林日旭，李易達(dá)，林義，王芳，蔣磊，李劍敏

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬溫嶺醫(yī)院 病理科，浙江 臺(tái)州 317500；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015

肺癌是一種多步驟、多因素的疾病，具有多種組織學(xué)亞型，是全球新發(fā)癌癥病例和死亡的主要原因。中國(guó)肺癌負(fù)擔(dān)最重，占全球病例的36.98%和死亡人數(shù)的39.21%[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的85%，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）占據(jù)比例最高。近年來(lái)，肺癌的總體病死率已經(jīng)下降，這種下降主要是驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療顯著提高攜帶相應(yīng)驅(qū)動(dòng)突變的患者的生存率。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、ROS1癌基因受體酪氨酸激酶（ROS protooncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1）是主要驅(qū)動(dòng)突變因子，其突變狀態(tài)與靶向藥物的預(yù)后緊密相關(guān)，為晚期NSCLC指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后提供重要指標(biāo)[2-4]。然而，多數(shù)肺癌患者往往在晚期被確診，但是獲取足夠的腫瘤組織用于分子診斷是相當(dāng)困難的，因此尋求有效的替代樣本用于分子診斷。惡性胸腔積液（malignant pleural effusion,MPE）被定義為在癌癥中排列在肺外部和胸腔壁的薄薄組織層（胸膜）之間的液體，常見(jiàn)于多種惡性腫瘤，包括肺癌、乳腺癌和淋巴瘤，但最常見(jiàn)于肺癌。對(duì)于許多NSCLC患者，MPE可以安全且重復(fù)地獲得，并可作為分子分析的替代標(biāo)本，特別是晚期和不可切除的NSCLC患者[5-6]。因此，本研究將采用LUAD患者的MPE中分別制成細(xì)胞涂片和細(xì)胞蠟塊，進(jìn)行病理診斷及基因突變檢測(cè)，為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展及靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2017年1月至2021年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色及免疫組化明確診斷為L(zhǎng)UAD的胸水標(biāo)本41例，男23例，女18例，年齡37～93（66.7±13.0）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)法手術(shù)或獲取組織蠟塊的LUAD患者；②具有充足的胸腔積液用于細(xì)胞蠟塊和細(xì)胞HE涂片制作；③可通過(guò)醫(yī)院診療系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)年齡、性別、臨床分期、吸煙史等完善臨床信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有高血壓等心血管疾病和其他合并癥、腦轉(zhuǎn)移患者；②無(wú)配對(duì)的MPE細(xì)胞蠟塊或細(xì)胞學(xué)HE涂片。所有研究對(duì)象的臨床病理特征見(jiàn)表1。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)審批（批件號(hào)：2022第R071號(hào)）。

表1 LUAD患者臨床病理特征[n=41，例（%）]

1.2 胸水涂片及細(xì)胞蠟塊制備 收集LUAD患者胸水，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞涂片后HE染色。另將涂片剩余的胸水進(jìn)行離心（12 000 r/min，5 min），棄上清液后獲取胸水細(xì)胞沉淀；加入4%中性甲醛溶液靜置、固定30 min；棄上清液，細(xì)胞倒入擦鏡紙并加入不同濃度乙醇進(jìn)行脫水；將包好細(xì)胞的擦鏡紙塊放入4%中性甲醛溶液固定，制成細(xì)胞蠟塊，進(jìn)行切片及HE染色。

1.3 細(xì)胞蠟塊DNA獲取及突變檢測(cè)方法 準(zhǔn)備收集好的胸水細(xì)胞涂片樣本及細(xì)胞蠟塊樣本，采用核酸DNA/RNA提取試劑盒（廈門(mén)艾德生物技術(shù)有限公司，ADx-FF03，注冊(cè)號(hào)：閩廈械備20150082號(hào)）提取細(xì)胞中DNA/RNA，DNA/RNA純度A60/A280比值在1.8～2.0之間。

胸水細(xì)胞涂片經(jīng)刮片后，提取DNA/RNA后，采用EGFR/ALK/ROS1/BRAF/KRAS/HER2基因突變檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法，南京世和醫(yī)療器械有限公司）及基因測(cè)序儀（型號(hào)：MiSeqDx，美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行下一代測(cè)序（next-generation sequencing,NGS）檢測(cè)EGFR/ALK/ROS1基因突變。反應(yīng)程序：采用DNA探針捕獲技術(shù)，首先對(duì)提取的核酸（DNA）進(jìn)行片段化、加接頭、PCR擴(kuò)增等步驟制備文庫(kù)；其后采用具有特定序列的DNA探針與文庫(kù)進(jìn)行雜交，從而特異性捕獲來(lái)自人類基因組6種基因中的部分外顯子與內(nèi)含子區(qū)域，之后通過(guò)磁珠法富集被探針捕獲的目標(biāo)區(qū)域DNA片段。在對(duì)捕獲富集后的文庫(kù)進(jìn)行定量與質(zhì)控后，采用基因測(cè)序儀（型號(hào)：MiSeqDx，美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)軟件判讀6種靶基因中是否存在來(lái)自腫瘤的變異。

胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)脫蠟后，提取DNA/RNA后，采用人類EGFR/ALK/ROS1基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒[突變擴(kuò)增阻滯法（amplification refractory mutation system,ARMS），廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥有限公司]及Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Stratagene公司）進(jìn)行基因突變檢測(cè)。反應(yīng)程序?yàn)榈谝浑A段：95 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃20 s，72 ℃ 20 s，15 個(gè)循環(huán)；第三階段：93 ℃25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31 個(gè)循環(huán)，收集FAM及VIC信號(hào)，對(duì)樣本再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)說(shuō)明書(shū)判讀是否存在基因變異。

1.4 預(yù)后分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例和率表示，通過(guò)醫(yī)院電子診療系統(tǒng)收集相關(guān)臨床病理特征信息，通過(guò)電話隨訪得到對(duì)應(yīng)患者的總體生存期（OS）及無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）。隨訪起始時(shí)間為2017年1月，終點(diǎn)時(shí)間為2021年12月。使用R語(yǔ)言中的“rms”包做預(yù)后分析，采用Log-Rank檢驗(yàn)比較同一檢測(cè)方法中突變和未突變兩組生存率，使用survminer包畫(huà)出K-M曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 胸水細(xì)胞HE涂片見(jiàn)大量核大深染異型細(xì)胞（見(jiàn)圖1A），細(xì)胞胸水蠟塊顯示見(jiàn)數(shù)團(tuán)異型細(xì)胞（見(jiàn)圖1B）；胸水細(xì)胞HE涂片結(jié)果顯示，37個(gè)陽(yáng)性，4個(gè)陰性，癌細(xì)胞鑒定敏感性為90.2%，假陰性率為9.8%；胸水細(xì)胞蠟塊結(jié)果顯示，41個(gè)陽(yáng)性，0個(gè)陰性，癌細(xì)胞鑒定敏感性為100%，假陰性率為0，4個(gè)不一致。見(jiàn)表2。

圖1 胸水細(xì)胞涂片及胸水細(xì)胞蠟塊癌細(xì)胞HE染色結(jié)果

表2 MPE細(xì)胞蠟塊和細(xì)胞涂片癌細(xì)胞比較（n=41，例）

2.2 突變檢測(cè)比較及ARMS檢測(cè)結(jié)果 MPE細(xì)胞涂片EGFR突變、ALK及ROS1融合檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性患者29例，陰性患者12例，突變率為70.7%；MPE細(xì)胞蠟塊EGFR、ALK及ROS1基因突變檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性30例，陰性11例，陽(yáng)性率為73.2%。其中，MPE細(xì)胞蠟塊樣本中有28例EGFR突變，突變率為68.3%（28/41）；1例ALK融合，融合基因檢出率為2.4%（1/41）；2例ROS1融合，融合基因檢出率為4.9%（2/41）。MPE細(xì)胞涂片樣本中有25例EGFR突變，突變率為61.0%（25/41）；3例ALK融合，融合基因檢出率為7.3%（3/41）；6例ROS1融合，融合基因檢出率為14.6%（6/41），見(jiàn)表3。

表3 MPE細(xì)胞蠟塊和涂片中EGFR突變、ALK及ROS1融合狀態(tài)比較（n=41，例）

2.3 預(yù)后比較 41例LUAD患者預(yù)后結(jié)果顯示，相比EGFR/ALK/ROS1未突變陰性患者，胸水細(xì)胞涂片及胸水細(xì)胞蠟塊的EGFR/ALK/ROS1突變陽(yáng)性患者的總生存率顯著增加（HR=0.35，P=0.020；HR=0.11，P＜0.001；見(jiàn)圖2A、圖2B），無(wú)進(jìn)展生存率也顯著增加（HR=0.25，P=0.005；HR=0.19，P=0.002；見(jiàn)圖2C、圖2D）。

圖2 胸水細(xì)胞涂片及胸水細(xì)胞蠟塊中EGFR/ALK/ROS1 突變患者預(yù)后比較分析

2.4 治療效果比較 MPE細(xì)胞涂片EGFR/ALK/ROS1突變陽(yáng)性的29 例患者中，治療后疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）的患者有15例，部分緩解（partial response,PR）或病變穩(wěn)定（stable disease,SD）的患者有13例，其余1例未復(fù)查CT導(dǎo)致無(wú)法評(píng)估治療效果，因此，疾病控制率（disease control rate,DCR）為46.43%（13/28）；12例EGFR/ALK/ROS1未突變陰性患者中，PD的患者有5例，PR或SD的患者有4 例，3 例患者無(wú)法評(píng)估治療效果，DCR為44.44%（4/9），見(jiàn)表4。

表4 MPE細(xì)胞涂片突變狀態(tài)（n=41，例）

MPE細(xì)胞蠟塊EGFR/ALK/ROS1突變陽(yáng)性的30例患者中，治療后PD的患者有15例，PR或SD的患者有13 例，其余2 例未復(fù)查CT導(dǎo)致無(wú)法評(píng)估治療效果，因此，DCR為46.43%（13/28）；11例EGFR/ALK/ROS1未突變陰性患者中，PD的患者有5例，PR或SD的患者有4例，2例患者無(wú)法評(píng)估治療效果，DCR為44.44%（4/9），見(jiàn)表5。

表5 MPE細(xì)胞蠟塊突變狀態(tài)（n=41，例）

3 討論

NSCLC靶向治療的快速發(fā)展使得優(yōu)化和實(shí)施用于分子檢測(cè)的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本成為當(dāng)務(wù)之急。多達(dá)70%的NSCLC患者被診斷為晚期，通常無(wú)法進(jìn)行組織活檢[7]。盡管細(xì)胞學(xué)樣本為分子檢測(cè)提供了高質(zhì)量的材料，但分子細(xì)胞病理學(xué)尚未廣為人知或廣泛使用。MPE是腫瘤診斷的主要手段，具有更少的侵入性和重復(fù)性，部分可在原位灶前被發(fā)現(xiàn)，是臨床檢查中一個(gè)潛在的候選者，對(duì)于肺癌患者精準(zhǔn)診斷、分子檢測(cè)、預(yù)后分析、個(gè)性化治療有非常重要的意義。研究表明，細(xì)胞涂片的在常規(guī)分子檢測(cè)方面優(yōu)于組織活檢[7]：①細(xì)胞涂片可以風(fēng)干或在乙醇中固定；②簡(jiǎn)單、快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估；③DNA易于提取，即使長(zhǎng)時(shí)間存檔也能提供高質(zhì)量的DNA。然而，細(xì)胞涂片不均勻、細(xì)胞量較少及背景顏色深容易造成誤診，并且無(wú)法進(jìn)行免疫組化進(jìn)行復(fù)診。與胸水細(xì)胞涂片相比，胸水細(xì)胞蠟塊切片不僅能提供較多樣本且容易保存，可以進(jìn)行HE染色及免疫組化，對(duì)于腫瘤診斷更為準(zhǔn)確。本研究結(jié)果顯示MPE腫瘤細(xì)胞蠟塊診斷提高了細(xì)胞涂片診斷陽(yáng)性率，應(yīng)用價(jià)值更高，這與之前研究[8]結(jié)果類似。因此，如果有足夠的MPE可用，腫瘤學(xué)家可以嘗試細(xì)胞蠟塊分析。

同時(shí)，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)是應(yīng)用分子分型來(lái)為癌癥患者提供準(zhǔn)確的診斷和個(gè)性化的治療策略。本研究也發(fā)現(xiàn)，MPE細(xì)胞蠟塊EGFR突變率（68.3%）高于涂片EGFR突變率（61.0%），優(yōu)于之前文獻(xiàn)報(bào)道的54.5%與55%[8-9]；MPE細(xì)胞蠟塊ALK融合基因檢出率（2.4%）和ROS1融合基因檢出率（4.9%）分別低于細(xì)胞涂片ALK融合基因檢出率（7.3%）及ROS1融合基因檢出率（14.6%），但是與其他研究相比，ALK融合基因檢出率低于之前文獻(xiàn)報(bào)道的9.1%與11.9%，而ROS1融合基因檢出率高于其他文獻(xiàn)報(bào)道的4.5%與2.6%[9-11]，這可能是由于樣本量低，腫瘤異質(zhì)性、檢測(cè)試劑盒不一樣導(dǎo)致的。最后，本研究結(jié)果表明，與EGFR/ALK/ROS1未突變LUAD患者相比，MPE細(xì)胞涂片與MPE細(xì)胞蠟塊中EGFR突變、ALK融合與ROS1融合的LUAD患者的總生存率、無(wú)進(jìn)展生存率顯著增加，這可能是由于突變患者可以通過(guò)靶向治療獲益，這與之前的研究類似：發(fā)生融合突變患者比未發(fā)生融合的患者具有更好的治療反應(yīng)[12]。同時(shí)，41例LUAD患者接受治療后，發(fā)現(xiàn)EGFR/ALK/ROS1突變的LUAD患者的DCR較高于未突變的野生型患者，這也是EGFR/ALK/ROS1突變LUAD患者預(yù)后更好的原因，與之前研究報(bào)道的類似：HER2突變LUAD患者化療后的DCR均高于HER2野生型患者[13]。因此，本研究也進(jìn)一步說(shuō)明化療或靶向治療對(duì)于EGFR/ALK/ROS1突變LUAD患者具有更大的臨床獲益。

綜上所述，雖然MPE胸水細(xì)胞也會(huì)存在局限性，但是腫瘤細(xì)胞蠟塊作為侵入性較小且可重復(fù)的替代標(biāo)本可用于病理診斷及分子檢測(cè)。