王思文劉權(quán)殷奎德

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

中國是食用豆的主要生產(chǎn)國和進出口國，主要種植有綠豆、紅小豆、豌豆等[1]。干旱是影響食用豆產(chǎn)量與品質(zhì)的主要自然災(zāi)害，不僅會損壞葉片的光合系統(tǒng)，還會降低抗氧化酶活性、產(chǎn)生氧化損傷，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植株死亡。因此，在干旱過程中采取相應(yīng)的調(diào)控技術(shù)和措施提高植株的抗旱性，對食用豆的實際生產(chǎn)具有重要意義。

蛋白激發(fā)子作為生物源激發(fā)子，能夠通過信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物生長代謝，進而提高植物的抗逆能力，促進植物生長[2，3]。以往研究中，蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的抗性，不僅限于病蟲害等生物脅迫，還包含干旱、鹽堿、低溫等非生物脅迫[4-8]。AMEP蛋白是本實驗室從枯草芽孢桿菌中分離鑒定的新型蛋白激發(fā)子[9]。前期研究表明，AMEP蛋白能夠引發(fā)植物的過敏反應(yīng)，激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，提高植物體內(nèi)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達，進而提高植物對病害的抗性[10]。然而，關(guān)于該AMEP蛋白在植物抗旱性方面的研究還未見報道。

為了驗證AMEP蛋白對植物抗旱性的提升作用，本試驗以綠豆和紅小豆為材料，研究干旱脅迫下AMEP蛋白處理對其植株生物量、光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及抗氧化酶活性的影響，以期為AMEP蛋白在提高食用豆抗旱性的理論和技術(shù)方面提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試綠豆、紅小豆品種分別為中綠4號、冀紅16號。蛋白激發(fā)子AMEP濃度為0.05 mg/mL。

1.2 試驗設(shè)計與方法

分別選擇飽滿且大小均一的綠豆和紅小豆種子，用5%次氯酸鈉浸泡消毒20 min，再用蒸餾水沖洗3次。于2021年6月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)雜糧中心室內(nèi)采用土培盆栽方式進行試驗。打孔塑料盆上口徑9.0 cm，下口徑5.5 cm，高17.5 cm。

試驗采用水分控制法(參照馬春業(yè)等[11]的方法)設(shè)置3個處理:正常水分處理(CK，土壤含水量的75%～80%)、干旱處理(DS，土壤含水量的40%～50%)及干旱＋蛋白處理(ADS)。每盆種植5株，每個處理重復(fù)3次。前期水分管理一致，幼苗期(兩葉一心)開始控水處理并同時噴施AMEP，每天傍晚用土壤稱重法[12]測定土壤含水量，并根據(jù)測定結(jié)果補充水分到試驗設(shè)定水平?？厮幚砉策M行5天，隨之取樣測定農(nóng)藝性狀。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀 取出植株洗凈后用卷尺測量綠豆、紅小豆株高，用根系掃描儀(方科植物根系分析儀FK-G101)測定根長、根表面積。將植株分為地上部和地下部，采用直接測量法稱其鮮重，重復(fù)3次，每個重復(fù)4株。

1.3.2 葉綠素相對含量 在取樣前一天上午10時左右，采用Minolta SPAD 502便攜式葉綠素儀測定倒三葉的葉綠素相對含量(SPAD值)。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 在取樣前一天上午10時左右，采用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(FMS-2，Hansatech，England)測定倒三葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)(初始熒光Fo、最大熒光產(chǎn)量Fm)，取平均值。

1.3.4 光合參數(shù) 在取樣前一天上午10時左右，采用Li-6400便攜式光合作用測定儀(Li-6400，美國)測定第二片葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間二氧化碳濃度(Ci)。

1.3.5 抗氧化酶指標(biāo) 取綠豆、紅小豆倒三葉速凍于液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。待樣品全部收集完畢后，采用紫外吸收法[13]測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，愈創(chuàng)木酚法[14]測定過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，NBT光還原法[15]測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2013整理數(shù)據(jù)，SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下AMEP蛋白對綠豆和紅小豆植株生長特性的影響

從圖1可以看出，噴施AMEP蛋白后兩種食用豆的萎蔫程度相對減輕，干旱產(chǎn)生的脅迫也明顯緩解。與正常供水(CK)相比，干旱脅迫下兩種食用豆的株高、地上地下部生物量均有所降低。

圖1 干旱脅迫下AMEP蛋白對綠豆(A)和紅小豆(B)植株形態(tài)的影響

由表1可以看出，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白處理(ADS)綠豆和紅小豆株高均顯著低于CK，分別降低18.72%和19.20%，但較DS株高增長60.70%和43.32%。ADS處理兩種食用豆的單株地上部生物量較DS分別增加21.35%和84.58%，單株地下部生物量較DS分別增加212.36%和89.36%，均達到顯著水平。說明干旱脅迫下噴施AMEP蛋白會顯著提高兩種食用豆幼苗的株高、地上地下部生物量。

表1 干旱脅迫下AMEP蛋白對植株生長的影響

干旱脅迫下綠豆幼苗根長和根表面積比CK分別降低25.39%、27.49%，紅小豆比CK分別降低16.13%、26.62%；ADS處理綠豆和紅小豆根長比DS分別增加61.89%、51.03%(P＜0.05)，根表面積比DS分別增加70.21%、72.87%(P＜0.05)。說明干旱脅迫顯著抑制兩種食用豆幼苗根系生長，干旱條件下噴施AMEP蛋白可顯著促進兩種食用豆根系生長，有效緩解干旱脅迫造成的抑制作用。

2.2 干旱脅迫下AMEP蛋白對綠豆和紅小豆葉片葉綠素相對含量及熒光參數(shù)的影響

圖2顯示，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白處理(ADS)綠豆和紅小豆幼苗期葉片SPAD值分別較DS提高17.53%和37.31%。方差分析可知，AMEP蛋白對紅小豆葉綠素含量影響顯著，且對紅小豆的調(diào)控效果優(yōu)于綠豆，ADS與DS處理間差異均達顯著水平。

圖2 干旱脅迫下AMEP蛋白對葉片葉綠素相對含量的影響

由表2可以看出，干旱脅迫使綠豆和紅小豆光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)潛在活性(Fv/Fo)下降，綠豆降幅最大，較CK下降47.29%，紅小豆較CK下降29.78%；ADS與DS處理相比綠豆和紅小豆幼苗的Fv/Fo增加顯著，分別增62.95%和23.42%。干旱脅迫下，綠豆和紅小豆幼苗葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)也呈下降趨勢(P＜0.05)，其中紅小豆降幅最大，比CK下降43.04%，綠豆降幅較小，下降25.27%；干旱脅迫下噴施AMEP蛋白后綠豆和紅小豆幼苗的Fv/Fm分別較DS處理提高19.72%和33.34%。這表明噴施AMEP蛋白后綠豆和紅小豆幼苗在干旱脅迫下仍具有較高的光合電子傳遞活性，說明光合器官把所捕獲的光能可以有效地轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)能。

表2 干旱脅迫下AMEP蛋白對葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

綜上可知，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白能顯著促進兩種食用豆葉片葉綠素含量和光合電子傳遞活性。

2.3 干旱脅迫下AMEP蛋白對綠豆和紅小豆光合作用的影響

由圖3可知，與DS處理相比，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白(ADS)顯著提高兩種食用豆幼苗葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)，且對紅小豆Pn和Tr的作用效果均優(yōu)于綠豆，紅小豆Pn和Tr較DS處理分別提高37.67%和32.89%，綠豆Pn和Tr較DS處理分別提高21.71%和20.85%。綠豆和紅小豆ADS處理的胞間CO2濃度(Ci)均高于DS，且均達顯著水平。說明AMEP蛋白可有效調(diào)控兩種食用豆的光合參數(shù)、促進光合作用，從而提高抗旱性。

圖3 干旱脅迫下AMEP蛋白對葉片光合參數(shù)的影響

2.4 干旱脅迫下AMEP蛋白對綠豆和紅小豆抗氧化酶活性的影響

作為植物抗旱性的重要保護酶，SOD、POD和CAT可清除植物體內(nèi)具有潛在危害的O2·-和H2O2，對于防御植物體內(nèi)ROS傷害、清除活性氧、最大限度地減少-OH·的形成有著重要作用[16，17]。由圖4可知，干旱脅迫下兩種食用豆葉片SOD、POD和CAT活性均顯著降低。相比DS處理，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白(ADS)綠豆和紅小豆幼苗葉片SOD活性均顯著增強，綠豆增幅達44.40%；POD活性也顯著增強，分別增加56.49%和46.08%；紅小豆CAT活性增幅最大，為DS處理的1.75倍。說明干旱脅迫使綠豆和紅小豆幼苗抗氧化酶活性降低，噴施AMEP蛋白可使兩種食用豆幼苗抗氧化酶活性升高，從而緩解葉片細胞受干旱損傷的程度。

圖4 干旱脅迫下AMEP蛋白對葉片SOD、POD及CAT活性的影響

3 討論

在干旱脅迫下，植物生長變慢，其形態(tài)指標(biāo)發(fā)生顯著變化，變化的程度與植物的抗旱能力密切相關(guān)[18]。隨著土壤含水量的減少，干旱脅迫下光合產(chǎn)物優(yōu)先分配給根系，使得根系生長加快，地上部受到抑制[19]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫降低綠豆和紅小豆的株高，而噴施AMEP蛋白顯著促進根系生長，利于根系下扎尋求水源而吸收更多水分，從而增強植株的抗旱能力。

光合作用是植物進行有機物合成積累的過程[20]，而葉綠素是反映葉片生理活性變化的重要指標(biāo)之一[21]。干旱脅迫下噴施AMEP蛋白可提高綠豆和紅小豆幼苗期葉片的Pn、Gs、Tr和Ci，說明AMEP蛋白可通過關(guān)閉氣孔來降低葉片蒸騰，還促進兩種食用豆葉綠素含量積累。由此可知，AMEP蛋白能通過調(diào)控葉片各光合指標(biāo)，進而增強兩種食用豆的光合能力。

葉綠素?zé)晒饪煽焖贆z測植株在干旱脅迫下的實際光合作用情況，其變化可以反映環(huán)境對植物的影響[22]。Fv/Fm和Fv/Fo分別反映PSⅡ的最大光化學(xué)效率和潛在活性，該參數(shù)不受物種和生長條件的影響，在非脅迫條件下變化極小，而脅迫條件下明顯下降[23]。本研究中，干旱脅迫下綠豆和紅小豆的Fv/Fm和Fv/Fo值均出現(xiàn)不同程度的降低，表明干旱脅迫影響PSⅡ捕獲激發(fā)能的效率和光合作用的原初反應(yīng)，造成PSⅡ反應(yīng)中心的部分失活和功能喪失，且隨著脅迫程度的增大下降趨勢更加明顯。干旱脅迫下AMEP蛋白處理(ADS)綠豆和紅小豆的Fv/Fm和Fv/Fo達到最大值，顯著高于干旱處理(DS)。這說明干旱脅迫下噴施AMEP蛋白可提高綠豆和紅小豆葉片PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)活性，減少干旱脅迫對PSⅡ的損傷程度，以維持光合作用的正常進行。

干旱在減少作物體內(nèi)水分、阻礙正常代謝的同時，還會引起氧化脅迫，包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、過氧化自由基(ROO·)和(-OH·)等在內(nèi)的活性氧(ROS)物質(zhì)的產(chǎn)生，使其引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[24]。抗氧化酶系統(tǒng)是植物最重要的活性氧清除系統(tǒng)，其中SOD將O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2在POD、CAT的催化下轉(zhuǎn)化為水和分子氧[25]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下AMEP蛋白處理(ADS)兩種食用豆的SOD、POD和CAT活性均高于干旱處理(DS)，說明噴施AMEP蛋白能及時有效地清除綠豆和紅小豆幼苗體內(nèi)過多的超氧陰離子及其歧化產(chǎn)物，從而減輕植株受損程度，提高植株抗旱性。

4 結(jié)論

本研究中，與干旱處理(DS)相比，干旱脅迫下噴施AMEP蛋白(ADS處理)可提高綠豆和紅小豆幼苗期植株的株高、根長、根表面積和生物量，提高兩種食用豆葉片的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)，增加兩種食用豆葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)，促進兩種食用豆葉片葉綠素含量積累，進而增強兩種食用豆的光合作用能力。噴施AMEP蛋白還可提高干旱脅迫下兩種食用豆葉片的抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化作用。綜之，噴施AMEP蛋白可以提高干旱脅迫下綠豆和紅小豆幼苗的抗旱性，具備進一步開發(fā)應(yīng)用的潛力。