吳 爽，王 涵，王 展,2，沈汪洋,2，胡中澤,2，周 堅(jiān),2，黃文晶,2,*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430048；2.大宗糧油精深加工省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430048）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，含多種必需氨基酸與生物活性成分[1]，其分子中含有的兩親性基團(tuán)，賦予了其極佳的表面活性，從而使其制備的納米乳液具備包載疏水性物質(zhì)的特性。研究表明WPI在高溫、高鹽和酸等加工方式的影響下易變性或聚集，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品的品質(zhì)不穩(wěn)定，這些因素極大限制了WPI在食品納米工程中的應(yīng)用。為拓寬WPI的應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)WPI修飾改性被廣泛研究。近年來(lái)，以美拉德反應(yīng)為機(jī)理的蛋白質(zhì)-糖接枝改性方法得到了研究人員的廣泛關(guān)注[2-4]，改性后的蛋白功能特性得到了極大的改善[5-6]，Wang Luhui等[7]發(fā)現(xiàn)鴨蛋清蛋白-麥芽糊精復(fù)合物乳化性更穩(wěn)定，能承受離子濃度和酸性條件變化對(duì)乳化性的影響。Yi Jiang等[8]用β-乳球蛋白-葡聚糖復(fù)合物包載β-胡蘿卜素，顯著提高β-胡蘿卜素在胃環(huán)境中的穩(wěn)定性（P＜0.05）。報(bào)道表明定向的美拉德反應(yīng)可有效改善蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，此方法操作簡(jiǎn)單、綠色健康，在食品的加工中被廣泛應(yīng)用[9]。

我國(guó)是全球水稻生產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的國(guó)家[10-11]，而米糠作為主要加工副產(chǎn)物，主要部分被應(yīng)用于飼料加工行業(yè)，應(yīng)用附加值相對(duì)較低[12-13]。米糠多糖（rice bran polysaccharide，RBP）是米糠的主要成分之一，是天然可再生資源，具有無(wú)毒、生物相容性高和可生物降解等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)[14]。研究表明RBP能夠提高人體免疫力，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂和降血糖等多種生理功能[15-19]，在保健品、乳制品、面包等食品工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。天然多糖分子鏈上含有大量的羥基和醛基等活性位點(diǎn)，非常有利于修飾，能可控改變其物理化學(xué)性質(zhì)，賦予多糖新的特性，如增加多糖的親水性或疏水性，改變多糖的分子質(zhì)量、凝膠性、流變學(xué)性和成膜性等，便于拓寬多糖的應(yīng)用領(lǐng)域，特別是在多糖載體的研究和開發(fā)應(yīng)用等方面。多糖修飾常用的方法有物理法、生物法和化學(xué)法[20]。物理法一般通過(guò)擠壓、超聲波、微波等方式改變RBP的糖苷鍵[20-24]；生物法一般采用生物發(fā)酵法和酶法修飾RBP的主鏈或側(cè)鏈[25]；化學(xué)法用化學(xué)反應(yīng)方式對(duì)RBP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，最常用的是硫酸化[26-27]。RBP的大分子鏈上也存在眾多活潑基團(tuán)如羥基、羧基或醛基等易被修飾改性，可以與蛋白和多肽等大分子發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成共價(jià)化合物，相比其他化學(xué)修飾方法，美拉德反應(yīng)修飾多糖更符合食品工業(yè)“綠色安全標(biāo)簽”需求；且多糖對(duì)胃液中的胃蛋白酶的水解能力具有較高的抵抗性，可展現(xiàn)良好的消化穩(wěn)定性[28-29]，具有提升WPI消化穩(wěn)定性的潛力。與其他單糖和多糖相比，RBP屬于雜聚糖，其分子質(zhì)量較大，與WPI改性結(jié)合后吸附在油滴表面的吸附層也會(huì)更厚，因此具有乳化性能更強(qiáng)的潛力[30]。Delahaije等[31]研究了單糖（木糖、葡萄糖）、麥芽三糖和麥芽五糖對(duì)糖基化馬鈴薯蛋白制備乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，與單糖相比，麥芽三糖和麥芽五糖顯著增加了乳液的穩(wěn)定性，該研究說(shuō)明多糖修飾的蛋白相比單糖修飾的蛋白乳化性更好。因此本研究選擇RBP修飾WPI，期望發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，優(yōu)化WPI的乳化性、耐熱性、耐酸性等功能特性[32-33]，同時(shí)發(fā)揮RBP的多種生理功能，不僅可得到高效穩(wěn)定的口服新型乳化劑，還可開拓RBP的應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)推動(dòng)我國(guó)水稻產(chǎn)業(yè)綠色高值發(fā)展具有重要意義。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用干熱法制備WPI和RBP的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以A294nm、褐變程度、色澤變化、游離氨基含量等變化監(jiān)測(cè)美拉德反應(yīng)進(jìn)程，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定產(chǎn)物的分子質(zhì)量，對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的粒徑、乳化性和微觀結(jié)構(gòu)等進(jìn)行表征，旨在為RBP用于WPI的美拉德反應(yīng)改性提供理論基礎(chǔ)，拓展RBP應(yīng)用領(lǐng)域、滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康食品的消費(fèi)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（純度90%） 美國(guó)Hilmar 公司；RBP（純度96%，分子質(zhì)量5～450 kDa） 陜西金潤(rùn)生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 柯意哲（上海）機(jī)電工程有限公司；蛋白質(zhì)Marker（分子質(zhì)量10～180 kDa） 碧云天試劑公司；金龍魚大豆油（食品級(jí)） 益海嘉里有限公司；其他所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-18真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；ST3100 pH計(jì) 奧豪斯儀器（常州）有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；S-3000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立儀器公司；CS-10型色差儀 杭州彩譜科技有限公司；ZEN3600激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-RBP糖基化產(chǎn)物的制備

將WPI與RBP按照1∶1（m/m）比例溶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中，保證固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，調(diào)節(jié)溶液pH 8.0，在恒溫磁力攪拌器中連續(xù)攪拌5 h，將其充分混合后冷凍干燥，凍干后的粉狀物過(guò)100 目篩后放置于干燥器中（容器底部放置飽和KBr溶液），將干燥器置于鼓風(fēng)干燥箱中并調(diào)節(jié)溫度60 ℃從而保持干燥器內(nèi)相對(duì)濕度為79%，反應(yīng)6、12、18 h后即得WPI-RBP接枝物，所得產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.2A294nm和褐變程度的測(cè)定

用超純水稀釋蛋白樣品至2.5 mg/mL，以超純水作空白樣，采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定A420nm，即產(chǎn)物的褐變程度；而美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物常用294 nm波長(zhǎng)處吸光度表示，將待測(cè)樣品稀釋到1 mg/mL，測(cè)定A294nm。

1.3.3 色差分析

參考夏明敬等[34]的方法并稍作修改。稱取適量樣品于透明密封袋中，色差儀校準(zhǔn)黑白背景板后，測(cè)量蛋白的L*、a*和b*值。每個(gè)密封袋上取3 個(gè)點(diǎn)測(cè)定，以WPI為參考對(duì)照。根據(jù)下式計(jì)算樣品總顏色變化ΔE：

式中：ΔE為色差；L*為亮度值（0～100為表示由黑到白）；a*為紅色（＋）或者綠色（-）；b*為黃色（＋）或者藍(lán)色（-）。

1.3.4 游離氨基含量的測(cè)定

參考Mu Lixia等[35]的方法并稍作修改。稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醛中，分別加入200 g/L的SDS溶液2.5 mL、0.1 mol/L的四硼酸鈉溶液25 mL、100 μLβ-巰基乙醇，添加超純水定容至50 mL，配制OPA試劑。測(cè)定時(shí)，用移液槍取OPA試劑4 mL于離心管中，分別注入200 μL待測(cè)液，渦旋30 s混勻后于35 ℃的水浴鍋中反應(yīng)2 min，使用紫外分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，以加入200 μL水的OPA試劑為空白樣，兩者之差ΔA為自由氨基的凈吸光度。以賴氨酸作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)ΔA計(jì)算樣品中自由氨基的含量，以未經(jīng)改性的乳清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各樣品中游離氨基含量的相對(duì)百分比。

1.3.5 SDS-PAGE分析

參考Qin Xingang等[36]的方法并稍作修改。配制12%的分離膠和4%的濃縮膠。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解蛋白樣品，使其保持相同的蛋白濃度，然后在低速離心機(jī)中以5000 r/min離心5 min，取上清液40 μL，加入10 μL的5×上樣緩沖液，然后在沸水浴中加熱5 min后上樣。電泳過(guò)程中保持恒壓，濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后將凝膠取出，用考馬斯亮藍(lán)染色30 min，使用脫色液脫色至透明，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

1.3.6 乳化性能測(cè)定

參考朱巧梅等[37]的方法并稍作修改。乳狀液的乳化性質(zhì)用乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsification stability index，ESI）表示。取0.1 g樣品蛋白溶于10 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，加入4 mL的大豆油，在10000 r/min高速分散3 min后，分別于第0分鐘和第10分鐘從溶液底部吸取50 μL乳濁液，加到5 mL、0.1% SDS溶液中，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以0.1% SDS溶液為空白。EAI和ESI計(jì)算公式如下：

式中：A0為乳狀液第0分鐘500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A10為將乳狀液靜置10 min后所測(cè)得的吸光度；10為兩次測(cè)定乳化穩(wěn)定性時(shí)間間隔（min）；DF為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；θ為油相占體積分?jǐn)?shù)；Φ為比色皿光程。

1.3.7 SEM分析

用導(dǎo)電雙面膠將樣品固定在樣品臺(tái)上，取適量樣品撒在雙面膠上，用洗耳球吹去多余的粉末，真空噴金后置于SEM中觀察并拍攝樣品形貌照片。

1.3.8 粒徑分析

將不同反應(yīng)時(shí)間的樣品溶于超純水中，配制成1 mg/mL，使用ZEN3600粒度儀測(cè)量粒徑分布。

1.3.9 納米乳液穩(wěn)定性分析

1.3.9.1 納米乳液的制備

取一定質(zhì)量的蛋白溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）室溫下攪拌使蛋白溶解，以一定的比例加入大豆油，在10000 r/min高速剪切5 min，在通過(guò)單因素試驗(yàn)高壓均質(zhì)得到納米乳液。

1.3.9.2 納米乳液制備高壓均質(zhì)單因素試驗(yàn)

以納米乳液粒徑和聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究均質(zhì)壓力、均質(zhì)循環(huán)次數(shù)、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、油相體積分?jǐn)?shù)對(duì)納米乳液的影響。

1）改變均質(zhì)壓力為4000、7000、10000、13000、16000 psi，固定均質(zhì)循環(huán)6 次、WPI質(zhì)量濃度1 g/100 mL、大豆油體積分?jǐn)?shù)4%；2）改變均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為2、4、6、8、10 次，固定均質(zhì)壓力16000 psi、WPI質(zhì)量濃度1 g/100 mL、大豆油體積分?jǐn)?shù)4%；3）改變WPI質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9 g/100 mL，固定均質(zhì)壓力16000 psi、均質(zhì)循環(huán)6 次、大豆油體積分?jǐn)?shù)4%；4）改變大豆油體積分?jǐn)?shù)為2%、6%、10%、14%、18%，固定均質(zhì)壓力16000 psi、均質(zhì)循環(huán)6 次、WPI質(zhì)量濃度5 g/100 mL。

1.3.9.3 pH值、鹽離子濃度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

用1.3.9.2節(jié)得出的單因素條件制備原始蛋白和改性蛋白穩(wěn)定的納米乳液，考察不同pH值、鹽離子濃度對(duì)乳液粒徑的變化。

pH值對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響：用NaOH和HCl溶液將乳液調(diào)至不同pH值梯度（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）后，測(cè)定乳液粒徑及其PDI。

鹽離子濃度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響：分別配制一定濃度的WPI以及糖基化WPI溶液，向其中添加NaCl，使溶液中NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，分別測(cè)量不同NaCl濃度下的乳液粒徑及其PDI。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 A294nm和褐變程度的分析

美拉德反應(yīng)中間階段常用294 nm波長(zhǎng)處吸光度表示，而A420nm是最終產(chǎn)物的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，WPI與RBP的接枝反應(yīng)會(huì)發(fā)生顏色的褐變，其褐變與美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度呈正相關(guān)[38]。如圖1所示，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，WPI-RBP接枝物在294 nm和420 nm波長(zhǎng)處的吸光度均顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明體系發(fā)生了美拉德反應(yīng)，在干熱處理過(guò)程中，WPI的結(jié)構(gòu)部分展開，蛋白質(zhì)的ε-氨基與RBP的羰基受熱結(jié)合在一起，生成了中間產(chǎn)物；同時(shí)，部分中間產(chǎn)物發(fā)生凝聚聚合生成類黑素，使蛋白的褐變程度上升[39]。

圖1 WPI及WPI-RBP接枝物反應(yīng)體系A(chǔ)294nm及A420nm變化Fig.1 Changes in the absorbance of MRPs at 294 and 420 nm with reaction time

2.2 色澤變化

WPI和RBP美拉德反應(yīng)產(chǎn)物隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色變化如圖2所示，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，WPIL*值由87.75逐漸減小，反應(yīng)18 h后降低到63.46；WPIa*值顯著提高（P＜0.05），由原始的2.97逐漸變大到10.63；b*值由原始的16.09逐漸增加到25.20；ΔE值也顯著提高到45.65，說(shuō)明顏色逐漸變暗，紅色與黃色逐漸加深，與原始蛋白的色差隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越大，這表明美拉德反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，WPI與RBP間的糖基化程度越高，顏色變化越明顯。與此結(jié)果類似的是，王晨瑩[40]研究表明蛋清蛋白與低聚異麥芽糖的反應(yīng)隨美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，與原始蛋清蛋白的色差越大。

圖2 WPI及WPI-RBP接枝物反應(yīng)體系色差分析Fig.2 Change in the color difference of MRPs with reaction time

2.3 游離氨基含量的測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，蛋白質(zhì)的游離氨基含量呈先減小后增大的趨勢(shì)，這與王麒等[41]的研究相符。由于美拉德反應(yīng)初期，WPI結(jié)構(gòu)部分展開，WPI與RBP受熱后逐步結(jié)合，游離氨基含量下降，但進(jìn)一步加熱時(shí)，WPI中的部分賴氨酸會(huì)被破壞，另外加熱也會(huì)使WPI蛋白結(jié)構(gòu)充分延展，蛋白分子之間的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝聚，接枝概率下降，不利于WPI和RBP之間接技反應(yīng)的進(jìn)行，最終反而導(dǎo)致接枝度降低，游離氨基含量升高。陳又銘等[42]研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白與菊粉的干熱反應(yīng)中，隨美拉德反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)，接枝度先增后減。美拉德反應(yīng)中接枝度的增加代表著游離氨基含量的減少，楊旭等[43]對(duì)茶渣蛋白的糖基化改性也得出同樣的結(jié)論。

圖3 WPI及WPI-RBP接枝物游離氨基含量Fig.3 Change in the free amino acid content of MRPs with reaction time

2.4 SDS-PAGE結(jié)果

由圖4 可知，泳道2 中乳清蛋白的分子質(zhì)量為15 kDa，反應(yīng)6、12、18 h的蛋白分子質(zhì)量分別為17.3、17.0、16.9 kDa，與原WPI相比平均增加2.1 kDa，這是因?yàn)镽BP的糖鏈接枝到WPI上，增加了WPI的分子質(zhì)量。同時(shí)可以看到美拉德反應(yīng)后的蛋白樣品條帶顏色變淡，這也是蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)后的一個(gè)顯著特征，這進(jìn)一步驗(yàn)證，經(jīng)干熱處理，WPI與RBP確實(shí)發(fā)生了以共價(jià)鍵形式結(jié)合為基礎(chǔ)的接枝反應(yīng)，生成了分子質(zhì)量較大的物質(zhì)。

圖4 WPI及WPI-RBP接枝物SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE profiles of WPI before and after glycation

2.5 乳化性能測(cè)定結(jié)果

如圖5所示，隨干熱時(shí)間的延長(zhǎng)，WPI-RBP共聚物的乳化性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），加熱處理18 h的WPI-RBP糖基化產(chǎn)物EAI由初始值87.86 m2/g增加至422.29 m2/g；與原WPI相比WPI-RBP接枝物ESI值增加了86%，這均表明，糖基化反應(yīng)顯著改善了WPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性（P＜0.05），可能的原因有兩個(gè)：一方面RBP接枝到蛋白上后，帶來(lái)的空間位阻效應(yīng)能使得接枝物更加緊密地吸附在油-水界面上，形成致密的界面膜，從而提高WPI的乳化活性；另一方面加熱使WPI的疏水基團(tuán)暴露，提高了其乳化性[44]。孫煒煒[45]用葡聚糖（分子質(zhì)量分別為67、150 kDa）對(duì)WPI糖基化改性，與WPI相比，WPI-G67和WPI-G150的EAI分別提高43.2%和52.7%，ESI分別提高18.96%和27.52%，且WPI-G150的EAI和ESI都比WPI-G67大。這是因?yàn)槎嗵堑姆肿淤|(zhì)量越大，與WPI改性結(jié)合后吸附在油滴的吸附層更厚，因此具有更佳的乳化性能[30-31]，此外，多糖的分子質(zhì)量大，也能夠提供更大的空間位阻阻止油滴聚集，提高WPI乳化性[46]。而RBP是大分子多糖，與WPI美拉德反應(yīng)改性后的蛋白與其他單糖和多糖相比具有更好的乳化性。Li Yue等[47]也得出同樣的結(jié)論，其研究的葡萄糖和葡聚糖對(duì)糖基化大米蛋白乳化特性的影響，結(jié)果表明葡聚糖的乳化性能顯著高于葡萄糖（P＜0.05）。

圖5 WPI及WPI-RBP接枝物的EAI（A）和ESI（B）Fig.5 EAI (A) and ESI (B) of WPI and WPI-RBP conjugates with different reaction times

2.6 SEM分析

由圖6可知，WPI的表面結(jié)構(gòu)與其接枝物明顯不同，WPI是典型的球蛋白，其呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)且表面較為光滑；而接枝物以混亂的聚集團(tuán)狀結(jié)構(gòu)形式出現(xiàn)，這可能是由于WPI與RBP糖分子共價(jià)結(jié)合后，WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子充分伸展開來(lái)，RBP糖分子結(jié)合在蛋白分子表面，導(dǎo)致WPI蛋白分子球狀結(jié)構(gòu)的喪失。

圖6 WPI及WPI-RBP接枝物SEM圖譜Fig.6 SEM images of WPI and WPI-RBP conjugates with different reaction times

2.7 粒徑分析

從圖7可以看出，WPI@（WPI制備的納米乳液）及WPI-RBP@（WPI-RBP改性制備的納米乳液）的粒徑大小依次為WPI-RBP（6 h）@＜WPI-RBP（12 h）@＜WPI@＜WPI-RBP（18 h）@，蛋白在糖基化反應(yīng)18 h后粒徑顯著增加，隨著美拉德干熱反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白的熱聚集程度增大，WPI蛋白聚集產(chǎn)生粒徑較大的顆粒，這進(jìn)一步驗(yàn)證了2.6節(jié)的結(jié)論，且WPI@和WPI-RBP（18 h）@還呈現(xiàn)一些小峰，粒徑分布不均勻，這是因?yàn)殡S著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，WPI的溶解度上升，對(duì)水的吸附能力增強(qiáng)，因此粒徑變?。坏S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，WPI分子的疏水基團(tuán)暴露，溶解度下降，粒徑變大。

圖7 WPI@及WPI-RBP@接枝物粒徑分布Fig.7 Particle size distribution of WPI@ and WPI-RBP@ conjugates

2.8 納米乳液穩(wěn)定性分析

從圖8可知，隨均質(zhì)次數(shù)的增加，粒徑和PDI呈先減小后增大的趨勢(shì)，均質(zhì)6 次測(cè)得的粒徑和PDI較小，這是因?yàn)樵诰|(zhì)過(guò)程中隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，乳液的粒徑會(huì)更小，粒徑分布更均勻，乳液分散的更穩(wěn)定，但隨著均質(zhì)次數(shù)的繼續(xù)增加，粒徑又會(huì)有增加的趨勢(shì)，乳液變得不穩(wěn)定，可能是因?yàn)榫|(zhì)次數(shù)增加，導(dǎo)致乳液溫度升高，打破了已形成的乳液體系，乳液失穩(wěn)；隨壓力的增加，粒徑和PDI呈下降的趨勢(shì)，在壓力為16000 psi時(shí)，乳液粒徑和PDI最小，考慮到均質(zhì)機(jī)在壓力過(guò)大時(shí)由于自我保護(hù)會(huì)暫停，且壓力過(guò)大時(shí)，溫度會(huì)隨之升高，會(huì)造成油脂的氧化，因此選擇均質(zhì)壓力為16000 psi；隨WPI質(zhì)量濃度的增加，乳液粒徑和PDI呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在WPI質(zhì)量濃度為5 g/100 mL時(shí)粒徑和PDI最小，WPI質(zhì)量濃度低時(shí)，蛋白不足以完全包裹住油滴，使油滴聚集，粒徑增大，當(dāng)WPI質(zhì)量濃度高時(shí)，又會(huì)使蛋白質(zhì)之間會(huì)發(fā)生聚集，使粒徑增大；隨油相含量增加，粒徑和PDI呈上升趨勢(shì)，此時(shí)蛋白質(zhì)不足以完全包裹大豆油，使大豆油聚集，粒徑增大。由此得出制備納米乳液的條件為均質(zhì)6 次、均質(zhì)壓力16000 psi、WPI質(zhì)量濃度5 g/100 mL、大豆油體積分?jǐn)?shù)6%。該條件制備的納米乳液符合實(shí)驗(yàn)需求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 均質(zhì)次數(shù)（A）、壓力（B）、WPI質(zhì)量濃度（C）和大豆油體積分?jǐn)?shù)（D）對(duì)納米乳液粒徑和PDI的影響Fig.8 Effects of number of homogenization cycles (A),pressure (B),WPI concentration (C) and oil phase concentration (D) on particle size and PDI of nanoemulsion

如圖9A所示，納米乳液WPI-RBP（12 h）@在不同pH值存在條件下粒徑小于納米乳液WPI@，說(shuō)明納米乳液WPI-RBP（12 h）@的pH值穩(wěn)定性顯著優(yōu)于納米乳液WPI@，WPI@在pH 5時(shí)的粒徑為700 nm左右，PDI達(dá)到0.367，乳液接近失衡，而WPI-RBP（12 h）@粒徑恒定維持在200 nm左右，展現(xiàn)了其耐酸的功能特性，這是因?yàn)閃PI的等電點(diǎn)在5左右，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)的表面凈電荷為0，WPI因失去靜電斥力作用，分子間作用力減弱，蛋白質(zhì)會(huì)絮凝、沉淀，而改性WPI-RBP在等電點(diǎn)處的靜電斥力增強(qiáng)，蛋白分散較為均勻，提升了納米乳液的耐酸穩(wěn)定性。納米乳液WPI-RBP（12 h）@在pH 4時(shí)粒徑上升至335 nm，這是因?yàn)槊览路磻?yīng)后WPI等電點(diǎn)偏移到4左右，但PDI僅為0.251，說(shuō)明納米乳液均一性較好，且其粒徑和PDI仍顯著低于WPI@的粒徑和PDI，表明改性后的WPI共價(jià)接入RBP糖鏈后，親水性提高，阻止了蛋白的聚集，提升了納米乳液耐酸功能特性。

納米乳液的穩(wěn)定性的影響因素除了pH值外，鹽離子濃度也是重要因素之一[48]。如圖9B所示，鹽離子濃度對(duì)納米乳液粒徑的影響與未改性的納米乳液WPI@相比，納米乳液WPI-RBP（12 h）@相對(duì)穩(wěn)定，PDI在0.2左右，說(shuō)明其粒徑分散均勻；在NaCl濃度為0.5 mol/L時(shí)，WPI@粒徑相比WPI-RBP（12 h）@增加了19%，PDI接近0.3，WPI在鹽離子存在下由于鹽析作用會(huì)發(fā)生沉淀，而WPIRBP糖基化改性后蛋白質(zhì)在一定程度上能夠抵抗鹽離子對(duì)體系的影響，提高了乳液的鹽離子穩(wěn)定性。

圖9 pH值（A）和鹽離子濃度（B）對(duì)納米乳液粒徑的影響Fig.9 Effects of pH (A) and salt ion concentration (B) on particle size of nanoemulsion

上述結(jié)論表明，本研究對(duì)WPI采用美拉德反應(yīng)方式改性，顯著提升了WPI-RBP@納米乳液的耐酸耐鹽功能特性，可進(jìn)一步提升該納米乳液體內(nèi)消化穩(wěn)定性，有助于遞送脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的口服吸收研究，拓展該納米乳液應(yīng)用領(lǐng)域。

3 結(jié)論

通過(guò)干熱法調(diào)控WPI與RBP發(fā)生美拉德反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)WPI修飾改性，探究反應(yīng)時(shí)間對(duì)其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。通過(guò)分析A294nm和褐變程度、色澤變化及游離氨基含量的變化，調(diào)控混合體系發(fā)生美拉德反應(yīng)的程度；采用SDS-PAGE分析WPI美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分子質(zhì)量的變化，接枝后蛋白分子質(zhì)量比WPI分子質(zhì)量增加2.1 kDa；美拉德反應(yīng)時(shí)間12 h后的產(chǎn)物顯著提高了WPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，其制備納米乳液粒徑相對(duì)較小且分布均勻；納米乳液WPI-RBP（12 h）@比納米乳液WPI@粒徑小且穩(wěn)定，能抵抗酸性條件下和鹽離子存在條件下對(duì)乳液的不利影響，有助于遞送脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的口服吸收。因此，WPI和RBP之間的美拉德反應(yīng)為改善WPI功能性開辟了一條新的途徑，糖基化WPI-RBP產(chǎn)物可作為一種新型的乳化劑用于包載疏水性物質(zhì)，同時(shí)可加強(qiáng)對(duì)米糠資源的綜合利用研究，提高米糠的利用率，對(duì)深入研究和開發(fā)米糠資源意義重大。