抽濾備用[21]。將處理過的DA201-C大孔樹脂裝入250 mL錐形瓶中，加入面筋蛋白咸味酶解液進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸，脫鹽條件為：上樣pH 5.0，酶解物質(zhì)量濃度為30 mg/mL，解吸劑為75%乙醇溶液，收集樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后凍干備用。根據(jù)凱氏定氮法、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》[22]和GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[23]測(cè)定脫鹽前后蛋白含量、水分和灰分變化。

1.3.3 超濾分離

采用膜分離裝置對(duì)脫鹽后小麥面筋蛋白咸味粗肽進(jìn)行不同分子質(zhì)量截留。將小麥面筋蛋白咸味粗肽用去離子水溶解，然后在溫度25 ℃、壓力2.5 MPa、轉(zhuǎn)速400 r/min條件下依次通過濾膜UE005（5 kDa）、UE003（3 kDa）、UE001（1 kDa），分別收集4 部分（＞5 kDa；3～5 kDa；1～3 kDa；＜1 kDa）并命名為F1、F2、F3、F4，濃縮干燥成粉末后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.4 凝膠過濾色譜分離

將超濾后咸度較高的組分用去離子水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL，經(jīng)0.45 μm水相過濾后，用凝膠層析柱再次進(jìn)行分離純化。預(yù)處理的Sephadex G-15裝滿2.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，以去離子水作為洗脫液，上樣量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)儀波長(zhǎng)為220 nm。通過譜圖分別收集各個(gè)洗脫峰，命名為P1、P2、P3、P4、P5，冷凍干燥成粉末，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.5 分子質(zhì)量分布測(cè)定

參考Zhou Xue等[24]的方法并略作修改。樣品過0.22 μm微孔濾膜，選擇TSK G2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相為乙腈∶水∶三氟乙酸＝20∶80∶0.1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫平衡在35 ℃，流速0.5 mL/min，在220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)流出物。以細(xì)胞色素C（12500 Da）、抑肽酶（6512 Da）、VB12（1300 Da）、四肽GGYR（451 Da）和三肽GGG（189 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，通過比較樣品中不同組分的保留時(shí)間計(jì)算樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.6 LC-MS/MS鑒定

LC條件：色譜柱預(yù)柱為Acclaim PepMap RPLC C18（300 μm×5 mm，5 μm，100 ?），分析柱為Acclaim PepMap RPLC C18（150 μm×150 mm，1.9 μm，100 ?）；流動(dòng)相A：99.9%水＋0.1%甲酸，流動(dòng)相B：0.1%甲酸＋80%乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min，96%～92% A、4%～8% B；2～45 min，92%～72% A、8%～28% B；45～55 min，72%～60% A、28%～40% B；55～56 min，60%～5% A、40%～95% B；56～66 min，5% A、95% B；流速600 nL/min。

將肽段用500 μL上樣緩沖液（含99.9% H2O、0.1%甲酸）溶解后，以4 ℃、13200 r/min離心20 min，取上清液，直接進(jìn)入Q Exactive MS儀進(jìn)行在線檢測(cè)。

MS 條件：一級(jí)M S：分辨率70000；AGC目標(biāo)3×106；最大噴射時(shí)間100 ms；掃描范圍m/z300～1800。二級(jí)MS：分辨率17500；AGC目標(biāo)1e5；最大噴射時(shí)間50 ms；TopN 20；NCE/steppedNCE 28。

1.3.7 咸味評(píng)價(jià)

參考李微等[25]的咸味評(píng)價(jià)方法，對(duì)面筋蛋白咸味酶解液和分離純化各組分進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)小組由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的8 名男性和8 名女性組成，年齡在20～35 歲之間。咸味評(píng)分采用10 分制（0表示沒有咸味，3表示咸味微弱，5表示咸味適中，7表示咸味強(qiáng)烈，10表示咸味非常強(qiáng)烈）。0.2%食鹽溶液的咸味作為參照（咸味得分為5）。評(píng)定過程在（25±2）℃的感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行，感官評(píng)價(jià)人員每次先取1.0 mL 0.2%食鹽溶液，然后再取1.0 mL樣品評(píng)定其咸味（不考慮其他味道），10 s后吐出漱口，每個(gè)樣品間隔1.0 min，每次測(cè)定樣品個(gè)數(shù)不超過6 個(gè)。以感官評(píng)分的平均值作為最終咸味得分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 面筋蛋白咸味酶解液脫鹽后成分分析

由表1可知，大孔樹脂純化脫鹽后小麥面筋蛋白咸味粗肽中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由71.37%提高至91.18%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由12.37%下降到1.83%，說明DA201-C大孔樹脂對(duì)小麥面筋咸味粗肽脫鹽效果較好，但面筋蛋白酶解液的咸味沒有顯著增加，說明酶解液中鹽離子對(duì)酶解液的咸味影響不大。

表1 脫鹽前后面筋蛋白咸味酶解產(chǎn)物的成分和咸味評(píng)分Table 1 Composition and saltiness score of the salty enzymatic hydrolysate of gluten before and after desalting

2.2 面筋蛋白咸味酶解液超濾膜分離分析

超濾膜分離常用于蛋白制品的分離純化，具有工藝流程短、耗用化學(xué)試劑少等優(yōu)點(diǎn)[26]。將脫鹽后的酶解液通過超濾裝置進(jìn)行初步分離純化，通過3 種不同分子質(zhì)量濾膜可將小麥面筋蛋白咸味酶解液分成4 個(gè)組分：F1、F2、F3、F4。

由表2可知，脫鹽后酶解液為棕黃色濁液，經(jīng)5 kDa超濾膜處理后，截留液成深棕黃色，與酶解液相比更加渾濁；同時(shí)，經(jīng)過3 kDa與1 kDa超濾膜的分離，透過液呈淺黃色，色澤澄清透明，說明通過超濾可以有效去除酶解液中的渾濁物質(zhì)。通過感官評(píng)定將不同組分與0.2%食鹽溶液進(jìn)行對(duì)比，可以看出，分子質(zhì)量3 kDa以上的截留液的咸味值相對(duì)較弱，而分子質(zhì)量3 kDa以下的組分咸味值明顯超過了0.2%食鹽溶液。其中，1～3 kDa截留液的咸味值與脫鹽后酶解液接近，而小于1 kDa的透過液的咸味值最高。綜上所述，酶解液中呈咸味的成分可能主要集中在3 kDa以下。

表2 超濾各組分咸味評(píng)價(jià)Table 2 Saltiness evaluation of ultrafiltration fractions

對(duì)超濾后得到的4 個(gè)組分肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定，如表3所示，超濾膜能夠富集并濃縮不同分子質(zhì)量的肽段。通過逐級(jí)分離，分子質(zhì)量小于1 kDa的肽段比例不斷增加，最終可達(dá)到84.23%的收集效率，比脫鹽后的小麥面筋蛋白咸味粗肽中小于1 kDa的比例增加9.47%。然而，超濾膜并不能達(dá)到100%完全富集的效果，截留液中存在比超濾膜更小的組分。這主要是因?yàn)椴捎贸瑸V膜分級(jí)超濾時(shí)，盡管可以通過不斷稀釋樣液以延長(zhǎng)超濾時(shí)間提高小于膜組分的透過效率，但樣液中小于膜的組分仍無法完全透過超濾膜[27]。而截留液中存在比超濾膜較大的組分，可能是因?yàn)槊附庖褐须牡姆肿咏Y(jié)構(gòu)大部分呈線性結(jié)構(gòu)，在膜附近由于自身的可變形范圍較大，再加上壓力的驅(qū)動(dòng)作用會(huì)使部分大分子質(zhì)量的肽通過超濾膜進(jìn)入透過液，因此超濾膜實(shí)際有效截留分子質(zhì)量大于理論截留分子質(zhì)量。

表3 超濾膜處理后不同組分肽分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular mass distribution of peptides in different ultrafiltration fractions%

2.3 Sephadex G-15陽離子層析結(jié)果與分析

凝膠柱Sephadex G-15被用來分離小于1000 Da的肽段，同時(shí)具有較好的脫鹽作用[28]。由圖1可知，F(xiàn)4組分被分離成5 個(gè)組分（P1、P2、P3、P4、P5），保留時(shí)間在125～460 min之間，各峰之間距離適中，說明分離效果較好。其中，P1出峰時(shí)間最早，分子質(zhì)量最大；P2的峰型窄而尖，響應(yīng)值較大，說明此肽段純度較高；P3、P4、P5峰型比較圓滑且較寬，說明這些峰的肽段分子質(zhì)量范圍跨度較大，含有多種物質(zhì)[29]。經(jīng)多次分離，分別收集各組分，冷凍干燥后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

圖1 超濾所得組分凝膠滲透色譜圖Fig.1 Gel filtration chromatogram of F4

超濾后F4組分經(jīng)Sephadex G-15凝膠柱分離得到的5 個(gè)組分咸味評(píng)價(jià)如表4所示，P1、P2組分咸味值相對(duì)較高，尤其是P2組分，與超濾后的F4組分相比咸味值明顯提升。而洗脫時(shí)間越靠后的組分（P3、P4、P5），咸味值越小，說明咸味肽主要集中在P1與P2組分中。此外，P1峰較寬，且收集到的樣品顏色最深，可能雜質(zhì)色素含量較高；P2組分中咸味肽含量最高且肽段較純，因此選擇P2組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

表4 凝膠層析分離組分的咸味評(píng)價(jià)Table 4 Salty taste evaluation of subfractions separated by gel filtration chromatography

2.4 咸味肽序列的鑒定

多肽鍵中酰胺鍵易于斷裂，產(chǎn)生較多b和y離子。通過分析二級(jí)MS中的b和y離子碎片，得到多肽的氨基酸序列[30]。咸味組分P2通過LC-MS/MS系統(tǒng)分析檢測(cè)，通過手動(dòng)測(cè)序及數(shù)據(jù)庫對(duì)比后得到5 種響應(yīng)值較高的咸味肽氨基酸序列（圖2）：PFGQQ（Pro-Phe-Gly-Gln-Gln）、PFSPQ（Pro-Phe-Ser-Pro-Gln）、QPFP（Gln-Pro-Phe-Pro）、PDFP（Pro-Asp-Phe-Pro）、FDDP（Phe-Asp-Asp-Pro），分子質(zhì)量分別為576.28、575.28、488.25、475.22、493.21 Da。Zheng Yingying等[31]在天然酵母FA31中發(fā)現(xiàn)Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu和Phe-Ile 5 種咸味肽。從5 條肽段的氨基酸序列可以看出，這些肽段包含已報(bào)道的咸味二肽或三肽序列，這可能是造成這5 條肽段呈咸味的重要原因。

圖2 P2組分中5 個(gè)肽段的二級(jí)MS圖Fig.2 Secondary mass spectra of 5 peptide fragments in subfraction P2

3 結(jié)論

利用食品級(jí)蛋白酶復(fù)合對(duì)面筋蛋白粉進(jìn)行酶解，通過逐級(jí)純化酶解液對(duì)小麥中的咸味肽進(jìn)行分離，選用超濾膜過濾、Sephadex G-15凝膠色譜對(duì)凍干后咸味組分進(jìn)行純化并收集，并通過LC-MS/MS對(duì)純化后咸味肽含量最高且肽段較純的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。經(jīng)LC-MS/MS鑒定出5 種咸味肽序列，分別為PFGQQ、PFSPQ、QPFP、PDFP、FDDP，其分子質(zhì)量分別為576.28、575.28、488.25、475.22、493.21 Da，此序列包含已報(bào)道的咸味二肽或三肽序列。該結(jié)果為面筋蛋白咸味肽的開發(fā)提供了一定理論指導(dǎo)，對(duì)于咸味肽的發(fā)展具有重要意義。