許 丹，韓 悅，鄭 斌，鄧尚貴，陳雪昌,，張小軍,,*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

內(nèi)源性蛋白酶是存在于水產(chǎn)品體內(nèi)的蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)肽鍵，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而改變蛋白質(zhì)的理化和功能特性。水產(chǎn)品死亡后內(nèi)源性蛋白酶的活化和釋放會(huì)引起相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白等底物的變性和水解，從而損害水產(chǎn)品品質(zhì)[1]。研究表明，對(duì)這一過程影響最大的蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶、鈣蛋白酶和組織蛋白酶[2-3]，其中又以組織蛋白酶B、L、H對(duì)肌肉蛋白質(zhì)降解作用最為顯著，其可導(dǎo)致水產(chǎn)品死后凍藏期間肌球蛋白重鏈的降解[4-5]。蝦肉中的組織蛋白酶會(huì)隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷作用于肌肉蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架和肌原纖維蛋白被破壞[6]。凍藏可延長(zhǎng)水產(chǎn)品貯藏期，但在凍藏過程中，冰晶的生成可加速組織的破裂，溶酶體中組織蛋白酶轉(zhuǎn)移至線粒體的速度加快，使線粒體酶活性上升，隨著組織蛋白酶接觸并破壞線粒體結(jié)構(gòu)，促使線粒體凋亡，最終導(dǎo)致整體酶活性呈下降趨勢(shì)。李志鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，凍藏條件下兩組蝦組織蛋白酶H酶活整體低于冷藏條件下酶活。沈春蕾等[7]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦在凍藏過程中，蝦頭中部分蛋白酶可能會(huì)逐步遷移到蝦肌肉中，進(jìn)而對(duì)肌肉品質(zhì)產(chǎn)生較大影響。

不凍液凍結(jié)是一種新型快捷、高效安全的速凍方法，己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品凍藏保鮮。不凍液凍結(jié)速度快、耗時(shí)短、效率高，凍結(jié)后產(chǎn)品質(zhì)量高，汁液損失少，能保持原有的質(zhì)構(gòu)、口感和外觀。不凍液是由安全的食品添加劑，如丙二醇、低聚糖等組成，具有成本低、可重復(fù)使用且縮短加工周期等優(yōu)點(diǎn)[8]。不凍液的凍結(jié)過程是水產(chǎn)品通過與載冷劑直接或間接接觸，使其快速冷卻，是一種新型且理想的冷凍加工技術(shù)[9-10]。王雪松等[11]通過對(duì)低溫浸漬快速凍結(jié)的研究，優(yōu)化出適用于-30 ℃以下的最優(yōu)載冷劑，其由20% CaCl2、8%丙二醇、5%海藻糖和水組成。倪明龍[12]研究出了一種多元載冷劑凍結(jié)草魚，與空氣鼓風(fēng)凍結(jié)進(jìn)行對(duì)比，可以明顯改善凍結(jié)草魚的品質(zhì)。

目前，蝦肌肉組織中內(nèi)源性蛋白酶活性對(duì)其肌肉品質(zhì)的影響，還存在較多不明之處，尤其關(guān)于中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）等海水蝦類中組織蛋白酶活性對(duì)其肌原纖維蛋白氧化的研究還鮮有報(bào)道。本研究以舟山海域捕撈的中華管鞭蝦為研究對(duì)象，比較分析不凍液凍藏和普通凍藏對(duì)其肌原纖維蛋白的影響，并對(duì)中華管鞭蝦的組織蛋白酶活性進(jìn)行研究，分析其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和肌肉組織產(chǎn)生的影響。旨在為后續(xù)海水蝦類組織蛋白酶活性及其凍藏方式的選擇提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華管鞭蝦捕撈于舟山海域，體長(zhǎng)平均（12.5±2.2）cm，體質(zhì)量平均（15.5±2.3）g。捕撈后放入冰袋，置于保溫箱內(nèi)，到岸后迅速送回實(shí)驗(yàn)室。

五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、溴酚藍(lán)（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；牛血清蛋白（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；Tris-馬來酸（分析純） 上海麥克林生化科技股份有限公司；ATP酶試劑盒、組織蛋白酶試劑盒、總巰基試劑盒 江蘇省南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 50紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司；AvantiJXN-30離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫爾特公司；ME204E分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LPD2500渦旋混合儀 萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；DLSB-30/40低溫冷卻液循環(huán)泵 浙江省杭州庚雨儀器有限公司；EVP MA25/LS25掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

不凍液速凍：將配好的不凍液（乙醇∶甜菜堿∶丙二醇∶氯化鈉＝25∶10∶10∶6，m/m）分別預(yù)冷至-18 ℃和-30 ℃后，將密封袋中的中華管鞭蝦置于不凍液中進(jìn)行凍結(jié)，分別標(biāo)記為-18 ℃ QF和-30 ℃ QF。冰箱緩凍：將密封袋中的中華管鞭蝦直接分別置于-18 ℃和-30 ℃冰箱中凍結(jié)，分別標(biāo)記為-18 ℃ SF 和-30 ℃ SF。當(dāng)4 組樣品中心溫度為-18 ℃時(shí)取出，將凍結(jié)后的蝦體置于-18 ℃冰箱中凍藏120 d，間隔20 d取樣，將樣品于4 ℃環(huán)境中解凍并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 鹽溶性蛋白含量測(cè)定

采用劉書來等[13]的方法，并稍作修改。取5.0 g解凍后蝦肉，加入45 mL低離子強(qiáng)度磷酸鹽緩沖溶液（含0.025 mol/L NaH2PO4、0.025 mol/L Na2HPO4，pH 6.8），4 ℃、10000 r/min勻漿3 min。在4 ℃冰箱中抽提1 h，10000 r/min離心30 min。所得沉淀用9 倍體積的高離子強(qiáng)度磷酸鹽緩沖溶液（含0.025 mol/L NaH2PO4、0.025 mol/L Na2HPO4、0.6 mol/L KCl，pH 6.8）于4 ℃、10000 r/min勻漿30 s，4 ℃條件下抽提3 h，10000 r/min離心30 min。重復(fù)上述操作1 次，所得上清液即為鹽溶性蛋白質(zhì)，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

采用Jiang Qixing等[14]的方法，并稍作修改。取10 mL鹽溶性蛋白，加入30 mL去離子冰水，稀釋上清液使肌原纖維蛋白沉淀，4 ℃、12000 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)上述操作2 次，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.4 表面疏水性測(cè)定

用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0、0.05 mol/L）將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，取2 mL。加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，混勻后靜置15 min，4 ℃、5000 r/min離心10 min。取上清液于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度?？瞻捉M用磷酸緩沖液替代溴酚藍(lán)溶液，以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性，按下式計(jì)算：

式中：A0為空白吸光度；A樣為樣品吸光度。

1.3.5 Ca2＋-ATPase活性測(cè)定

使用ATP酶測(cè)試盒，按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 總巰基含量測(cè)定

使用蛋白質(zhì)總巰基測(cè)試盒，按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 組織蛋白酶活性測(cè)定

使用組織蛋白酶B、組織蛋白酶L和組織蛋白酶H試劑盒，按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 肌原纖維橫縱切面結(jié)構(gòu)觀察

將蝦肉切成1 mm3左右的小塊，浸沒在2.5%戊二醛中，置于4 ℃冰箱中過夜。用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（50%、70%、80%、90%）梯度脫水15 min，最后用無水乙醇脫水3 次，每次15 min。真空干燥后通過掃描電子顯微鏡在放大500 倍下觀察中華管鞭蝦的肌原纖維橫切面和縱切面結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品做3 次平行。采用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)、Origin 8.5軟件繪圖，不同處理組間的比較采用最小顯著差異法，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦鹽溶性蛋白含量變化

鹽溶性蛋白是中華管鞭蝦肌肉蛋白中最主要的蛋白質(zhì)，其含量約為65%～75%[15]。肌肉中鹽溶性蛋白含量越低，冷凍變性程度越高[13]。如圖1所示，120 d凍藏期內(nèi)，不同溫度凍藏下的中華管鞭蝦肉鹽溶性蛋白含量均有不同程度下降，-30 ℃凍藏組鹽溶性蛋白含量下降程度弱于-18 ℃凍藏組。凍藏至120 d時(shí)，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組鹽溶性蛋白含量分別為72.40、77.90、92.7 mg/g和97.8 mg/g，與新鮮蝦（120.40 mg/g）相比分別下降了39.87%、35.30%、23.01%和18.77%，差異顯著（P＜0.05），該結(jié)果表明凍藏溫度越低，蛋白質(zhì)凍結(jié)變性速度越緩慢，鹽溶性蛋白含量下降越緩慢。此外，QF組鹽溶性蛋白含量下降程度低于SF組，其原因可能為不凍液速凍時(shí)凍結(jié)速率較快，形成的冰晶均勻細(xì)小，對(duì)蝦肌原纖維造成的破壞較小，使鹽溶性蛋白含量下降緩慢。劉書來[13]和胡亞芹[16]等分別研究了凍結(jié)方式對(duì)烏鱧塊和帶魚品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)凍結(jié)速率越快，其鹽溶性蛋白含量下降越慢，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。凍藏過程中鹽溶性蛋白含量下降的影響因素較多，如水產(chǎn)品肌肉中部分結(jié)合水發(fā)生冰晶沉淀，引起肌動(dòng)球蛋白分子之間形成非共價(jià)鍵，從而形成大分子的不溶性凝集，造成肌動(dòng)球蛋白溶出減少[17]。曾名勇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)球蛋白降解變性，生成堿性蛋白，這種蛋白在高離子濃度下不能溶解，但在堿性溶液中能溶解，從而降低了冷凍凍藏時(shí)的溶解性，使肌球蛋白重鏈聚合，鹽溶性蛋白含量下降。

圖1 中華管鞭蝦鹽溶性蛋白含量變化Fig.1 Changes in salt-soluble protein content of S.crassicornis

2.2 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦表面疏水性變化

蛋白質(zhì)表面疏水性的改變可以反映蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸相對(duì)含量的改變，即可以衡量蛋白質(zhì)的變性程度[19-20]。由圖2可知，凍藏前60 d，4 組凍藏條件下中華管鞭蝦肉蛋白質(zhì)的表面疏水性均呈遞增趨勢(shì)，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組依次由最初的310.2 μg上升至485.2、435.64、395.6 μg和386.7 μg，在凍藏第60天達(dá)到最大值。-18 ℃組凍藏期間蛋白質(zhì)表面疏水性始終高于-30 ℃組，表明較低的凍藏溫度更能夠保護(hù)蛋白的空間構(gòu)象不發(fā)生變化。凍藏0～60 d時(shí)，每組蛋白質(zhì)表面疏水性上升趨勢(shì)較大，凍藏60～120 d時(shí)，表面疏水性呈先下降后平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，其原因可能為蛋白進(jìn)一步氧化使疏水基團(tuán)發(fā)生聚集[21]。SF組凍藏期間蛋白質(zhì)表面疏水性均明顯高于QF組，說明冰箱緩凍較不凍液速凍下蝦肉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變，尤其是-30 ℃ QF組，其蛋白質(zhì)表面疏水性最低。表面疏水性的增加，是由于凍藏期間蛋白質(zhì)在冷凍狀態(tài)下被氧化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使疏水性脂肪酸和芳香族氨基酸暴露于蛋白質(zhì)分子表面，破壞了蛋白質(zhì)原先的排列方式[22-23]。

圖2 中華管鞭蝦肌肉蛋白的表面疏水性變化Fig.2 Changes in surface hydrophobicity of S.crassicornis protein

2.3 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦Ca2＋-ATPase活性變化

Ca2＋-ATPase活性是反映肌球蛋白和肌原纖維蛋白分子完整性的重要指標(biāo)[24]。如圖3所示，凍藏期間，中華管鞭蝦Ca2＋-ATPase活性明顯降低，表明其氧化過程在凍藏120 d期間一直持續(xù)，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組的Ca2＋-ATPase活性由最初的0.98 U/mg依次下降至0.13、0.18、0.21 U/mg和0.32 U/mg，分別下降了86.73%、81.63%、78.57%和67.35%。-30 ℃低溫組和QF組的Ca2＋-ATPase活性均高于-18 ℃組和SF組。此外，凍藏前期Ca2＋-ATPase活性的降低趨勢(shì)快于后期，凍藏期間Ca2＋-ATPase活性的下降可能是由肌球蛋白頭部構(gòu)象的改變及蛋白質(zhì)的聚集引起[25]，這也表明低溫破壞了肌球蛋白的完整性，使蛋白發(fā)生變性，從而降低肌原纖維蛋白的功能特性，但不凍液速凍相較于冰箱緩凍，能夠在一定程度上抑制冰晶的增長(zhǎng)，從而抑制蛋白氧化，減少蛋白結(jié)構(gòu)損傷。

圖3 中華管鞭蝦肌肉蛋白的Ca2+-ATPase活性變化Fig.3 Changes in Ca2+-ATPase activity of S.crassicornis protein

2.4 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦總巰基含量變化

總巰基含量的變化反映了蛋白質(zhì)不可逆的氧化變性程度[26]。由圖4可知，4 組凍藏條件下中華管鞭蝦的總巰基含量均逐漸降低，凍藏0～60 d時(shí)，總巰基含量下降較快，這種變化是因?yàn)榧≡w維中某些巰基存在于分子外，在凍藏初期就會(huì)發(fā)生氧化，但是不會(huì)發(fā)生明顯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變[27]。-18 ℃組比較于-30 ℃組，溫度越高，總巰基含量減少越多，這說明凍藏溫度越低，越能保護(hù)蛋白的巰基不受氧化。此外，SF組總巰基含量明顯低于QF組，在凍藏前40 d和后20 d總巰基含量急劇下降，凍藏第120天時(shí)，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組的總巰基含量依次降低了7.02%、6.26%、4.34%和3.35%，與初始值相比差異顯著（P＜0.05）?？値€基含量的降低會(huì)伴隨二硫鍵含量的升高，因此可以推測(cè)，在低溫凍藏過程中，埋藏在分子內(nèi)部的巰基由于蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變而暴露，氧化成為二硫鍵[19]。圖3、4的結(jié)果表明，Ca2＋-ATPase活性降低和總巰基含量降低具有正相關(guān)，這也意味著肌球蛋白頭部的巰基直接影響Ca2＋-ATPase活性[19,28]。

圖4 中華管鞭蝦肌肉蛋白的總巰基含量變化Fig.4 Changes in total sulfhydryl content of S.crassicornis protein

2.5 不同凍藏條件下中華管鞭蝦組織蛋白酶活性變化

組織蛋白酶B、H、L是引起蝦死后肌肉降解的主要酶類[29]。由圖5可知，組織蛋白酶H活性相比于其他兩組酶活性明顯偏低，且相對(duì)于其他兩組變化不明顯，認(rèn)為在冷凍凍藏期間，組織蛋白酶H對(duì)蝦肉中蛋白質(zhì)的降解作用不大，因此不再對(duì)其進(jìn)行探討。

由圖5a可知，組織蛋白酶B活性在凍藏第20天和第40天時(shí)，-30 ℃組比-18 ℃組、QF組比SF組的酶活性明顯偏低，表明低溫、不凍液凍藏對(duì)酶活性存在抑制作用；凍藏后期（第60天后），各組酶活性均呈上升趨勢(shì)，且不同貯藏條件組間無顯著差異（P＞0.05），該結(jié)果表明，短期低溫速凍能明顯抑制中華管鞭蝦的組織蛋白酶活力，但隨著冷凍時(shí)間的增加，組織蛋白酶B活性不再受到有效抑制。

由圖5c可知，組織蛋白酶L活性在凍藏前40 d，其活性呈下降趨勢(shì)，其原因可能為冷凍保存會(huì)降低酶活性，也有可能是因?yàn)槿苊阁w中的組織蛋白酶被釋放到其他亞細(xì)胞中[30]。凍藏第40天，4 組酶活性均比初始值低，凍藏后期（第60天后），4 組酶活性不斷上升，表明細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生降解[31]，這與Ca2＋-ATPase活性和總巰基含量變化相符。凍藏第120天，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組、-30 ℃ QF組4 組組織蛋白酶L活性依此由0.21 U/g上升至0.27、0.26、0.26、0.25 U/g，差異顯著（P＜0.05），但4 組之間無顯著差異（P＞0.05）。

對(duì)比分析圖5a、c的結(jié)果表明，組織蛋白酶L的活性高于組織蛋白酶B，這說明在凍藏過程中，組織蛋白酶L對(duì)肌肉組織的變化發(fā)揮著更主要的作用，這與Aoki等[32]的研究結(jié)果一致。

圖5 中華管鞭蝦肌肉蛋白的組織蛋白酶B（a）、H（b）、L（c）活性變化Fig.5 Changes in cathepsin B (a),H (b) and L (c) activity of S.crassicornis protein

2.6 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦肌原纖維橫縱切面結(jié)構(gòu)變化

如圖6、7所示，凍藏60 d時(shí)，QF組中華管鞭蝦肌原纖維橫切面無明顯變化，縱切面整齊，只有些許細(xì)胞間隙；而SF組中華管鞭蝦肌原纖維橫切面出現(xiàn)大量空隙，縱切面分布混亂，-18 ℃ SF組的蝦肉肌原纖維甚至出現(xiàn)了斷裂，這些間隙隨著蝦肉的汁液損失出現(xiàn)，蝦肉在凍結(jié)時(shí)，體內(nèi)游離水被凍結(jié)成冰使體積變大，導(dǎo)致肌原纖維被擠壓，解凍后，肌肉中的冰又重新融化為水，使間隙變大[30,33]。凍藏120 d，4 組中華管鞭蝦的組織結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)明顯改變，觀察橫切面發(fā)現(xiàn)，肌纖維表面出現(xiàn)顆粒狀，肌纖維之間的界限變得模糊，這說明肌內(nèi)膜已斷裂，且與肌束膜發(fā)生分離[30]。SF組相較于QF組存在大范圍的肌纖維斷裂、肌節(jié)橫紋模糊，表明不凍液凍結(jié)凍藏有利于維持肌肉組織結(jié)構(gòu)?？焖賰鼋Y(jié)形成的冰晶小且分布均勻，不會(huì)對(duì)中華管鞭蝦的肌體造成機(jī)械損害，能有效抑制中華管鞭蝦的肌肉蛋白變性和降解，且-30 ℃ QF組比-18 ℃ QF組肌原纖維完整性更好，表明低溫有利于維持中華管鞭蝦肌原纖維的完整性。

圖6 中華管鞭蝦肌原纖維橫切面結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Changes in longitudinal cross-sectional structure of S.crassicornis myofibrils

圖7 中華管鞭蝦肌原纖維縱切面結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Changes in transverse cross-sectional structure of S.crassicornis myofibrils

3 結(jié)論

以舟山海域捕撈的中華管鞭蝦為原料，深入分析了不凍液速凍凍藏和冰箱緩凍凍藏條件下肌原纖維蛋白氧化的指標(biāo)變化以及組織蛋白酶B、H、L活性的變化；通過肌原纖維微結(jié)構(gòu)觀察，分析酶活性對(duì)肌原纖維蛋白水解產(chǎn)生的作用，并探討其與肌組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不凍液凍結(jié)后的中華管鞭蝦，蛋白降解不嚴(yán)重，且組織結(jié)構(gòu)保持相對(duì)較好，對(duì)肌肉的機(jī)械損傷小，對(duì)肌原纖維蛋白降解具有明顯抑制作用，對(duì)保持其肌纖維的完整性具有重要意義。本研究闡明了海捕蝦在凍結(jié)過程中的蛋白氧化情況及其體內(nèi)組織蛋白酶的作用，揭示了蛋白氧化與組織蛋白酶活性的影響，為海捕蝦等海捕類水產(chǎn)品在凍藏過程中的蛋白氧化、品質(zhì)控制和防腐保鮮提供一定理論依據(jù)，為海捕類水產(chǎn)品的加工凍藏開拓新思路。此外，研究還存在不足之處，還需進(jìn)一步研究，如由于低溫冷卻液循環(huán)泵的溫度限制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度指標(biāo)較少；凍藏期間，蛋白質(zhì)氧化和酶作用對(duì)其他蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響仍有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和改進(jìn)。