閆馨月，賈亦佳，孫詩艷，張東蒙，耿夢潔,，楊晉杰,，Stanislav SUKHIKH,Olga BABICH，齊寶坤,3,*，李 楊,3,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.康德波羅的海聯(lián)邦大學(xué)生命系統(tǒng)學(xué)院，俄羅斯 加里寧格勒 236016；3.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050）

大豆蛋白是日常膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源，由2S、7S、11S和15S這4 類蛋白質(zhì)組成，其中β-伴大豆蛋白（7S）和大豆蛋白（11S）是大豆蛋白質(zhì)的2 種主要成分，分別占總質(zhì)量的40%和30%[1]。7S組分由α（71 kDa）、α’（67 kDa）和β（50 kDa）亞基通過氫鍵和疏水相互作用堆積而成，11S組分由酸性亞基（37～42 kDa）和堿性亞基（17～20 kDa）通過疏水鍵和二硫鍵連接組成[2]。先前研究表明，7S組分決定大豆蛋白的乳化和起泡能力，11S組分決定大豆蛋白的凝膠性能[3]。這表明不同組分蛋白由于其功能性的差異可以在食品加工中發(fā)揮不同作用[4]。

黃芩素是從高黃芩根部提取的天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化等功效，但由于其水溶性和穩(wěn)定性較差，生物利用度低等問題，其應(yīng)用始終受限。因此，國內(nèi)外學(xué)者不斷運用新型的制劑手段，挖掘不同的搭載材料，以開發(fā)出有實際應(yīng)用價值的黃芩素制劑[5]。

近年來，隨著對功能性復(fù)合食品體系的需求增加，蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用越來越受到關(guān)注。據(jù)報道，蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合既能改善蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)[6]，同時也能提高多酚的生物可及性和生物利用度。研究證明，多酚通過非共價和（或）共價相互作用對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的結(jié)合親和力[7]。Ye Jiangping等[8]發(fā)現(xiàn)蘆丁與大豆分離蛋白以疏水作用力結(jié)合，復(fù)合物乳液具有良好的物理穩(wěn)定性。扁豆蛋白與多酚的非共價相互作用對蛋白的熱穩(wěn)定性以及氧化活性有顯著提升[9]。在大豆蛋白素肉加工過程中添加不同含量的茶多酚可優(yōu)化產(chǎn)品的色澤、質(zhì)構(gòu)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性[10]。蛋白質(zhì)作為多酚的穩(wěn)定劑和載體，可保護(hù)它們在胃腸消化過程中免受酶促和氧化降解，并將其輸送到小腸和結(jié)腸[3]。隨著對蛋白-多酚復(fù)合物的深入研究，越來越多的酚類化合物作為生物活性物質(zhì)或改性材料應(yīng)用到工業(yè)食品生產(chǎn)中。

本研究選取7S、11S蛋白與黃芩素作為研究對象，利用多光譜技術(shù)和分子對接探究大豆蛋白-多酚的結(jié)合機(jī)制以及結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步測定復(fù)合物的穩(wěn)定性和功能特性。通過實驗和理論相結(jié)合的方法，闡明7S、11S與黃芩素的相互作用機(jī)理。本研究有助于提升大豆蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中的功能性，同時可以促進(jìn)黃芩素作為口服營養(yǎng)成分的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；黃芩素上海源葉生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma-Aldrich公司；HCl、NaOH（均為分析純） 北京新光化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司；電子分析天平、F-6000熒光分光光度計 日本島津公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器股份有限公司；Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；TGA/SDTA851e差熱分析儀 瑞士梅特勒-托利多公司；T18basic高速乳化均質(zhì)機(jī) 英國IKS公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 7S、11S蛋白組分以及大豆蛋白-黃芩素復(fù)合物的制備

參照Liu Chun等[11]的方法，并略作修改。脫脂豆粉溶解于去離子水，料液比為1∶15（g/mL），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，低速攪拌1 h，4 ℃、9000×g離心30 min，收集上清液。重新溶解沉淀，調(diào)節(jié)pH值至9.0，低速攪拌1 h，相同條件下離心并混合上清液。添加0.01 mol/L NaHSO3溶液，用2 mo1/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4，4 ℃貯藏過夜。取溶液于4 ℃、6500×g離心20 min，水洗沉淀3 次，用去離子水溶解后調(diào)節(jié)pH值至7.5，凍干后可得11S蛋白組分。向上述上清液中加入NaCl至離子濃度為0.25 mo1/L，用2 mo1/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.4，4 ℃、9000×g離心30 min。取上清液，加入等體積去離子水，用HC1溶液調(diào)節(jié)pH值至4.8，4 ℃、6500×g再次離心20 min。取沉淀，水洗3 次后用去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.5，凍干后可得7S蛋白組分。

稱取一定質(zhì)量黃芩素溶解于甲醇溶液中作為母液，質(zhì)量濃度為10 mg/mL，置于-20 ℃保存。混合前使用Tris-HCl緩沖液將母液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將7S和11S蛋白組分分別溶解在Tris-HCl緩沖液中，質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。將蛋白與多酚溶液混合，室溫下低速攪拌30 min。使用3000 Da分子質(zhì)量的截止膜將混合液在去離子水中透析48 h，冷凍干燥后獲得7S-黃芩素、11S-黃芩素復(fù)合粉末。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜測定

測定前取1.5 mg樣品與200 mg溴化鉀研磨混勻并壓片。波數(shù)范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1，得到的紅外光譜曲線用Peak Fitting軟件擬合，分析復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)含量的變化[12]。

1.3.3 內(nèi)源熒光光譜測定

參照Liu Yan 等[13]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）將7S、11S樣品溶解，使其質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL。分別加入與蛋白溶液等量的不同濃度黃芩素溶液，使復(fù)合溶液中黃芩素的最終濃度為0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 μmol/L，用熒光分光光度計掃描。設(shè)定發(fā)射波長300～450 nm，激發(fā)波長275 nm，狹縫寬度5.0 nm，掃描速率2000 nm/min。

1.3.4 熒光猝滅和相互作用方式

通過Stern-Volmer方程（式（1））判斷黃芩素與7S、11S蛋白的猝滅類型[14]：

式中：F0為未添加黃芩素時的熒光強(qiáng)度；F為添加黃芩素時的熒光強(qiáng)度；[Q]為黃芩素濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為未添加猝滅劑時熒光分子的平均熒光壽命，一般為10-8s。

根據(jù)靜態(tài)猝滅公式，計算表觀結(jié)合常數(shù)（Ks）（L/mol）和結(jié)合位點數(shù)（n）[14]：

通過Van’t Hoff方程（式（3）），判斷黃芩素與7S、11S蛋白的相互作用方式[14]：

式中：R為氣體常數(shù)8.314；ΔH為焓變值/（kJ/mol）；ΔS為熵變值/（J/（m o l·K））；ΔG為自由能值/（kJ/mol）；T為溫度/K。

1.3.5 分子對接分析

采用Discovery Studio 2019（DS）軟件中Libdock算法進(jìn)行分子對接。從Chemicalize數(shù)據(jù)庫下載7S與11S的3D結(jié)構(gòu)。將受體（7S、11S）和配體（黃芩素）的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到DS軟件中，在CHARMM力場下優(yōu)化其結(jié)構(gòu)并調(diào)整其質(zhì)子化狀態(tài)。使用DS 2019可視7S/11S-黃芩素的相互作用。

1.3.6 掃描電子顯微鏡分析

將凍干樣品粉末使用掃描電子顯微鏡在5.0 kV加速電壓下測定，放大倍數(shù)1500倍。

1.3.7 表面疏水性測定

參照He Shudong等[15]的方法，并略作修改。將20 mg樣品溶于10 mL PBS（10 mmol/L，pH 7.2）中，然后稀釋獲得0.005～2 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，暗處反應(yīng)30 min。以添加ANS的PBS作為空白對照。用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長分別為380 nm和480 nm，縫隙為5 nm，樣品的表面疏水性表示為蛋白質(zhì)濃度相對于熒光強(qiáng)度的線性方程式的斜率。

1.3.8 熱穩(wěn)定性測定

用差示掃描量熱法測定熱穩(wěn)定性[16]。將少量樣品移到鋁制坩堝中，然后將其置于氧氣流量為100 mL/min的反應(yīng)爐中，保護(hù)氣體N2，氣體流速20 mL/min，溫度范圍25～125 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.3.9 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參照Pearce等[17]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末，使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL，取15 mL樣品溶液與5 mL大豆油混合，用高速乳化均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（12000 r/min，2 min）。乳化后的樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100 倍并混合均勻，于500 nm波長處測定吸光度，記為A0；靜置10 min后測定吸光度，記為A10；十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照。按式（4）、（5）計算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）：

式（4）、（5）中：ρ為樣品質(zhì)量濃度/（g/mL）；Φ為乳化液中油相的比例，Φ＝0.25；L為比色皿的光徑；N為稀釋倍數(shù)；T為乳液靜置時間，10 min。

1.3.10 起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foam stability，F(xiàn)S）測定

參照Sui Xiaonan等[18]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末，使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL，取100 mL樣品溶液置于500 mL量筒（直徑6 cm，高度20 cm），使用高速乳化均質(zhì)器處理樣品（12000 r/min，2 min）。按式（6）、（7）計算FC和FS：

式（6）、（7）中：V為初始溶液的高度/cm；V0為均質(zhì)后泡沫表面的高度/cm；V10為第10分鐘泡沫表面的高度/cm。

1.3.11 抗氧化活性測定

1.3.11.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測定

參考Sun Yufan等[19]的方法，并略作修改。稱取3.5 mg DPPH，用甲醇定容至10 mL，獲得DPPH自由基原始溶液。每次使用前將溶液稀釋，獲得DPPH自由基實驗溶液。測定時，采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解，使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL，再將該溶液用甲醇稀釋至合適濃度，與適量DPPH自由基實驗溶液混勻，避光靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度（A3）。以純?nèi)芤簽闃悠穼φ战M（A2），DPPH自由基-甲醇為空白組（A1），甲醇為空白對照組（A0）分別測定吸光度。按式（8）計算DPPH自由基清除率：

1.3.11.2 2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率測定

參考Sun Yufan等[19]的方法，并略作修改。采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解，使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL，取0.5 mL樣品溶液加入4 mL ABTS陽離子自由基工作液，避光靜置50 min，在734 nm波長處測定吸光度（A3）。以純?nèi)芤簽闃悠穼φ战M（A2），ABTS陽離子自由基-甲醇為空白組（A1），甲醇為空白對照組（A0）分別測定吸光度。按式（9）計算ABTS陽離子自由基清除率：

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 7S、11S-黃芩素復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜分析

由圖1A可知，黃芩素在400～1700 cm-1處有多個特征峰。與7S、11S復(fù)合后，限制了多酚的伸縮振動，導(dǎo)致其特征官能團(tuán)對應(yīng)的吸收峰消失，表明黃芩素被成功封裝在蛋白中[20]。酰胺A帶（3200～3400 cm-1）代表N—H和O—H的伸縮振動。7S組分在此處的吸收峰強(qiáng)度高于11S組分，表明7S肽鏈上的氫原子更容易參與到交聯(lián)反應(yīng)中，因此7S蛋白的結(jié)構(gòu)更加靈活。加入黃芩素后，酰胺A帶的峰強(qiáng)度變化明顯，說明多酚與蛋白可以通過分子間氫鍵連接[21]。2960 cm-1處的特征峰與C—H伸縮振動有關(guān)。復(fù)合物在此處的峰強(qiáng)度高于單一蛋白，表示蛋白與黃芩素的結(jié)合存在疏水性作用力。酰胺I、II帶位于1500～1700 cm-1處，此處的變化與C＝O、C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動有關(guān)。因此，多酚的添加改變了蛋白質(zhì)吸收峰的強(qiáng)度及寬度，通過計算峰面積可知，該變化與β-折疊的減少有關(guān)（圖1B）。推測維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的β-折疊在黃芩素的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和無規(guī)卷曲。Liu Xiangju等[14]在研究不同膳食多酚對蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的構(gòu)象變化時也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。

圖1 7S、11S及其復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜（A）和二級結(jié)構(gòu)（B）Fig.1 FT-IR spectra (A) and secondary structures (B) of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.2 7S、11S-黃芩素復(fù)合物的內(nèi)源熒光光譜分析

由圖2可知，11S的熒光強(qiáng)度高于7S，說明11S蛋白表面存在更多的發(fā)色基團(tuán)參與水合作用。隨著不同濃度黃芩素的加入，7S和11S的熒光強(qiáng)度都逐漸降低。該現(xiàn)象表明黃芩素以劑量依賴性方式導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光猝滅[22]。多酚的添加使蛋白質(zhì)的最大發(fā)射波長向短波長方向移動。推測是由于黃芩素與蛋白質(zhì)的相互作用導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基周圍的微環(huán)境極性減弱，發(fā)色基團(tuán)處于更疏水的環(huán)境，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更緊密。11S-黃芩素的熒光光譜藍(lán)移明顯，這可能與11S蛋白的結(jié)構(gòu)較為疏松，更容易被多酚誘導(dǎo)產(chǎn)生構(gòu)象變化有關(guān)。

圖2 不同黃芩素添加量的7S-黃芩素復(fù)合物（A）和11S-黃芩素復(fù)合物（B）熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of 7S-(A) and 11S-baicalein complexes (B)with different amounts of added baicalein

2.3 7S、11S蛋白與黃芩素結(jié)合的熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅根據(jù)機(jī)理可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[23]。根據(jù)Stern-Volmer方程[24]，以[Q]為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)，可擬合出一次函數(shù)方程，通過直線斜率可求得復(fù)合物的Kq值。由圖2可知，7S、11S-黃芩素的Stern-Volmer方程線性擬合良好，表明黃芩素的猝滅方式為靜態(tài)或動態(tài)猝滅，不存在動-靜混合猝滅。由表1可知，所有樣品中，Kq的最小值為3.79×1016L/（mol·s），大于動態(tài)猝滅常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），說明此過程為靜態(tài)猝滅。

根據(jù)靜態(tài)猝滅公式，以lg[Q]為橫坐標(biāo)，lg[（F0-F）/F]為縱坐標(biāo)作圖，可得一次函數(shù)方程，由此得出Ks與n值。由表1可知，溫度為310 K時，11S-黃芩素的Ks值最大（1.70×106L/mol），高Ks值表明此溫度下蛋白質(zhì)與多酚之間的結(jié)合有較弱的空間位阻和較強(qiáng)的相互作用。7S-黃芩素的Ks值整體小于11S-黃芩素（除276 K外），推測是由于7S蛋白結(jié)構(gòu)致密，活性氨基酸殘基沒有暴露，阻礙了蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用。所有樣品的n值均大于1，表明7S/11S與黃芩素至少有一個結(jié)合位點[20]。

表1 黃芩素與7S和11S結(jié)合的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constants,binding constants and thermodynamic parameters for baicalein binding to 7S and 11S

2.4 7S、11S蛋白與黃芩素結(jié)合的相互作用方式

蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合主要涉及非共價作用力。通過Van’t Hoff方程計算相應(yīng)的ΔH、ΔS、ΔG，以此判斷兩者的相互作用方式[25]。選取276、298 K和310 K，測定不同溫度下的結(jié)合常數(shù)。如表1所示，7S、11S-黃芩素的ΔG絕對值較小，推測蛋白與多酚的結(jié)合僅涉及較弱的作用力。7S-黃芩素的ΔH＜0、ΔS＜0，表明7S與黃芩素的相互作用方式為氫鍵和范德華力。11S-黃芩素的ΔH＞0、ΔS＞0，說明11S與黃芩素結(jié)合時的主要作用力是疏水相互作用。原因可能是11S分子表面存在較多的疏水基團(tuán)，更容易與配體的疏水區(qū)域（如苯環(huán)）結(jié)合[26]。

2.5 7S、11S蛋白與黃芩素的分子對接分析

通過分子對接可以預(yù)測黃芩素對7S和11S蛋白的精確結(jié)合位點和結(jié)合模式。由圖3可知，黃芩素A5和A7位置上的羥基氧分別與7S蛋白中Arg188（2.22 ?）和Gln365（2.36 ?）的氨基發(fā)生氫鍵相互作用。A5和A6位置的羥基作為氫供體分別與Glu367（2.75 ?）和Arg364（2.51 ?）的氧原子結(jié)合。此外，黃芩素的苯環(huán)（A環(huán)和C環(huán)）也可以與7S蛋白的Arg329（4.74 ?）和Ile330（5.36 ?）構(gòu)成疏水相互作用。由于7S-黃芩素的疏水相互作用較弱且數(shù)量較少，因此兩者的結(jié)合主要依靠氫鍵。不同于7S蛋白的親水性，11S表面擁有大量的疏水性氨基酸。因此，11S蛋白與多酚的結(jié)合通常依賴于疏水性作用力。包括A環(huán)與Val162（5.26 ?），B環(huán)與Met177（5.24 ?）和Arg161（5.41 ?）以及C環(huán)與Arg161（5.28 ?）和Ile171（5.18 ?）。此外，C4位置的羰基氧能與His173以氫鍵結(jié)合。結(jié)合和對接分?jǐn)?shù)可以進(jìn)一步反映7S、11S蛋白與黃芩素的結(jié)合親和力。結(jié)合能絕對值或?qū)臃謹(jǐn)?shù)越高證明親和力越強(qiáng)[27]。由表1、2可知，結(jié)合能的理論值與熒光猝滅的分析結(jié)果存在一定差異，但變化趨勢一致。

圖3 黃芩素與7S（A）和11S（B）的結(jié)合模式Fig.3 Binding patterns of baicalein with 7S (A) and 11S (B)

表2 黃芩素與7S和11S結(jié)合的能量及評分Table 2 Energy and score of baicalein binding to 7S and 11S

2.6 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的掃描電子顯微鏡分析

由圖4可知，7S蛋白具有片狀及球形結(jié)構(gòu)，11S蛋白既有片層狀結(jié)構(gòu)也有較大的塊狀結(jié)構(gòu)。這與不同蛋白的亞基數(shù)量及結(jié)構(gòu)柔性有關(guān)，11S蛋白結(jié)構(gòu)呈剛性，導(dǎo)致其溶解性較差。因此，11S蛋白的微觀結(jié)構(gòu)圖中出現(xiàn)較多塊狀聚集體。加入黃芩素后，7S蛋白的聚集性增強(qiáng)。此外，由于復(fù)合物分子間的非共價相互作用導(dǎo)致未折疊和柔性蛋白質(zhì)經(jīng)歷部分重折疊過程，形成更多的球形結(jié)構(gòu)。11S蛋白的結(jié)構(gòu)柔性較弱，添加黃芩素后并未出現(xiàn)明顯的構(gòu)象變化，但同樣會使部分原始結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐位驐U狀結(jié)構(gòu)。

圖4 7S、11S及其復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.7 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的表面疏水性分析

由表3可知，與7S相比，11S的表面疏水性較大。有研究表明，中性pH值條件下11S蛋白酸性亞基呈親水性，堿性亞基呈疏水性；7S蛋白的α和α’亞基呈親水性，β亞基呈疏水性。但7S蛋白分子中含有N-糖鏈，因此整體親水性高于11S蛋白[5]。加入黃芩素后，7S和11S的表面疏水性都降低。原因有兩點：1）添加黃芩素引入了親水性羧基，導(dǎo)致復(fù)合物整體的疏水性下降；2）黃芩素誘導(dǎo)蛋白的構(gòu)象變化，芳香族基團(tuán)被掩埋，使疏水性亞基數(shù)量減少。Ren Cong等[28]研究花青素與蛋白的結(jié)合作用時也有類似的結(jié)果。

表3 7S、11S及其與黃芩素復(fù)合物的功能特性Table 3 Functional properties of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.8 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析

由表3可知，7S、11S蛋白的變性溫度（Td）分別為77.76 ℃和75.00 ℃，變性焓（ΔH）分別為-52.79 J/g和-63.08 J/g，溫度與焓值的差異歸因于蛋白的亞基數(shù)量和構(gòu)象靈活性。7S蛋白主要由α、α’和β亞基組成，結(jié)構(gòu)柔性大；11S蛋白由6 個酸性亞基和5 個堿性亞基組成，結(jié)構(gòu)剛性大[5]。因此，11S蛋白的變性需要更多能量。添加多酚后，蛋白的Td降低而ΔH的絕對值提高，原因可能是蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵與巰基相互交換，導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)改變，從而增加變性難度[28]。

2.9 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

如表3所示，7S與11S的EAI值分別為10.52 m2/g和7.25 m2/g。研究表明，EAI與蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的靈活性密切相關(guān)[29]。由于11S蛋白的分子內(nèi)二硫鍵較多，亞基締合結(jié)構(gòu)致密，相比于7S蛋白，不僅分子質(zhì)量大而且具有更加剛性的空間構(gòu)象。結(jié)構(gòu)的靈活性較差導(dǎo)致11S蛋白分子移動至油水界面的速度緩慢，因此其EAI值較低。黃芩素的添加提高了蛋白的乳化活性，推測是由于多酚與蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象更加靈活。柔性結(jié)構(gòu)加快了乳液中蛋白分子在油水界面的重排速度，因此EAI值增大。

乳化穩(wěn)定性是指油-水界面聚集并穩(wěn)定小液滴的能力[30]。由表3可知，11S蛋白的乳化穩(wěn)定性優(yōu)于7S蛋白。推測該現(xiàn)象與11S蛋白的表面疏水性有關(guān)。由于11S蛋白分子更易聚集，其不溶性聚集體能夠在油水界面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，抑制油滴的聚攏。因此，11S蛋白擁有較高的ESI值。Tang Chuanhe[31]構(gòu)建了7S與11S蛋白于油水界面處的吸附行為模型，也得出了類似結(jié)論。加入多酚使蛋白質(zhì)的ESI值提高，歸因于復(fù)合物具有較強(qiáng)的分子間和分子內(nèi)作用力，形成了更加剛性且有序的界面膜。因此，復(fù)合物乳液比純蛋白乳液具有更高的乳化穩(wěn)定性。

2.10 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物的FC及FS

蛋白的FC是指蛋白溶液在攪打過程中產(chǎn)生泡沫的能力，受電荷密度、分子大小以及疏水性等因素影響[32]。由表3可知，7S蛋白的FC值較高，歸因于7S蛋白分子在空氣-水界面處的張力較小、界面儲存模量較大。加入黃芩素后，蛋白的FC值提高。推測是由于復(fù)合物結(jié)構(gòu)的柔性增強(qiáng)，更容易被吸附到空氣-水界面上，降低了界面的表面張力[33]。FS是指蛋白具有足夠的黏度以維持結(jié)構(gòu)并防止破裂和聚結(jié)的能力[32]。觀察到FS值的變化趨勢與FC值相同。表明7S蛋白在空氣-水界面處更易形成具有較大黏性和彈性的薄膜。加入多酚后，蛋白的FS值增大。原因可能是界面吸附的蛋白含量增加，導(dǎo)致泡沫表面膜黏性提高，有效降低液體析出，更有利于泡沫的穩(wěn)定。

2.11 7S、11S蛋白與黃芩素復(fù)合物抗氧化活性

由表3可知，7S蛋白的DPPH自由基清除能力高于11S蛋白，這與蛋白分子表面的電荷數(shù)量密切相關(guān)。先前的研究表明7S的等電點為4.8，而11S的等電點為6.4[5]。推測在中性環(huán)境下，7S蛋白攜帶大量電荷，有利于為DPPH自由基提供更多電子。因此，其DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。有研究證明，B環(huán)上有游離鄰苯二酚基團(tuán)的多酚類物質(zhì)（如黃芩素、槲皮素等）的抗氧化能力較強(qiáng)[9]。因此，蛋白-多酚復(fù)合物的DPPH自由基清除率都顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。11S-黃芩素的抗氧化能力提升更明顯，原因可能是11S蛋白與黃芩素之間主要是疏水性作用力，并未消耗多酚A、B環(huán)上的活性羥基，11S-黃芩素復(fù)合物可以提供更多的氫離子用來形成DPPH—H化合物。

ABTS陽離子自由基的變化趨勢與DPPH自由基相似。有研究指出抗氧化能力包括斷鏈和供氫兩種能力[34]。本實驗結(jié)果表明添加多酚對這兩種能力均有一定影響，紅外光譜的研究結(jié)果可以驗證這一結(jié)論。

3 結(jié)論

采用多光譜技術(shù)和熱力學(xué)方法相結(jié)合，研究7S、11S-黃芩素的結(jié)合機(jī)制。結(jié)果表明，黃芩素與7S或11S結(jié)合的主要驅(qū)動力分別是氫鍵或疏水相互作用。與7S相比，11S對黃芩素的結(jié)合能力更強(qiáng)，結(jié)合位點更多。黃芩素與7S、11S復(fù)合后，蛋白組分的部分由β-折疊轉(zhuǎn)化為α-螺旋和無規(guī)卷曲，活性基團(tuán)的微環(huán)境極性增強(qiáng)。此外，黃芩素的添加使蛋白組分的表面疏水性下降，熱穩(wěn)定性提高，乳化性、FC以及抗氧化活性均有所改善。本研究比較了7S、11S與黃芩素之間的相互作用機(jī)制，闡明了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與特性變化，為黃芩素在功能性食品中的應(yīng)用提供了有價值的證據(jù)，進(jìn)一步強(qiáng)化7S、11S在食品工業(yè)的應(yīng)用潛力。