孟偉陽，吳芳芳，金燦，陳大慶

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 急診醫(yī)學科，浙江 溫州 325203

糖氧剝奪再灌注損傷（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）是創(chuàng)傷性顱腦損傷進展的重要機制之一。線粒體對于維持細胞生長發(fā)育、細胞穩(wěn)態(tài)、維護正常能量代謝、細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定起著重要作用。線粒體損傷后內(nèi)皮細胞的通透性增加、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞、ATP產(chǎn)生障礙，隨著線粒體膜破裂，凋亡蛋白被釋放到胞質(zhì)中，激活凋亡信號通路導(dǎo)致細胞死亡[1-3]。因此，有效地保護線粒體功能能夠減少OGD/R損傷后的內(nèi)皮細胞凋亡。自噬在細胞生長發(fā)育、分化增殖、穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。自噬能夠清除損傷的細胞器和蛋白質(zhì)促進內(nèi)皮細胞存活，且自噬會造成細胞過度的自我消化導(dǎo)致自噬性死亡[4]。研究表明OGD/R損傷后能夠?qū)е伦允伤斤@著上升。PENG等[5]發(fā)現(xiàn)抑制ATG3基因能夠抑制自噬，減輕OGD/R損傷后腦微血管內(nèi)皮細胞的損傷，也能減少OGD/R損傷后炎癥反應(yīng)。LI等[6]發(fā)現(xiàn)使用雷帕霉素或碳酸鋰激活自噬后能夠修復(fù)OGD/R損傷后腦微血管內(nèi)皮細胞的屏障。銅-二乙酰-2（N4-甲基氨基硫脲）[copper-diacetyl-2（N4-methylthiosemicarourea），Cu-ATSM]，因其能夠在缺氧的組織中聚集的特點被作為正電子發(fā)射斷層顯像劑，應(yīng)用于檢測各種缺血性疾病，如心肌缺血、腦卒中、腫瘤等[7-9]。有研究表明Cu-ATSM具有改善帕金森動物模型的運動和認知功能，減少黑質(zhì)細胞的丟失，增加多巴胺代謝等作用[10]，但至今仍鮮見報道其對OGD/R損傷后內(nèi)皮細胞的保護作用。本研究擬探討Cu-ATSM對內(nèi)皮細胞OGD/R損傷后線粒體功能的保護作用及其潛在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞處理及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs，h055，上海Sciencell公司）使用高糖完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。待細胞密度長至80%～90%時，使用0.02% EDTA的胰酶消化細胞進行鋪板后分別按照對照組（Control組），糖氧剝奪再灌注模型組（OGD/R組）、給藥組（OGD/R+Cu-ATSM組）進行相應(yīng)的處理。OGD/R模型是當細胞密度達到70%～80%時將培養(yǎng)基換成HBSS溶液，隨后將細胞放置0.2% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后復(fù)糖復(fù)氧12 h。OGD/R+Cu-ATSM組提前2 h給予Cu-ATSM 1 μmol/L，Control組細胞完全培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱36 h，間隔30 min觀察細胞形態(tài)。

1.2 藥品及試劑 Cu-ATSM（68341-09-3）購于上海默克有限公司，CCK-8（C0037）試劑、JC-1（C2006）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MitoTracker?Red線粒體紅色熒光探針（40741ES50）購于上海翊圣生物科技有限公司，ATG5（12994T）、Beclin1（3495T）、LC3I/II（12741T）均購于美國CST公司。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將HUVECs（5×105個細胞/孔）鋪板于6 孔板中，各組進行相應(yīng)處理后，使用PBS洗滌，2 000 r/min離心10 min，5 μL V-FITC黑暗中孵育15 min。在流式分析前將5 μL碘化丙啶加入管中。使用BD FACS Calibur流式細胞儀（購于美國BD公司）進行流式細胞術(shù)分析，并通過Flowjo軟件進行分析。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 線粒體膜電位測定 細胞長滿后，按照5×105個細胞/孔的密度將HUVECs懸液加入到共聚焦培養(yǎng)皿中，進行相應(yīng)的實驗處理后加入適量的JC-1染色工作液，37 ℃，孵育20 min，然后用JC-1染色緩沖液（×1）洗滌后加入適量細胞培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡采集相應(yīng)的圖像。各組實驗重復(fù)3次。

1.5 線粒體形態(tài)染色 以5×105個細胞/孔的密度將HUVECs細胞懸液鋪到6孔板中，進行相應(yīng)的處理后，加入含有MitoTracker?Red工作液的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，避光孵育30 min后，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液常溫固定30 min，PBS清洗，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS清洗，含有DAPI的抗熒光猝滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡采集相應(yīng)的圖像。各組實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測自噬相關(guān)信號通路 提取各組蛋白運用BCA法測定蛋白濃度，配置上樣總量為40 μg的蛋白體系，-20 ℃保存。選取12%的凝膠體系進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍跑至底部時，結(jié)束電泳。取出凝膠，PVDF用甲醇活化后，300 mA，90 min進行電轉(zhuǎn)。隨后進行5%脫脂牛奶中，室溫搖床封閉90 min。4 ℃搖床過夜孵育一抗，隨后孵二抗，最后采用曝光機曝光相應(yīng)的條帶，使用Image Lab 5.2分析各自的灰度值。各組實驗重復(fù)3次。

1.7 細胞熒光檢測 以5×105個細胞/孔的密度將HUVECs懸液鋪到6孔板中，進行相應(yīng)的處理后，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液常溫固定30 min，PBS清洗，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS清洗，5% BSA封閉，37 ℃，30 min，相應(yīng)一抗4 ℃過夜，PBST清洗，相應(yīng)二抗37 ℃避光敷育1 h，PBST清洗，含有DAPI的抗熒光猝滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡采集相應(yīng)的圖像。各組實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs的凋亡情況比較 與Control組比，OGD/R組損傷后HUVECs凋亡細胞數(shù)目明顯增多，而OGD/R+Cu-ATSM組HUVECs凋亡細胞數(shù)目減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組HUVECs的凋亡情況

2.2 各組線粒體染色及其膜電位的情況比較Control組線粒體形態(tài)以細絲狀為主，而OGD/R組損傷后線粒體形態(tài)從高度相互連接的細絲狀線粒體變成點狀，而OGD/R+Cu-ATSM組處理后線粒體重新恢復(fù)成線狀，比較各組絲狀線粒體數(shù)量，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2。各組HUVECs進行JC-1染色測定膜電位，Control組的線粒體染色以紅色為主，提示線粒體為聚集體，OGD/R組損傷后JC-1染色主要以單體（綠色）的形態(tài)存在，即Control組的聚集體（紅色）轉(zhuǎn)化為單體（綠色），線粒體膜電位下降，提示線粒體損傷；OGD/R+Cu-ATSM組JC-1染色主要以聚集體（紅色）的形態(tài)存在，即OGD/R組單體（綠色）到聚集體（紅色）轉(zhuǎn)化，提示線粒體損傷好轉(zhuǎn)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 Mito-tracker檢測各組處理后線粒體染色情況

圖3 JC-1檢測各組處理后線粒體膜電位情況

2.3 各組自噬相關(guān)蛋白的表達情況比較 與Control組比，OGD/R組損傷后HUVECs中的ATG5、Beclin1、LC3II蛋白表達量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而OGD/R+Cu-ATSM組治療后這些蛋白的表達量較OGD/R組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4A-D。與Control組比，OGD/R組LC3II蛋白表達增多，表現(xiàn)為胞漿處綠色熒光增多，而OGD/R+Cu-ATSM組LC3II蛋白表達減少，胞漿處綠色熒光減少，見圖4E。

圖4 Western blot檢測各組處理后ATG5、Beclin1、LC3II的表達情況

3 討論

腦缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷性顱腦損傷的重要發(fā)病機制之一[11]。腦微血管內(nèi)皮細胞在缺血再灌注損傷后細胞間的連接蛋白受到破壞，血腦屏障開放造成有害物質(zhì)進入腦組織導(dǎo)致繼發(fā)性損傷[12]。與此同時，有研究表明創(chuàng)傷性顱腦損傷急性期細胞的凋亡數(shù)目與患者的神經(jīng)功能的恢復(fù)有關(guān)[12]。因此，早期有效抑制內(nèi)皮細胞凋亡是治療創(chuàng)傷性顱腦損傷重要手段。本研究采用OGD/R模擬腦缺血再灌注損傷，采用HUVECs模擬血腦屏障中的人腦微血管內(nèi)皮細胞。

線粒體作為胞內(nèi)重要的細胞器之一，在能量代謝、電子的傳遞、細胞穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[13]。近年來，線粒體功能的研究是缺血再灌注損傷的熱點之一。腦缺血再灌注損傷后線粒體功能障礙，線粒體膜電位紊亂，能量產(chǎn)生減少，鈣離子超載，活性氧釋放等最終都會導(dǎo)致凋亡信號通路激活從而造成細胞的凋亡[14]。因此，保護線粒體功能是減少缺血再灌注損傷后細胞凋亡的重要途徑之一。

線粒體功能的紊亂會誘發(fā)細胞發(fā)生自噬清除受損的細胞器，而OGD/R損傷后自噬水平的升高與神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)[14]。自噬又稱為II型程序性細胞死亡，指在饑餓、缺氧、衰老等應(yīng)激情況下細胞依賴溶酶體降解、選擇性清除再循環(huán)利用受損或老化的細胞器。越來越多的研究表明自噬在腦損傷中扮演著重要的角色，適度的自噬在一定程度上促進細胞的存活，維持細胞穩(wěn)態(tài)，而過度的自噬會激活TRAIL導(dǎo)致自噬性細胞死亡[15]。研究表明在腦損傷后，神經(jīng)元中出現(xiàn)典型的自噬性壞死，主要表現(xiàn)為GFP-LC3II和p62免疫熒光的增多[16]。XIE等[17]發(fā)現(xiàn)在新生兒小鼠腦損傷模型中，ATG7 基因敲除后，其神經(jīng)元的凋亡減少。Cu-ATSM最早作為乏氧顯像劑，近年來的研究也越來越廣泛[8]。YOSHII等[18]研究發(fā)現(xiàn)64Cu-ATSM能夠抑制U87MG膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤的生長并延長了生存期。HUNG等[10]研究發(fā)現(xiàn)Cu-ATSM能夠減少ONOO-2誘導(dǎo)損傷的α-突觸核蛋白聚集從而改善帕金森模型的認知功能。本研究探討了Cu-ATSM對OGD/R損傷后HUVECs的作用。

研究發(fā)現(xiàn)Cu-ATSM能夠通過保護線粒體形態(tài)，維持線粒體膜電位，從而減少HUVECs細胞凋亡。Mito-tracker染色結(jié)果顯示Cu-ATSM能夠使OGD/R損傷后的點狀線粒體重新恢復(fù)成絲帶狀，JC-1染色結(jié)果顯示Cu-ATSM能夠使得線粒體從OGD/R損傷后的單體到聚集體轉(zhuǎn)化，維持線粒體膜電位。流式細胞結(jié)果顯示Cu-ATSM能夠大大減少OGD/R損傷后的內(nèi)皮細胞凋亡。由此可見，Cu-ATSM能夠通過保護線粒體功能從而減少內(nèi)皮細胞的凋亡。XU等[19]發(fā)現(xiàn)NaHS能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制OGD/R損傷后的自噬水平從而保護線粒體功能穩(wěn)定。JU等[20]發(fā)現(xiàn)葫蘆素I能夠通過抑制自噬水平的激活減少OGD/R損傷后的氧化應(yīng)激水平從而減少神經(jīng)元凋亡。本研究Western blot結(jié)果顯示Cu-ATSM能夠降低OGD/R損傷后自噬相關(guān)蛋白如ATG5、Beclin1、LC3II的表達。因此，得出結(jié)論Cu-ATSM能夠減少OGD/R損傷內(nèi)皮細胞的凋亡，并且以上作用極有可能是通過抑制損傷后的自噬水平導(dǎo)致的。當然本研究也有很有不足之處，尚未引用自噬激活劑或自噬抑制劑反向驗證結(jié)果自噬是否為其潛在機制，并未深入討論氧化應(yīng)激、炎癥、PI3K/Akt通路、Nrf2通路等水平的變化，尚未從動物模型中驗證藥物的治療效果等，均有待后續(xù)進一步研究。