鄭淑文，黃慧靜，陳國(guó)，麻浩群，錢建暢，張倩雯

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）是肺癌中惡性程度較高的類型，約占所有肺癌病例的15%，具有極高的增殖率、強(qiáng)烈的早期轉(zhuǎn)移傾向和不良預(yù)后，患者5年平均生存率不超過10%[1-2]。目前，以鉑類和依托泊苷為基礎(chǔ)的化療仍是SCLC一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，盡管大部分患者在化療初期應(yīng)答良好，但大多會(huì)在一年內(nèi)出現(xiàn)耐藥復(fù)發(fā)，臨床亟需新的治療藥物和干預(yù)策略。cyy-287為本課題組新合成的嘧啶-2，4-二胺衍生物（見圖1），為小分子多靶點(diǎn)激酶抑制劑，前期研究發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤中有良好的抗腫瘤活性[3]。另通過藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cyy-287在肺組織中選擇性較高，且在EGFR突變非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中具有良好的抗腫瘤活性，顯著抑制其在體內(nèi)外的生長(zhǎng)、遷移并逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[4]。本研究探索了cyy-287與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinase,CDK）抑制劑roscovitine聯(lián)用對(duì)SCLC的抑制作用，以期為SCLC的臨床治療提供新的方案。

圖1 cyy-287的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 材料 SBC-2細(xì)胞購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。cyy-287由本實(shí)驗(yàn)室自行合成，純度≥98%，并通過1H NMR、13C NMR、電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）和高分辨率質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry,HRMS）等方法驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。順鉑（dichlorodiammineplatinum,DDP）、ABT-199和roscovitine購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司，MTS試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司，碘化丙啶染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。CL-PARP、P-AKT、AKT和GAPDH抗體從美國(guó)CST公司購(gòu)買。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制：精密稱取適量的cyy-287、多西他賽、BCL-2抑制劑ABT-199和roscovitine樣品，加入一定體積的二甲基亞砜（DMSO），制備濃度為20 mmol/L的儲(chǔ)備液。精密稱取適量的DDP樣品，加入一定體積的ddH2O，制備濃度為3 mmol/L的儲(chǔ)備液。渦旋混合均勻后分裝，保存于-80 ℃冰箱備用，并于使用前稀釋。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：SBC-2 細(xì)胞使用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（加入10%的FBS，含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉），置于37 ℃，5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增速率確定傳代倍數(shù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：SBC-2細(xì)胞分為DMSO（對(duì)照）組、roscovitine（20 μmol/L）組、cyy-287組（1.5 μmol/L）和cyy-287（1.5 μmol/L）+roscovitine（20 μmol/L）組。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)定和藥物聯(lián)合指數(shù)（combination index,CI）：將細(xì)胞接種在96孔板（5%～10%密度）中，并用不同濃度的cyy-287和DDP（60、20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.027 μmol/L）處理48 h后，棄掉上清液，每孔加入100 μL MTS工作液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1～2 h。待顏色達(dá)到合適深度，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（加藥組細(xì)胞A均值-空白對(duì)照組A均值）/（陰性對(duì)照組A均值-空白對(duì)照組A均值）×100%。為了獲得CI，操作同上，另增加多西他賽（docetaxel,DTX）、BCL-2抑制劑ABT-199和roscovitine單用組，以及分別和cyy-287 的合用組（比例為1∶1）。選取5個(gè)濃度（2.220、0.740、0.250、0.082、0.027 μmol/L）進(jìn)行CI計(jì)算，并使用Compusyn軟件分析CI，當(dāng)CI＜1時(shí)表明協(xié)同作用，當(dāng)CI＞1時(shí)表明拮抗作用。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以800個(gè)/孔的密度接種在12孔板中，然后用不同濃度的藥物處理8 d。細(xì)胞集落用4%多聚甲醛固定20 min，用0.5%結(jié)晶紫溶液（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）染色30 min。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡：將細(xì)胞接種在6孔板（20%～25%密度）中，并用不同藥物處理24 h。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。對(duì)于細(xì)胞周期，首先收集細(xì)胞并在4 ℃下用70%乙醇固定24 h。使用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌兩次后加入碘化丙啶（propidium iodide,PI,50 μg/mL）室溫避光染色10 min。使用BD-FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)并分析細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡比例。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：將細(xì)胞接種在12孔板（20%～25%密度）中，并用不同藥物處理24 h。使用NuPAGE LDS裂解緩沖液（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）收集蛋白樣品，并進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用±s表示；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cyy-287對(duì)SCLC細(xì)胞SBC-2生長(zhǎng)的作用 以DDP為陽性對(duì)照，通過MTS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cyy-287對(duì)SBC-2細(xì)胞的IC50為（1.77±0.10）μmol/L，與DDP的IC50值（1.47±0.26）μmol/L相近（見圖2A）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與DMSO組比，梯度濃度的cyy-287雖然可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但比例均小于15%；而在同等濃度（3 μmol/L）下，單獨(dú)使用cyy-287（14.88%）或DDP（10.3%）的凋亡細(xì)胞比例相近（見圖2B）。這表明cyy-287對(duì)SBC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用相對(duì)較差，與DDP對(duì)SCLC的抗腫瘤效果相當(dāng)。

圖2 cyy-287對(duì)SBC-2細(xì)胞的抑制作用

2.2 cyy-287與roscovitine的協(xié)同效應(yīng) 通過分析CI，發(fā)現(xiàn)cyy-287與常用的抗肺癌化療藥物DTX和BCL-2抑制劑ABT-199等并不存在協(xié)同抗腫瘤作用，但cyy-287與CDK抑制劑roscovitine合用的CI＜1，提示兩者間存在協(xié)同效應(yīng)（見圖3）。

圖3 cyy-287與roscovitine協(xié)同效應(yīng)CI值圖

2.3 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞增殖的影響 通過克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與cyy-287組比，cyy-287+roscovitine組可顯著抑制SBC-2細(xì)胞的克隆形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。表明cyy-287 與roscovitine聯(lián)用確實(shí)可以有效抑制SBC-2的增殖。

圖4 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞增殖的影響

2.4 cyy-287 與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2 細(xì)胞周期的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)分析了cyy-287 與roscovitine單用或聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞周期的影響，與DMSO組比，roscovitine組和cyy-287組輕度增加G2/M期細(xì)胞，而cyy-287+roscovitine組顯著增加G2/M期細(xì)胞，S期細(xì)胞減少，見圖5；提示cyy-287與roscovitine聯(lián)用可誘導(dǎo)SBC-2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

圖5 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞周期分布的影響

2.5 cyy-287與roscovitine聯(lián)用誘導(dǎo)SBC-2細(xì)胞凋亡情況 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cyy-287與roscovitine單用或聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞凋亡的影響，與DMSO組比，roscovitine組和cyy-287 組SBC-2 細(xì)胞發(fā)生凋亡的較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而roscovitine+cyy-287組凋亡的SBC-2細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。提示cyy-287與roscovitine聯(lián)用可顯著誘導(dǎo)SBC-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖6 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞凋亡的影響

2.6 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞AKT活化的影響 與cyy-287組比，cyy-287+roscovitine組SBC-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白CL-PARP的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與roscovitine組比，cyy-287+roscovitine組AKT的磷酸化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。這提示cyy-287主要通過抑制AKT的活化，從而與roscovitine發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，抑制SBC-2細(xì)胞的存活，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

圖7 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對(duì)SBC-2細(xì)胞CL-PARP蛋白表達(dá)和AKT磷酸化的影響

3 討論

約70%的SCLC患者在確診時(shí)就已出現(xiàn)胸腔以外的轉(zhuǎn)移，也稱廣泛期SCLC，該類患者中位生存時(shí)間僅為8～13個(gè)月，5年生存率不到2%[5-6]。然而，SCLC的生物分型尚不成熟，盡管經(jīng)過了30多年的努力和探索，SCLC臨床治療的研究進(jìn)展依舊十分有限。SCLC的靶向治療僅有我國(guó)原研的小分子多靶點(diǎn)抗血管藥物安羅替尼獲批用于進(jìn)展或復(fù)發(fā)SCLC患者的三線治療[7-8]。雖然免疫抑制劑如阿特珠單抗等與傳統(tǒng)化療藥物相關(guān)的聯(lián)合治療方案已成為廣泛期SCLC的一線治療標(biāo)準(zhǔn)之一，但與其他實(shí)體瘤比，阻斷PD-1對(duì)SCLC患者生存率的總體改善并不明顯，僅有少數(shù)患者在免疫治療中獲益[9-11]。因此，臨床亟需尋找SCLC治療的新策略，開發(fā)出新的可用于臨床替代的治療藥物。

cyy-287作為一種新型的可口服的抗腫瘤小分子抑制劑[3]，雖然在骨肉瘤和NSCLC中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，但本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)SBC-2細(xì)胞的體外抑制效果僅與DDP相當(dāng)，對(duì)SCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖抑制作用有限，提示單獨(dú)使用cyy-287可能無法有效抑制SCLC生長(zhǎng)。SCLC作為一種高侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其臨床治療往往采用聯(lián)合用藥的手段[12]。因此，嘗試通過聯(lián)合用藥篩選，探索新的可用于抑制SCLC的干預(yù)手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK抑制劑roscovitine與cyy-287具有協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)，而活性研究結(jié)果也顯示，兩藥聯(lián)合可有效抑制SBC-2細(xì)胞的增殖，使其細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡。這些研究結(jié)果表明兩者聯(lián)合對(duì)SBC-2細(xì)胞具有良好的體外抑制效果。

細(xì)胞周期失調(diào)是腫瘤的重要特征之一，而CDK對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。目前，已有超過40多種CDK抑制劑用于抗腫瘤藥物研發(fā)，其中roscovitine作為多靶點(diǎn)的CDK抑制劑，廣泛用于基礎(chǔ)研究和疾病研究[13]。roscovitine主要通過直接競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制CDK，它能夠有效抑制CDK1、CDK2、CDK5和CDK7，但對(duì)CDK4和CDK6的抑制效果較差[14]。作為一種可口服的小分子CDK抑制劑，roscovitine在包括骨肉瘤[15]、多發(fā)性骨髓瘤[16]和前列腺癌[17]等多種惡性腫瘤中發(fā)揮較好的抗腫瘤活性。同時(shí)，通過單一療法或聯(lián)合療法，roscovitine也在NSCLC、鼻咽癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中開展II期臨床試驗(yàn)研究[18]。一系列的研究表明，該藥可以做為腫瘤治療的潛在藥物。但本研究結(jié)果表明roscovitine對(duì)SBC-2細(xì)胞的抑制效果十分有限，并不能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；說明單獨(dú)使用roscovitine對(duì)SCLC抗腫瘤作用并不明顯。

本研究結(jié)果表明，通過將cyy287與roscovitine相結(jié)合不僅能夠顯著抑制SBC-2的克隆形成，還可以明顯增加凋亡細(xì)胞的比例，提示兩者具有良好的協(xié)同抗腫瘤作用。兩者均為可口服的小分子化合物，后續(xù)如果有類似化合物進(jìn)入臨床研究，通過將兩類藥物聯(lián)合，或許會(huì)發(fā)揮出更好的抗腫瘤活性，有可能成為SCLC治療的潛在方案。