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        大豆蛋白-黃芩素的結(jié)合機(jī)制及蛋白構(gòu)象和功能變化

        2023-03-06 12:48:56閆馨月賈亦佳孫詩艷張東蒙耿夢潔楊晉杰StanislavSUKHIKHOlgaBABICH齊寶坤
        食品科學(xué) 2023年4期

        閆馨月,賈亦佳,孫詩艷,張東蒙,耿夢潔,,楊晉杰,,Stanislav SUKHIKH,Olga BABICH,齊寶坤,3,*,李 楊,3,*

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.康德波羅的海聯(lián)邦大學(xué)生命系統(tǒng)學(xué)院,俄羅斯 加里寧格勒 236016;3.國家大豆工程技術(shù)研究中心,黑龍江 哈爾濱 150050)

        大豆蛋白是日常膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源,由2S、7S、11S和15S這4 類蛋白質(zhì)組成,其中β-伴大豆蛋白(7S)和大豆蛋白(11S)是大豆蛋白質(zhì)的2 種主要成分,分別占總質(zhì)量的40%和30%[1]。7S組分由α(71 kDa)、α’(67 kDa)和β(50 kDa)亞基通過氫鍵和疏水相互作用堆積而成,11S組分由酸性亞基(37~42 kDa)和堿性亞基(17~20 kDa)通過疏水鍵和二硫鍵連接組成[2]。先前研究表明,7S組分決定大豆蛋白的乳化和起泡能力,11S組分決定大豆蛋白的凝膠性能[3]。這表明不同組分蛋白由于其功能性的差異可以在食品加工中發(fā)揮不同作用[4]。

        黃芩素是從高黃芩根部提取的天然黃酮類化合物,具有抗菌、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化等功效,但由于其水溶性和穩(wěn)定性較差,生物利用度低等問題,其應(yīng)用始終受限。因此,國內(nèi)外學(xué)者不斷運用新型的制劑手段,挖掘不同的搭載材料,以開發(fā)出有實際應(yīng)用價值的黃芩素制劑[5]。

        近年來,隨著對功能性復(fù)合食品體系的需求增加,蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用越來越受到關(guān)注。據(jù)報道,蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合既能改善蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)[6],同時也能提高多酚的生物可及性和生物利用度。研究證明,多酚通過非共價和(或)共價相互作用對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的結(jié)合親和力[7]。Ye Jiangping等[8]發(fā)現(xiàn)蘆丁與大豆分離蛋白以疏水作用力結(jié)合,復(fù)合物乳液具有良好的物理穩(wěn)定性。扁豆蛋白與多酚的非共價相互作用對蛋白的熱穩(wěn)定性以及氧化活性有顯著提升[9]。在大豆蛋白素肉加工過程中添加不同含量的茶多酚可優(yōu)化產(chǎn)品的色澤、質(zhì)構(gòu)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性[10]。蛋白質(zhì)作為多酚的穩(wěn)定劑和載體,可保護(hù)它們在胃腸消化過程中免受酶促和氧化降解,并將其輸送到小腸和結(jié)腸[3]。隨著對蛋白-多酚復(fù)合物的深入研究,越來越多的酚類化合物作為生物活性物質(zhì)或改性材料應(yīng)用到工業(yè)食品生產(chǎn)中。

        本研究選取7S、11S蛋白與黃芩素作為研究對象,利用多光譜技術(shù)和分子對接探究大豆蛋白-多酚的結(jié)合機(jī)制以及結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)一步測定復(fù)合物的穩(wěn)定性和功能特性。通過實驗和理論相結(jié)合的方法,闡明7S、11S與黃芩素的相互作用機(jī)理。本研究有助于提升大豆蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中的功能性,同時可以促進(jìn)黃芩素作為口服營養(yǎng)成分的應(yīng)用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        脫脂豆粉 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所;黃芩素上海源葉生物科技有限公司;8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS) 美國Sigma-Aldrich公司;HCl、NaOH(均為分析純) 北京新光化學(xué)試劑廠。

        1.2 儀器與設(shè)備

        GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司;電子分析天平、F-6000熒光分光光度計 日本島津公司;FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司;MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器股份有限公司;Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司;TGA/SDTA851e差熱分析儀 瑞士梅特勒-托利多公司;T18basic高速乳化均質(zhì)機(jī) 英國IKS公司;TM3000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

        1.3 方法

        1.3.1 7S、11S蛋白組分以及大豆蛋白-黃芩素復(fù)合物的制備

        參照Liu Chun等[11]的方法,并略作修改。脫脂豆粉溶解于去離子水,料液比為1∶15(g/mL),用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0,低速攪拌1 h,4 ℃、9000×g離心30 min,收集上清液。重新溶解沉淀,調(diào)節(jié)pH值至9.0,低速攪拌1 h,相同條件下離心并混合上清液。添加0.01 mol/L NaHSO3溶液,用2 mo1/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4,4 ℃貯藏過夜。取溶液于4 ℃、6500×g離心20 min,水洗沉淀3 次,用去離子水溶解后調(diào)節(jié)pH值至7.5,凍干后可得11S蛋白組分。向上述上清液中加入NaCl至離子濃度為0.25 mo1/L,用2 mo1/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.4,4 ℃、9000×g離心30 min。取上清液,加入等體積去離子水,用HC1溶液調(diào)節(jié)pH值至4.8,4 ℃、6500×g再次離心20 min。取沉淀,水洗3 次后用去離子水溶解,調(diào)節(jié)pH值至7.5,凍干后可得7S蛋白組分。

        稱取一定質(zhì)量黃芩素溶解于甲醇溶液中作為母液,質(zhì)量濃度為10 mg/mL,置于-20 ℃保存。混合前使用Tris-HCl緩沖液將母液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將7S和11S蛋白組分分別溶解在Tris-HCl緩沖液中,質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。將蛋白與多酚溶液混合,室溫下低速攪拌30 min。使用3000 Da分子質(zhì)量的截止膜將混合液在去離子水中透析48 h,冷凍干燥后獲得7S-黃芩素、11S-黃芩素復(fù)合粉末。

        1.3.2 傅里葉變換紅外光譜測定

        測定前取1.5 mg樣品與200 mg溴化鉀研磨混勻并壓片。波數(shù)范圍4000~400 cm-1,掃描次數(shù)64,分辨率4 cm-1,得到的紅外光譜曲線用Peak Fitting軟件擬合,分析復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)含量的變化[12]。

        1.3.3 內(nèi)源熒光光譜測定

        參照Liu Yan 等[13]的方法,并略作修改。采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將7S、11S樣品溶解,使其質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL。分別加入與蛋白溶液等量的不同濃度黃芩素溶液,使復(fù)合溶液中黃芩素的最終濃度為0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 μmol/L,用熒光分光光度計掃描。設(shè)定發(fā)射波長300~450 nm,激發(fā)波長275 nm,狹縫寬度5.0 nm,掃描速率2000 nm/min。

        1.3.4 熒光猝滅和相互作用方式

        通過Stern-Volmer方程(式(1))判斷黃芩素與7S、11S蛋白的猝滅類型[14]:

        式中:F0為未添加黃芩素時的熒光強(qiáng)度;F為添加黃芩素時的熒光強(qiáng)度;[Q]為黃芩素濃度/(mol/L);Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/(L/(mol·s));τ0為未添加猝滅劑時熒光分子的平均熒光壽命,一般為10-8s。

        根據(jù)靜態(tài)猝滅公式,計算表觀結(jié)合常數(shù)(Ks)(L/mol)和結(jié)合位點數(shù)(n)[14]:

        通過Van’t Hoff方程(式(3)),判斷黃芩素與7S、11S蛋白的相互作用方式[14]:

        式中:R為氣體常數(shù)8.314;ΔH為焓變值/(kJ/mol);ΔS為熵變值/(J/(m o l·K));ΔG為自由能值/(kJ/mol);T為溫度/K。

        1.3.5 分子對接分析

        采用Discovery Studio 2019(DS)軟件中Libdock算法進(jìn)行分子對接。從Chemicalize數(shù)據(jù)庫下載7S與11S的3D結(jié)構(gòu)。將受體(7S、11S)和配體(黃芩素)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到DS軟件中,在CHARMM力場下優(yōu)化其結(jié)構(gòu)并調(diào)整其質(zhì)子化狀態(tài)。使用DS 2019可視7S/11S-黃芩素的相互作用。

        1.3.6 掃描電子顯微鏡分析

        將凍干樣品粉末使用掃描電子顯微鏡在5.0 kV加速電壓下測定,放大倍數(shù)1500倍。

        1.3.7 表面疏水性測定

        參照He Shudong等[15]的方法,并略作修改。將20 mg樣品溶于10 mL PBS(10 mmol/L,pH 7.2)中,然后稀釋獲得0.005~2 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液,暗處反應(yīng)30 min。以添加ANS的PBS作為空白對照。用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度,激發(fā)和發(fā)射波長分別為380 nm和480 nm,縫隙為5 nm,樣品的表面疏水性表示為蛋白質(zhì)濃度相對于熒光強(qiáng)度的線性方程式的斜率。

        1.3.8 熱穩(wěn)定性測定

        用差示掃描量熱法測定熱穩(wěn)定性[16]。將少量樣品移到鋁制坩堝中,然后將其置于氧氣流量為100 mL/min的反應(yīng)爐中,保護(hù)氣體N2,氣體流速20 mL/min,溫度范圍25~125 ℃,升溫速率10 ℃/min。

        1.3.9 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

        參照Pearce等[17]的方法,并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,取15 mL樣品溶液與5 mL大豆油混合,用高速乳化均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(12000 r/min,2 min)。乳化后的樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100 倍并混合均勻,于500 nm波長處測定吸光度,記為A0;靜置10 min后測定吸光度,記為A10;十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照。按式(4)、(5)計算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsifying stability index,ESI):

        式(4)、(5)中:ρ為樣品質(zhì)量濃度/(g/mL);Φ為乳化液中油相的比例,Φ=0.25;L為比色皿的光徑;N為稀釋倍數(shù);T為乳液靜置時間,10 min。

        1.3.10 起泡性(foaming capacity,F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foam stability,F(xiàn)S)測定

        參照Sui Xiaonan等[18]的方法,并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,取100 mL樣品溶液置于500 mL量筒(直徑6 cm,高度20 cm),使用高速乳化均質(zhì)器處理樣品(12000 r/min,2 min)。按式(6)、(7)計算FC和FS:

        式(6)、(7)中:V為初始溶液的高度/cm;V0為均質(zhì)后泡沫表面的高度/cm;V10為第10分鐘泡沫表面的高度/cm。

        1.3.11 抗氧化活性測定

        1.3.11.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率測定

        參考Sun Yufan等[19]的方法,并略作修改。稱取3.5 mg DPPH,用甲醇定容至10 mL,獲得DPPH自由基原始溶液。每次使用前將溶液稀釋,獲得DPPH自由基實驗溶液。測定時,采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,再將該溶液用甲醇稀釋至合適濃度,與適量DPPH自由基實驗溶液混勻,避光靜置30 min,在517 nm波長處測定吸光度(A3)。以純?nèi)芤簽闃悠穼φ战M(A2),DPPH自由基-甲醇為空白組(A1),甲醇為空白對照組(A0)分別測定吸光度。按式(8)計算DPPH自由基清除率:

        1.3.11.2 2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基清除率測定

        參考Sun Yufan等[19]的方法,并略作修改。采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,取0.5 mL樣品溶液加入4 mL ABTS陽離子自由基工作液,避光靜置50 min,在734 nm波長處測定吸光度(A3)。以純?nèi)芤簽闃悠穼φ战M(A2),ABTS陽離子自由基-甲醇為空白組(A1),甲醇為空白對照組(A0)分別測定吸光度。按式(9)計算ABTS陽離子自由基清除率:

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        2 結(jié)果與分析

        2.1 7S、11S-黃芩素復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜分析

        由圖1A可知,黃芩素在400~1700 cm-1處有多個特征峰。與7S、11S復(fù)合后,限制了多酚的伸縮振動,導(dǎo)致其特征官能團(tuán)對應(yīng)的吸收峰消失,表明黃芩素被成功封裝在蛋白中[20]。酰胺A帶(3200~3400 cm-1)代表N—H和O—H的伸縮振動。7S組分在此處的吸收峰強(qiáng)度高于11S組分,表明7S肽鏈上的氫原子更容易參與到交聯(lián)反應(yīng)中,因此7S蛋白的結(jié)構(gòu)更加靈活。加入黃芩素后,酰胺A帶的峰強(qiáng)度變化明顯,說明多酚與蛋白可以通過分子間氫鍵連接[21]。2960 cm-1處的特征峰與C—H伸縮振動有關(guān)。復(fù)合物在此處的峰強(qiáng)度高于單一蛋白,表示蛋白與黃芩素的結(jié)合存在疏水性作用力。酰胺I、II帶位于1500~1700 cm-1處,此處的變化與C=O、C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動有關(guān)。因此,多酚的添加改變了蛋白質(zhì)吸收峰的強(qiáng)度及寬度,通過計算峰面積可知,該變化與β-折疊的減少有關(guān)(圖1B)。推測維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的β-折疊在黃芩素的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和無規(guī)卷曲。Liu Xiangju等[14]在研究不同膳食多酚對蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的構(gòu)象變化時也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。

        圖1 7S、11S及其復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜(A)和二級結(jié)構(gòu)(B)Fig.1 FT-IR spectra (A) and secondary structures (B) of 7S,11S and their complexes with baicalein

        2.2 7S、11S-黃芩素復(fù)合物的內(nèi)源熒光光譜分析

        由圖2可知,11S的熒光強(qiáng)度高于7S,說明11S蛋白表面存在更多的發(fā)色基團(tuán)參與水合作用。隨著不同濃度黃芩素的加入,7S和11S的熒光強(qiáng)度都逐漸降低。該現(xiàn)象表明黃芩素以劑量依賴性方式導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光猝滅[22]。多酚的添加使蛋白質(zhì)的最大發(fā)射波長向短波長方向移動。推測是由于黃芩素與蛋白質(zhì)的相互作用導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基周圍的微環(huán)境極性減弱,發(fā)色基團(tuán)處于更疏水的環(huán)境,表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更緊密。11S-黃芩素的熒光光譜藍(lán)移明顯,這可能與11S蛋白的結(jié)構(gòu)較為疏松,更容易被多酚誘導(dǎo)產(chǎn)生構(gòu)象變化有關(guān)。

        圖2 不同黃芩素添加量的7S-黃芩素復(fù)合物(A)和11S-黃芩素復(fù)合物(B)熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of 7S-(A) and 11S-baicalein complexes (B)with different amounts of added baicalein

        2.3 7S、11S蛋白與黃芩素結(jié)合的熒光猝滅機(jī)制

        熒光猝滅根據(jù)機(jī)理可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[23]。根據(jù)Stern-Volmer方程[24],以[Q]為橫坐標(biāo),F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo),可擬合出一次函數(shù)方程,通過直線斜率可求得復(fù)合物的Kq值。由圖2可知,7S、11S-黃芩素的Stern-Volmer方程線性擬合良好,表明黃芩素的猝滅方式為靜態(tài)或動態(tài)猝滅,不存在動-靜混合猝滅。由表1可知,所有樣品中,Kq的最小值為3.79×1016L/(mol·s),大于動態(tài)猝滅常數(shù)(2×1010L/(mol·s)),說明此過程為靜態(tài)猝滅。

        根據(jù)靜態(tài)猝滅公式,以lg[Q]為橫坐標(biāo),lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)作圖,可得一次函數(shù)方程,由此得出Ks與n值。由表1可知,溫度為310 K時,11S-黃芩素的Ks值最大(1.70×106L/mol),高Ks值表明此溫度下蛋白質(zhì)與多酚之間的結(jié)合有較弱的空間位阻和較強(qiáng)的相互作用。7S-黃芩素的Ks值整體小于11S-黃芩素(除276 K外),推測是由于7S蛋白結(jié)構(gòu)致密,活性氨基酸殘基沒有暴露,阻礙了蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用。所有樣品的n值均大于1,表明7S/11S與黃芩素至少有一個結(jié)合位點[20]。

        表1 黃芩素與7S和11S結(jié)合的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constants,binding constants and thermodynamic parameters for baicalein binding to 7S and 11S

        2.4 7S、11S蛋白與黃芩素結(jié)合的相互作用方式

        蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合主要涉及非共價作用力。通過Van’t Hoff方程計算相應(yīng)的ΔH、ΔS、ΔG,以此判斷兩者的相互作用方式[25]。選取276、298 K和310 K,測定不同溫度下的結(jié)合常數(shù)。如表1所示,7S、11S-黃芩素的ΔG絕對值較小,推測蛋白與多酚的結(jié)合僅涉及較弱的作用力。7S-黃芩素的ΔH<0、ΔS<0,表明7S與黃芩素的相互作用方式為氫鍵和范德華力。11S-黃芩素的ΔH>0、ΔS>0,說明11S與黃芩素結(jié)合時的主要作用力是疏水相互作用。原因可能是11S分子表面存在較多的疏水基團(tuán),更容易與配體的疏水區(qū)域(如苯環(huán))結(jié)合[26]。

        2.5 7S、11S蛋白與黃芩素的分子對接分析

        通過分子對接可以預(yù)測黃芩素對7S和11S蛋白的精確結(jié)合位點和結(jié)合模式。由圖3可知,黃芩素A5和A7位置上的羥基氧分別與7S蛋白中Arg188(2.22 ?)和Gln365(2.36 ?)的氨基發(fā)生氫鍵相互作用。A5和A6位置的羥基作為氫供體分別與Glu367(2.75 ?)和Arg364(2.51 ?)的氧原子結(jié)合。此外,黃芩素的苯環(huán)(A環(huán)和C環(huán))也可以與7S蛋白的Arg329(4.74 ?)和Ile330(5.36 ?)構(gòu)成疏水相互作用。由于7S-黃芩素的疏水相互作用較弱且數(shù)量較少,因此兩者的結(jié)合主要依靠氫鍵。不同于7S蛋白的親水性,11S表面擁有大量的疏水性氨基酸。因此,11S蛋白與多酚的結(jié)合通常依賴于疏水性作用力。包括A環(huán)與Val162(5.26 ?),B環(huán)與Met177(5.24 ?)和Arg161(5.41 ?)以及C環(huán)與Arg161(5.28 ?)和Ile171(5.18 ?)。此外,C4位置的羰基氧能與His173以氫鍵結(jié)合。結(jié)合和對接分?jǐn)?shù)可以進(jìn)一步反映7S、11S蛋白與黃芩素的結(jié)合親和力。結(jié)合能絕對值或?qū)臃謹(jǐn)?shù)越高證明親和力越強(qiáng)[27]。由表1、2可知,結(jié)合能的理論值與熒光猝滅的分析結(jié)果存在一定差異,但變化趨勢一致。

        圖3 黃芩素與7S(A)和11S(B)的結(jié)合模式Fig.3 Binding patterns of baicalein with 7S (A) and 11S (B)

        表2 黃芩素與7S和11S結(jié)合的能量及評分Table 2 Energy and score of baicalein binding to 7S and 11S

        2.6 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的掃描電子顯微鏡分析

        由圖4可知,7S蛋白具有片狀及球形結(jié)構(gòu),11S蛋白既有片層狀結(jié)構(gòu)也有較大的塊狀結(jié)構(gòu)。這與不同蛋白的亞基數(shù)量及結(jié)構(gòu)柔性有關(guān),11S蛋白結(jié)構(gòu)呈剛性,導(dǎo)致其溶解性較差。因此,11S蛋白的微觀結(jié)構(gòu)圖中出現(xiàn)較多塊狀聚集體。加入黃芩素后,7S蛋白的聚集性增強(qiáng)。此外,由于復(fù)合物分子間的非共價相互作用導(dǎo)致未折疊和柔性蛋白質(zhì)經(jīng)歷部分重折疊過程,形成更多的球形結(jié)構(gòu)。11S蛋白的結(jié)構(gòu)柔性較弱,添加黃芩素后并未出現(xiàn)明顯的構(gòu)象變化,但同樣會使部分原始結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐位驐U狀結(jié)構(gòu)。

        圖4 7S、11S及其復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of 7S,11S and their complexes with baicalein

        2.7 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的表面疏水性分析

        由表3可知,與7S相比,11S的表面疏水性較大。有研究表明,中性pH值條件下11S蛋白酸性亞基呈親水性,堿性亞基呈疏水性;7S蛋白的α和α’亞基呈親水性,β亞基呈疏水性。但7S蛋白分子中含有N-糖鏈,因此整體親水性高于11S蛋白[5]。加入黃芩素后,7S和11S的表面疏水性都降低。原因有兩點:1)添加黃芩素引入了親水性羧基,導(dǎo)致復(fù)合物整體的疏水性下降;2)黃芩素誘導(dǎo)蛋白的構(gòu)象變化,芳香族基團(tuán)被掩埋,使疏水性亞基數(shù)量減少。Ren Cong等[28]研究花青素與蛋白的結(jié)合作用時也有類似的結(jié)果。

        表3 7S、11S及其與黃芩素復(fù)合物的功能特性Table 3 Functional properties of 7S,11S and their complexes with baicalein

        2.8 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析

        由表3可知,7S、11S蛋白的變性溫度(Td)分別為77.76 ℃和75.00 ℃,變性焓(ΔH)分別為-52.79 J/g和-63.08 J/g,溫度與焓值的差異歸因于蛋白的亞基數(shù)量和構(gòu)象靈活性。7S蛋白主要由α、α’和β亞基組成,結(jié)構(gòu)柔性大;11S蛋白由6 個酸性亞基和5 個堿性亞基組成,結(jié)構(gòu)剛性大[5]。因此,11S蛋白的變性需要更多能量。添加多酚后,蛋白的Td降低而ΔH的絕對值提高,原因可能是蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵與巰基相互交換,導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)改變,從而增加變性難度[28]。

        2.9 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

        如表3所示,7S與11S的EAI值分別為10.52 m2/g和7.25 m2/g。研究表明,EAI與蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的靈活性密切相關(guān)[29]。由于11S蛋白的分子內(nèi)二硫鍵較多,亞基締合結(jié)構(gòu)致密,相比于7S蛋白,不僅分子質(zhì)量大而且具有更加剛性的空間構(gòu)象。結(jié)構(gòu)的靈活性較差導(dǎo)致11S蛋白分子移動至油水界面的速度緩慢,因此其EAI值較低。黃芩素的添加提高了蛋白的乳化活性,推測是由于多酚與蛋白質(zhì)相互作用,導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象更加靈活。柔性結(jié)構(gòu)加快了乳液中蛋白分子在油水界面的重排速度,因此EAI值增大。

        乳化穩(wěn)定性是指油-水界面聚集并穩(wěn)定小液滴的能力[30]。由表3可知,11S蛋白的乳化穩(wěn)定性優(yōu)于7S蛋白。推測該現(xiàn)象與11S蛋白的表面疏水性有關(guān)。由于11S蛋白分子更易聚集,其不溶性聚集體能夠在油水界面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),抑制油滴的聚攏。因此,11S蛋白擁有較高的ESI值。Tang Chuanhe[31]構(gòu)建了7S與11S蛋白于油水界面處的吸附行為模型,也得出了類似結(jié)論。加入多酚使蛋白質(zhì)的ESI值提高,歸因于復(fù)合物具有較強(qiáng)的分子間和分子內(nèi)作用力,形成了更加剛性且有序的界面膜。因此,復(fù)合物乳液比純蛋白乳液具有更高的乳化穩(wěn)定性。

        2.10 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的FC及FS

        蛋白的FC是指蛋白溶液在攪打過程中產(chǎn)生泡沫的能力,受電荷密度、分子大小以及疏水性等因素影響[32]。由表3可知,7S蛋白的FC值較高,歸因于7S蛋白分子在空氣-水界面處的張力較小、界面儲存模量較大。加入黃芩素后,蛋白的FC值提高。推測是由于復(fù)合物結(jié)構(gòu)的柔性增強(qiáng),更容易被吸附到空氣-水界面上,降低了界面的表面張力[33]。FS是指蛋白具有足夠的黏度以維持結(jié)構(gòu)并防止破裂和聚結(jié)的能力[32]。觀察到FS值的變化趨勢與FC值相同。表明7S蛋白在空氣-水界面處更易形成具有較大黏性和彈性的薄膜。加入多酚后,蛋白的FS值增大。原因可能是界面吸附的蛋白含量增加,導(dǎo)致泡沫表面膜黏性提高,有效降低液體析出,更有利于泡沫的穩(wěn)定。

        2.11 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物抗氧化活性

        由表3可知,7S蛋白的DPPH自由基清除能力高于11S蛋白,這與蛋白分子表面的電荷數(shù)量密切相關(guān)。先前的研究表明7S的等電點為4.8,而11S的等電點為6.4[5]。推測在中性環(huán)境下,7S蛋白攜帶大量電荷,有利于為DPPH自由基提供更多電子。因此,其DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。有研究證明,B環(huán)上有游離鄰苯二酚基團(tuán)的多酚類物質(zhì)(如黃芩素、槲皮素等)的抗氧化能力較強(qiáng)[9]。因此,蛋白-多酚復(fù)合物的DPPH自由基清除率都顯著增強(qiáng)(P<0.05)。11S-黃芩素的抗氧化能力提升更明顯,原因可能是11S蛋白與黃芩素之間主要是疏水性作用力,并未消耗多酚A、B環(huán)上的活性羥基,11S-黃芩素復(fù)合物可以提供更多的氫離子用來形成DPPH—H化合物。

        ABTS陽離子自由基的變化趨勢與DPPH自由基相似。有研究指出抗氧化能力包括斷鏈和供氫兩種能力[34]。本實驗結(jié)果表明添加多酚對這兩種能力均有一定影響,紅外光譜的研究結(jié)果可以驗證這一結(jié)論。

        3 結(jié)論

        采用多光譜技術(shù)和熱力學(xué)方法相結(jié)合,研究7S、11S-黃芩素的結(jié)合機(jī)制。結(jié)果表明,黃芩素與7S或11S結(jié)合的主要驅(qū)動力分別是氫鍵或疏水相互作用。與7S相比,11S對黃芩素的結(jié)合能力更強(qiáng),結(jié)合位點更多。黃芩素與7S、11S復(fù)合后,蛋白組分的部分由β-折疊轉(zhuǎn)化為α-螺旋和無規(guī)卷曲,活性基團(tuán)的微環(huán)境極性增強(qiáng)。此外,黃芩素的添加使蛋白組分的表面疏水性下降,熱穩(wěn)定性提高,乳化性、FC以及抗氧化活性均有所改善。本研究比較了7S、11S與黃芩素之間的相互作用機(jī)制,闡明了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與特性變化,為黃芩素在功能性食品中的應(yīng)用提供了有價值的證據(jù),進(jìn)一步強(qiáng)化7S、11S在食品工業(yè)的應(yīng)用潛力。

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