劉雪梅,王華敏,趙 利,白春清
(江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330013)
近年來,多酚類化合物因廣泛的生物活性備受關(guān)注,橙皮苷(hesperidin,HES)、柚皮苷(naringin,NAR)是柑橘類黃酮多酚的典型代表。HES是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷,多來源于橘子、橙子和檸檬等柑橘類水果中,其分子式為C28H34O15;而NAR存在于葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中,兩者結(jié)構(gòu)相似(圖1),均有8 個(gè)酚羥基,但NAR在C-4位置有一個(gè)羥基,而HES在C-4位置是一個(gè)甲氧基,在C-5位置有一個(gè)羥基。兩者因具有抗炎[1]、抗腫瘤[2-3]、清除自由基[1,4]及減低血管脆性[5]等多種生理功能,目前多應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,其中HES被研究者們認(rèn)定為一種有前景的預(yù)防和治療新冠肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)感染的藥物[6]。因此,HES、NAR的生物活性研究、改性研究以及藥理研究成為近年來研究的熱點(diǎn)。然而,HES、NAR水溶性和吸收性較差,導(dǎo)致其生物利用度較低。采用遞送載體進(jìn)行包埋,已被證實(shí)是改善功能因子水溶性、提高穩(wěn)定性及生物利用度的有效方法,而適宜載體的開發(fā)對(duì)解決HES、NAR上述缺陷具有重要意義。
圖1 HES、NAR結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulae of HES and NAR
CA是哺乳動(dòng)物奶中的主要蛋白質(zhì)之一,作為一種公認(rèn)的安全蛋白質(zhì),由于營養(yǎng)價(jià)值豐富,還具有優(yōu)良的表面活性、穩(wěn)定性、乳化性和自組裝性能等功能特性,在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)CA可與離子、小分子、大分子結(jié)合并形成復(fù)合物,被認(rèn)為是生物活性物質(zhì)的天然載體,可包埋和保護(hù)小分子功能因子,以促進(jìn)功能因子更好吸收和釋放,提高其在水中的溶解度和化學(xué)穩(wěn)定性,因此,CA在功能因子、藥物新型傳遞系統(tǒng)中得到了越來越多的應(yīng)用[7-8]。有研究表明CA可與藍(lán)莓花青素產(chǎn)生相互作用并結(jié)合,藍(lán)莓花青素被包裹于蛋白質(zhì)中,可提高藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性及抗氧化能力[9];程昊[10]發(fā)現(xiàn)CA作為載體包埋白藜蘆醇后能夠提高順、反式-白藜蘆醇的貯藏穩(wěn)定性。因此,采用CA對(duì)NAR、HES進(jìn)行包埋,可解決NAR、HES的上述缺陷。
蛋白質(zhì)自組裝包埋多酚的過程與蛋白質(zhì)-多酚間的相互作用密切相關(guān),并對(duì)載體穩(wěn)定性、包埋物的釋放等起著決定性作用[11]。目前,CA與多種多酚類物質(zhì)如茶多酚[12]、木糖醇[13]、花青素[14]間的相互作用已有報(bào)道;HES、NAR與蛋白質(zhì)的相互作用也有相關(guān)研究,如:劉蓉[15]發(fā)現(xiàn)NAR誘導(dǎo)的牛血紅蛋白的熒光猝滅機(jī)制是一個(gè)靜態(tài)猝滅過程且兩者間的結(jié)合僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn);也有研究表明HES與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)間的相互作用為單一的動(dòng)態(tài)猝滅過程,且主要靠疏水作用力結(jié)合[16]。然而,國內(nèi)外對(duì)HES、NAR與CA之間的相互作用研究較少,其作用機(jī)制尚不清楚,CA作為HES、NAR載體的可行性有待驗(yàn)證。因此,探究CA與HES、NAR的相互作用及其機(jī)制,對(duì)HES、NAR遞送載體的開發(fā)具有重要意義。
有研究表明,熒光光譜是研究分子間相互作用的有效方法,通過對(duì)熒光數(shù)據(jù)的分析結(jié)合同步熒光光譜、熱力學(xué)參數(shù)分析可獲得小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用方式、作用位點(diǎn)及結(jié)合力類型等有效信息。分子對(duì)接則可利用計(jì)算機(jī)模擬可視化技術(shù)實(shí)現(xiàn)受體與配體空間結(jié)構(gòu)的匹配,通過對(duì)分子對(duì)接結(jié)果的分析,計(jì)算出多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用力、相互作用力距離、相互作用官能團(tuán)及結(jié)合位點(diǎn)等,從理論上分析相互作用的可行性以及相互作用機(jī)制[11]。
綜上,本研究擬綜合采用熒光光譜、同步熒光光譜結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)分析及分子對(duì)接比較研究CA與HES及NAR之間的相互作用及機(jī)制,以期為黃酮類多酚與蛋白質(zhì)間的相互作用研究以及CA作為HES及NAR載體的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
酪蛋白(casein,CA) 美國Sigma公司;HES(純度≥95%)、NAR(純度≥95%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。
F-2700熒光分光光度計(jì) 深圳市譜賽斯科技有限公司;85-2恒溫磁力攪拌機(jī) 上海向帆儀器有限公司;PHS-25型酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;激光粒度分析儀 英國Malvern公司;U-T6A紫外-可見分光光度計(jì) 屹譜儀器制造有限公司。
1.3.1 溶液配制
配制pH 7.410 mmol/L的磷酸緩沖鹽溶液,并以此為溶劑配制1 mg/mL的CA儲(chǔ)備液,4 ℃保存?zhèn)溆茫籋ES或NAR使用去離子水溶解,并使用0.1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)至12,配制成濃度為1 mmol/L的HES及NAR溶液作為儲(chǔ)備液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 多酚與CA相互作用的熒光光譜
將CA質(zhì)量濃度固定在0.8 mg/mL,滴加HES或NAR儲(chǔ)備液至多酚濃度為0~9.68×10-6mol/L,于不同溫度下(298、304、310 K)充分振蕩混合1 h后,移入石英比色皿中,在激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm條件下進(jìn)行掃描,記錄發(fā)射波長為300~500 nm的熒光光譜。以不含多酚的CA作為空白對(duì)照,掃描熒光強(qiáng)度。
為探究CA分別與HES、NAR的相互作用機(jī)制,采用Stern-Volmer方程對(duì)熒光光譜測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合,并基于相關(guān)參數(shù)的分析對(duì)熒光猝滅類型進(jìn)行判斷。Stern-Volmer方程如下:
式中:F0為未加入多酚時(shí)CA的熒光發(fā)射強(qiáng)度;F為含多酚時(shí)CA的熒光發(fā)射強(qiáng)度;KQ為雙分子猝滅過程速率常數(shù)/(kJ/(mol?K));[Q]為多酚濃度/(mol/L);KSV為Stern-Volmer的猝滅常數(shù)/(L/mol);τ0為沒有猝滅劑(HES、NAR)存在下熒光分子平均壽命(10-8s)。
對(duì)于靜態(tài)猝滅,可以使用雙對(duì)數(shù)方程(式(2))計(jì)算結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)。
式中:Ka為結(jié)合常數(shù)/(L/mol);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。
為進(jìn)一步研究CA與HES、NAR的相互作用所涉及的熱力學(xué)參數(shù),引入了Van’t Hoff方程計(jì)算焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和自由能變化(ΔG)。
式中:R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K));T為絕對(duì)溫度/K;Ka為結(jié)合常數(shù)/(L/mol)。
1.3.3 同步熒光光譜法分析
設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm,參照1.3.2節(jié)方法制備樣品,測(cè)定樣品在298 K溫度下,Δλ分別為15、60 nm時(shí),激發(fā)波長為200~350 nm的同步熒光光譜。
1.3.4 分子對(duì)接
β-CA是CA的主要成分,本研究將β-CA模型作為CA分子對(duì)接模型,探討β-CA與HES及NAR之間的相互作用。β-CA的氨基酸序列在Uniprot(https://www.uniprot.org/)上搜索,選擇UniProtKB為P02666的序列在I-TASSER服務(wù)器進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[17]。β-CA模型的質(zhì)量由C-score預(yù)測(cè),其C-score為-2.41,屬于[-5,2]的置信區(qū)間,這表明模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和合理性較好。將預(yù)測(cè)模型使用SPDVB軟件能量最小化,最終三維模型如圖2所示。HES和NAR的3D結(jié)構(gòu)(CID分別為10621、442428)從PubChem數(shù)據(jù)庫(http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)中下載。將配體(HES、NAR)和受體(β-CA)利用AutoDockTools-1.5.6預(yù)處理后,使用AutoDock Vina進(jìn)行半柔性分子對(duì)接,且以全蛋白作為潛在的結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)行盲對(duì)接。對(duì)接坐標(biāo)為x=64.904、y=64.72、z=67.736,最終選擇自由結(jié)合能最低的構(gòu)象,使用Pymol和Ligplot進(jìn)行分析處理。
圖2 β-CA的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of β-CA
1.3.5 粒徑的測(cè)定
取1.3.2 節(jié)制備的復(fù)合物(多酚濃度為0、9.68×10-6mol/L),分別放入檢測(cè)池中依次測(cè)量粒徑。
1.3.6 抗氧化性的測(cè)量
根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法略有改動(dòng)。將CA質(zhì)量濃度固定在1.6 mg/mL,滴加HES或NAR儲(chǔ)備液至多酚濃度為0~19.36×10-6mol/L,于298 K條件下充分振蕩混合1 h后獲得CA-HES、CA-NAR復(fù)合物。將20 mmol/L的FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液和0.3 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)按照體積比1∶1∶10混合配制成TPTZ工作液,避光放置于37 ℃水浴鍋中,移取4.5 mL工作液分別加入1 mL CA-HES、CA-NAR復(fù)合溶液、HES和NAR樣品溶液進(jìn)行混合。以磷酸緩沖液代替樣品為空白(A0),對(duì)照組(A1)則以4.5 mL去離子水代替混合液。將反應(yīng)液放置黑暗中,37 ℃反應(yīng)10 min后于波長593 nm 處測(cè)定吸光度(A實(shí)驗(yàn))。使用式(5)計(jì)算出各樣品的鐵離子還原力。
所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次,采用Origin 2019繪圖,IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差分析,Duncan多重檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異,顯著水平為P<0.05。
蛋白質(zhì)中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光,當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時(shí),蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要由Trp和Tyr產(chǎn)生[19]。由圖3可知,CA具有較高的熒光強(qiáng)度,兩種多酚的加入均可導(dǎo)致CA熒光強(qiáng)度的降低,且隨著多酚濃度的增加,CA的固有熒光逐漸減弱,且在多酚濃度相同條件下,溫度越高,降低幅度越大。如:CA在最大吸收波長處的熒光強(qiáng)度為3895.667,當(dāng)加入HES(4.92×10-6mol/L)后,在不同溫度下(298、304 K和310 K)反應(yīng)1 h熒光強(qiáng)度分別降至3311.333、3097.333、3047.667;類似的,在加入相同濃度的NAR(4.92×10-6mol/L)后,在不同溫度下熒光強(qiáng)度分別降至3448.667、3275.333、3236.667。這些結(jié)果說明HES及NAR與CA發(fā)生了相互作用,且引起了典型的熒光猝滅現(xiàn)象[20]。此外,比較HESCA與NAR-CA的熒光光譜發(fā)現(xiàn),HES對(duì)CA熒光強(qiáng)度的猝滅效果強(qiáng)于NAR。如:在298 K條件下,兩種多酚濃度相同時(shí)(9.68×10-6mol/L),CA熒光強(qiáng)度由4066.333降至2869,降低了29.45%,而HES組的熒光強(qiáng)度則下降了32.39%。同時(shí)可發(fā)現(xiàn),CA的最大發(fā)射波長為336 nm,隨著HES及NAR的引入量增多,發(fā)生輕微紅移(約1 nm),說明HES及NAR的加入改變了CA的熒光基團(tuán)的微環(huán)境[21-22]。
圖3 HES、NAR對(duì)CA熒光猝滅光譜Fig.3 Fluorescence quenching spectra of HES and NAR for CA
CA分別與HES、NAR相互作用的Stern-Volmer方程的曲線擬合結(jié)果如圖4所示,相關(guān)參數(shù)見表1??砂l(fā)現(xiàn)3 種不同溫度下擬合曲線的相關(guān)系數(shù)都大于0.99,表明線性關(guān)系良好,因此可以用Stern-Volmer方程進(jìn)行分析。一般來說,熒光猝滅機(jī)理可以分為兩種:靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅,且可根據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度的變化進(jìn)行判斷。對(duì)于靜態(tài)猝滅,其熒光猝滅的發(fā)生是源于熒光分子和猝滅劑之間形成不發(fā)光的復(fù)合物,因此溫度升高,猝滅常數(shù)則下降;對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅,其熒光強(qiáng)度的降低是源于熒光分子和猝滅劑之間發(fā)生相互碰撞所致,即溫度越高,熒光分子和猝滅劑之間的有效碰撞越多,擴(kuò)散系數(shù)越大,猝滅常數(shù)也隨之增大,故而溫度升高,動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)會(huì)隨之增加[23]。由表1可知,HES-CA、NAR-CA在298、304 K和310 K處的KQ值都遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)值(2.0×1010L/(mol?s)),且猝滅常數(shù)(KSV)隨溫度升高而降低,說明HES、NAR對(duì)CA熒光的猝滅都為靜態(tài)猝滅,且隨著溫度升高所形成的復(fù)合物穩(wěn)定性降低[24]。同時(shí)可發(fā)現(xiàn),相同溫度下,HES-CA的KQ、KSV值都大于NAR-CA的對(duì)應(yīng)值,如:298 K條件下,HES-CA的KQ、KSV值分別為5.92×1012L/(mol?s)、5.92×104L/mol,而對(duì)應(yīng)NAR-CA值分別為4.74×1012L/(mol?s)、4.74×104L/mol。說明同等條件下,HES對(duì)CA內(nèi)源熒光的猝滅速率快于NAR。
表1 不同溫度下HES、NAR與CA相互作用的猝滅常數(shù)KSV、結(jié)合常數(shù)Ka及相關(guān)參數(shù)Table 1 Quenching constant (KSV),binding constant (Ka) and other related parameters of the interaction between HES or NAR and CA at different temperatures
如表1所示,HES-CA、NAR-CA復(fù)合物的Ka均隨溫度升高而升高,表明兩者均為吸熱反應(yīng)[25],這個(gè)結(jié)論可由表2中的焓變(ΔH)進(jìn)一步驗(yàn)證;Ka值均在105數(shù)量級(jí)以上,表明兩種多酚與CA之間均有較強(qiáng)的結(jié)合作用[26],而HES-CA復(fù)合物的Ka值(4.73×106(298 K)、12.56×106(304 K)和19.75×106L/mol(310 K))高于NAR-CA的Ka值(0.90×106(298 K)、5.02×106(304 K)和11.69×106L/mol(310 K)),說明與NAR相比,HES對(duì)CA有更強(qiáng)的結(jié)合親和力。目前,有研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與BSA的結(jié)合親和力HES強(qiáng)于NAR[27],這與本研究結(jié)果類似。此外,HES-CA和NAR-CA復(fù)合物的n值均約為1.5,表明兩種多酚與CA均以3∶2比例結(jié)合[28]。同樣可發(fā)現(xiàn),NAR-CA復(fù)合物的n值低于HESCA,說明NAR與CA的相互作用位點(diǎn)比HES與CA間少,這也與圖3所示的HES組比NAR組具有更強(qiáng)的熒光猝滅效果一致。
熱力學(xué)參數(shù)常用于生物活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用的判定(如氫鍵、疏水力和靜電力)。通過ΔH和ΔS的符號(hào),可以深入分析分子間的作用力。如:當(dāng)?H>0,?S>0時(shí),表示疏水力占主導(dǎo)地位;?H<0,?S<0表示范德華力或氫鍵占主導(dǎo)地位;?H<0,?S>0表示以靜電相互作用為主[29]。利用上述2.2節(jié)分析結(jié)果計(jì)算了HES、NAR與CA相互作用相關(guān)的重要熱力學(xué)參數(shù)。圖5顯示了294、304、310 K時(shí)lnKa對(duì)1/T的變化,然后利用Van’t Hoff方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,以確定結(jié)合?H、?S,計(jì)算結(jié)果列于表2??砂l(fā)現(xiàn),?H>0且?S>0,表明兩種多酚與CA之間均是疏水相互作用力占主導(dǎo)地位;類似的,有研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用中疏水作用力起主要作用[30]。此外,表2中?G均小于0,說明兩種多酚與CA之間的反應(yīng)均是自發(fā)相互作用[21];而HES-CA的?H小于NAR-CA,說明在反應(yīng)過程中,NAR與CA的結(jié)合需吸收更多的熱量。
表2 熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters
圖5 HES-CA、NAR-CA體系的Van’t Hoff曲線Fig.5 Van’t Hoff curve of HES-CA and NAR-CA systems
同步熒光光譜常用于監(jiān)測(cè)蛋白與多酚結(jié)合前后的微環(huán)境變化[31],設(shè)定Δλ=60 nm、Δλ=15 nm監(jiān)測(cè)到的熒光光譜可分別反映CA中熒光殘基基團(tuán)Tyr、Trp殘基微環(huán)境的變化。圖6顯示,未加多酚時(shí),Tyr殘基在最大波長處的熒光強(qiáng)度為1002.03,顯著低于Trp殘基的熒光強(qiáng)度(4080),說明CA的內(nèi)源熒光主要由Trp殘基貢獻(xiàn)。而加入多酚后,隨著溶液中多酚濃度的增加,兩種氨基酸殘基的熒光強(qiáng)度都逐漸降低,且多酚對(duì)Tyr殘基的猝滅能力比Trp殘基更強(qiáng)。如當(dāng)HES濃度為9.68×10-6mol/L時(shí),Trp殘基的熒光強(qiáng)度由4080降至2929,下降了28.21%;而Tyr殘基的熒光強(qiáng)度由1002.03降至700,降低了30.14%。此外,多酚的加入一定程度上可引起最大波長發(fā)生偏移。一般情況下,藍(lán)移表明氨基酸殘基周圍的疏水性增加,而紅移表明這些殘基更多暴露于親水相[32]。由圖6A可發(fā)現(xiàn),當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),最大波長從276 nm移至274 nm,發(fā)生輕微藍(lán)移,這表示HES和CA相互作用后Trp殘基周圍的疏水性提高,極性降低;但當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),未發(fā)生偏移。因此,HES與CA的結(jié)合主要改變了CA中Trp殘基附近的微環(huán)境,使其腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性降低。對(duì)于NAR-CA復(fù)合物,NAR同樣主要改變了Trp殘基的微環(huán)境,使其疏水性提高。
圖6 HES-CA、NAR-CA相互作用的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of HES-CA and NAR-CA interactions
利用AutoDock Vina軟件研究β-CA與HES、NAR的相互作用。圖7A1、B1為分別選取的兩個(gè)最佳構(gòu)象,其親和力分別為-10.7、-10.6 kJ/mol,通過觀察對(duì)接示意圖,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)多酚與β-CA的結(jié)合位點(diǎn)都在疏水內(nèi)腔深處,形成了相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象[33],因此,CA有望成為HES及NAR的包埋載體。為進(jìn)一步了解HES、NAR與β-CA相互作用的微環(huán)境,列出了位于結(jié)合位點(diǎn)周圍影響較大的殘基,圖7A2、B2顯示,有9 個(gè)(Glu132、Arg40、Gln138、Lys63、His163、Lys128、Leu154、Ser111和Gln156)和7 個(gè)(Gln138、Lys128、Leu154、Ser111、Gln156、Val110和Met108)氨基酸殘基分別參與HES、NAR與CA的結(jié)合相互作用。為了觀察疏水作用力和氫鍵對(duì)結(jié)合時(shí)的影響,利用LigPlot作圖(圖7A3、B3),發(fā)現(xiàn)HES與β-CA的氨基酸殘基之間存在疏水作用力的有:
圖7 HES、NAR與β-CA復(fù)合物的對(duì)接位點(diǎn)和相互作用Fig.7 Docking sites and interactions between HES or NAR and β-CA
Pro133、Gly109、Met108、Val107、Val110、Leu155、Pro153、Pro165、Glu106、Ile41、Phe134,同時(shí)β-CA腔內(nèi)Arg40、Glu132、Gln156、Ser111、Leu154、Lys128、His163、Lys63、Gln138與HES存在氫鍵相互作用,鍵長為2.69~3.32 ?。一般情況下,鍵長越接近2.5 ?則氫鍵作用力越強(qiáng),而越接近3.5 ?代表氫鍵作用力越弱。經(jīng)測(cè)量發(fā)現(xiàn),氨基酸Leu154和Gln138與HES間的鍵長較短,即這兩種氨基酸與HES結(jié)合時(shí)產(chǎn)生了較強(qiáng)的氫鍵作用,而其他氨基酸因與HES間距離較遠(yuǎn)主要以疏水相互作用與HES結(jié)合。因此,HES與β-CA間以疏水作用力為主,氫鍵相互作用為輔的模式下發(fā)生結(jié)合并形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。在NAR與β-CA相互作用的2D圖中可發(fā)現(xiàn)二者間存在11 個(gè)疏水作用力和8 個(gè)氫鍵,而HES與β-CA間有11 個(gè)疏水作用和10 個(gè)氫鍵,這是由于HES中C-4位置上的甲氧基,C-5的羥基都與CA殘基形成了氫鍵,而NAR在C-4的羥基未與CA殘基形成氫鍵。這個(gè)結(jié)果表明,羥基化位置和增加甲氧基取代都會(huì)影響HES、NAR對(duì)β-CA的親和力[34]。由此可見,與NAR相比,HES對(duì)CA擁有更強(qiáng)結(jié)合親和力。
綜上,CA與HES、NAR間的相互作用主要為疏水相互作用,且CA與HES間的結(jié)合親和力更強(qiáng),這一結(jié)論與上述的熱力學(xué)參數(shù)分析結(jié)論一致。
CA 與HES、NAR 結(jié)合前后的平均粒徑分別為224.37、220.83、211.07 nm,表明多酚的加入抑制了CA膠束的聚集。由圖8可發(fā)現(xiàn),CA與HES、NAR結(jié)合后,小尺寸的峰值(約58 nm)增大,大尺寸峰值(約300 nm)減小。有文獻(xiàn)表明β-CA膠束的尺寸小于100 nm[35],因此58 nm左右出現(xiàn)的峰值很可能是β-CA膠束或含有多酚的β-CA膠束,峰值增大表明β-CA與HES、NAR的結(jié)合增強(qiáng)了膠束的形成,這說明HES、NAR和β-CA相互作用形成了新的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;而300 nm左右峰值減小表明形成了一種比膠束更松散的CA結(jié)構(gòu)[36]??傊喾拥募尤朊黠@抑制了CA膠束的聚集,造成平均粒徑減小。
圖8 CA與HES、NAR結(jié)合前后粒徑分布圖Fig.8 Particle size distribution of CA before and after combination with HES or NAR
由圖9所示,發(fā)現(xiàn)HES-CA、NAR-CA復(fù)合物可表現(xiàn)出相較于CA更好的抗氧化性。未加HES、NAR的CA還原力為0.081,而與多酚后相互作用后,HES-CA復(fù)合物的總還原力介于0.117~0.183之間,NAR-CA復(fù)合物的總還原力介于0.104~0.136之間。實(shí)驗(yàn)證明,HES、NAR的加入可使CA的抗氧化能力明顯上升且隨著多酚添加量的增加而增加,這也證明了CA作為HES、NAR載體的可行性。而HES組的抗氧化活性略強(qiáng)于NAR組,同樣可能是因?yàn)椴煌恢玫姆恿u基抗氧化活性不同造成。
圖9 FRAP法測(cè)定CA與HES、NAR結(jié)合前后的還原力Fig.9 Reducing power measured by FRAP method for CA before and after binding to HES or NAR
采用熒光光譜、同步熒光光譜的影響,并結(jié)合熱力學(xué)分析、分子模擬較為全面地比較研究了HES、NAR與CA的相互作用、相互作用的差異及作用機(jī)制。結(jié)果表明:兩種多酚都猝滅了CA的固有熒光,但HES對(duì)CA的熒光猝滅效果強(qiáng)于NAR;兩種多酚與CA的結(jié)合約以3∶2比例自發(fā)進(jìn)行,而疏水作用力在這過程中起重要作用,但HES與CA之間的結(jié)合位點(diǎn)更多,結(jié)合親和力更強(qiáng);兩種多酚的加入均引起了CA內(nèi)Trp殘基微環(huán)境疏水性的提高、極性降低;HES及NAR可與β-CA的疏水內(nèi)腔穩(wěn)定結(jié)合,且β-CA與HES間存在更多的氫鍵作用位點(diǎn),形成的β-CA-HES復(fù)合物較β-CA-NAR更穩(wěn)定。同時(shí),兩種多酚的加入明顯抑制了CA膠束的聚集,并增強(qiáng)了復(fù)合物的抗氧化活性,因此本研究可為CA作為HES、NAR的可行性提供了參考依據(jù)。