陳峰姜艷芳焦曉真張華朱文銀姜明松徐建第

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.中國(guó)水稻研究所，浙江 杭州 311401；3.郯城縣精華種業(yè)有限公司，山東 郯城 276000)

直鏈淀粉含量是決定稻米食味品質(zhì)的重要性狀，由顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)催化合成，主要受蠟質(zhì)基因(Waxy，Wx)控制[1]。糯稻是指直鏈淀粉含量低于2.0%的水稻品種，糯米是制造粘性小吃、甜品和釀造甜米酒的主要原料，是一種重要的特色水稻類型[2]。

基因組編輯技術(shù)是指通過序列特異核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向修飾的技術(shù)，主要原理是通過SSNs特異切割DNA靶位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)自身的損傷修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定向編輯。基因編輯技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性技術(shù)，成為水稻遺傳育種研究的重要手段[3]。傳統(tǒng)水稻品種改良主要是通過雜交、回交的方式將目標(biāo)基因?qū)胧荏w品種，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合，育種周期長(zhǎng)，效率較低。而利用基因組編輯技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾，克服傳統(tǒng)育種中的連鎖累贅，會(huì)大大提高育種效率。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年發(fā)展迅速的高效、準(zhǔn)確、便捷的基因組編輯技術(shù)。周鑫等[4]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)哈勃601的Wx基因進(jìn)行定向突變，獲得了糯性哈勃601材料。汪秉琨等[5]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻W(wǎng)x基因，獲得了低直鏈淀粉含量的楚粳27突變體材料。馮璇等[6]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因組編輯，培育出糯稻不育系WX209A。黃李春等[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯Wx基因創(chuàng)制了8種淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)略區(qū)別于傳統(tǒng)糯稻的新型糯稻種質(zhì)。范美英等[8]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)改良優(yōu)質(zhì)粳稻秀水134，獲得了糯稻新材料。目前，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改良黃淮粳稻品種品質(zhì)的研究報(bào)道較少。圣稻22是山東省水稻研究所培育的粳稻品種，具有優(yōu)質(zhì)、抗病、豐產(chǎn)性好、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯圣稻22的Wx基因位點(diǎn)，以期得到直鏈淀粉含量下降的糯稻種質(zhì)，為糯稻育種提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料種植及性狀調(diào)查

本試驗(yàn)選用的受體品種為山東省水稻研究所選育的粳稻品種圣稻22，該品種具有株型優(yōu)良、抗性好、灌漿快、熟相好、出米率高等優(yōu)點(diǎn)?；谑サ?2獲得的Waxy位點(diǎn)編輯材料于2020年6月至2021年12月種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所植物生長(zhǎng)室。

按照《國(guó)家水稻品種試驗(yàn)觀察記載項(xiàng)目、方法標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行生育期、株高、有效穗、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀調(diào)查。

1.2 基因敲除載體信息

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞、CRISPR/Cas9載體由上海分生生物科技有限公司提供。使用的基因編輯載體為pRice-KO1(圖1)，載體中OsU6用于啟動(dòng)sgRNA表達(dá)，玉米泛素基因啟動(dòng)子UBI用于啟動(dòng)Cas9表達(dá)。

圖1 基因敲除載體pRice-KO1信息

1.3 靶位點(diǎn)的選擇、sgRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

利用在線軟件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)[10]，在Wx基因(Os060133000)的第1外顯子設(shè)計(jì)引物的靶序列(GCATGAACGTCGTGTTCGT)，該靶序列GC含量為55%，特異性好(圖2)。

圖2 靶位點(diǎn)在Wx基因的位置信息(綠色箭頭指向的黃色框位置為靶序列)

根據(jù)所用敲除載體pRice-KO1的接頭序列，合成引物 sgRNA-F(5′-GTGTGGCATGAACGTCGTGTTCGT-3′)、sgRNA-R(5′-AAACACGAACACGACGTTCATGCC-3′)；將包含10 μmol/L sgRNA-F 1μL、10μmol/L sgRNA-R 1 μL、重蒸水8μL的PCR體系置于PCR儀上，于95℃溫育10 min使引物變性，然后以每秒0.1℃的變幅逐漸降低到20℃，使引物形成雙鏈。然后與經(jīng)BsaⅠ酶切的pRice-KO1按照正常的酶切連接流程進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Top10，挑取抗性菌落用通用引物M13F和sgRNA-R進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的克隆提質(zhì)粒后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2020年3月，載體構(gòu)建成功后由上海分生生物科技有限公司通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化步驟主要包括愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染、抗性愈傷組織的篩選、抗性愈傷組織的分化及生根等，最終獲得T0代苗[11]。

1.5 突變位點(diǎn)和無標(biāo)記突變后代檢測(cè)

CTAB法提取T0代轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA[12]，設(shè)計(jì)特異性引物Waxy-D-F/Waxy-D-R(表1)，擴(kuò)增sgRNA靶向位點(diǎn)序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工生物工程有限公司通過常規(guī)Sanger法進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過Geneious軟件進(jìn)行分析。

將T0代苗種植于溫室中并收獲種子，將種子種植后獲得T1代苗。CTAB法提取的T1代單株幼葉DNA，以pRice-KO1載體特異引物M13F/KO1-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系15μL:模板DNA 1μL、M13F引物1μL、KO1-R引物1 μL，2×Master Mix 7.5μL(南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供)、ddH2O 4.5μL。PCR反應(yīng)條件為95℃5 min；95℃25 s，55℃30 s，72℃30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)基因載體分離情況，獲得無標(biāo)記突變后代。所用引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用引物信息

1.6 直鏈淀粉含量測(cè)定

2020年10月，蠟熟期收獲T0代種子，晾干至14.5%含水量，用日本凱特Kett實(shí)驗(yàn)用小型精米機(jī)加工成精米，用Retch-MM400型打樣機(jī)將精米打成米粉，過100目篩后用于直鏈淀粉含量測(cè)定。

稻米直鏈淀粉含量在揚(yáng)州大學(xué)植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，測(cè)定方法參照黃李春等[7]的方法，RVA譜特征值的測(cè)定參照郭濤等[13]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代材料突變頻率與類型

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Wx基因敲除載體轉(zhuǎn)入受體材料后，共獲得T0代獨(dú)立株系20株(命名為C721-1—C721-20)。測(cè)序結(jié)果表明，共有16株發(fā)生突變，突變率為80%，其中純合及雙等位突變株4株(通過在線分析軟件DSDecodeM分析，http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)；突變類型包括堿基缺失、插入等。部分株系的測(cè)序峰圖見圖3。

圖3 部分T0代Wx基因敲除株系測(cè)序峰圖

2.2 突變體直鏈淀粉含量和淀粉粘滯性譜測(cè)定

16個(gè)T0代突變株系中，有3個(gè)株系長(zhǎng)勢(shì)弱未收到種子，其余13個(gè)株系均收獲種子且具有明顯的糯稻表型，部分株系的稻米外觀見圖4。選7個(gè)結(jié)實(shí)正常、長(zhǎng)勢(shì)良好的株系，收獲種子用于直鏈淀粉含量和RVA譜特征值測(cè)定，結(jié)果(表2)顯示，C721-4、C721-11、C721-12直鏈淀粉含量降至2.0%以下，達(dá)到糯稻品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；另4個(gè)株系直鏈淀粉含量在2.10%～3.51%之間，也均顯著低于野生型；稻米R(shí)VA譜特征值中的最高粘度、熱漿粘度、冷膠粘度、回復(fù)值均明顯低于對(duì)照品種。

表2 對(duì)照與T0代突變株系直鏈淀粉含量及RVA譜特征值

圖4 部分T0代Wx基因敲除株系稻米外觀

2.3 T1代轉(zhuǎn)基因載體檢測(cè)和無標(biāo)記突變單株的選擇

提取T1代單株幼葉DNA，以基因編輯載體特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，能擴(kuò)增出載體序列的為陽(yáng)性(含載體序列)，不能擴(kuò)增出載體序列的為陰性(無載體序列)，共檢測(cè)T1代240株，其中陽(yáng)性單株208株，不含載體序列的單株32株(圖5)。

圖5 部分T1代基因編輯單株載體序列PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 T1代突變株系的農(nóng)藝性狀鑒定

對(duì)32株不含標(biāo)記序列的T1代突變單株進(jìn)行農(nóng)藝性狀考查和糙米外觀品質(zhì)檢測(cè)，其中10個(gè)T1代突變單株的抽穗期、株高、穗長(zhǎng)、千粒重等與圣稻22相似，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，糙米外觀品質(zhì)檢測(cè)均為糯米表型(表3)。

表3 部分T1代株系農(nóng)藝性狀與糙米外觀表現(xiàn)鑒定

3 討論與結(jié)論

我國(guó)科學(xué)家在水稻遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)領(lǐng)域已取得矚目成就，發(fā)掘克隆出多個(gè)水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性重要功能基因，為開展水稻分子設(shè)計(jì)育種奠定了基礎(chǔ)?；蚪M編輯技術(shù)是研究基因功能和生物體改造的重要工具。CRISPR/Cas系通過一段向?qū)NA和配套的核酸酶就可對(duì)特定的基因組序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，具有簡(jiǎn)單高效、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)，受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于玉米、小麥和水稻等作物改良[14-22]。

直鏈淀粉含量與稻米品質(zhì)直接相關(guān)，Wx基因是控制水稻直鏈淀粉合成的主效基因，通過對(duì)Wx基因定點(diǎn)編輯可以獲得穩(wěn)定遺傳、直鏈淀粉含量適宜的突變體。周鑫等[4]在Wx基因的第2、7、8、10、11、12外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)6個(gè)靶位點(diǎn)，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體，通過基因編輯粳稻品種哈勃601，獲得5份純合T2突變體，直鏈淀粉含量由親本的15.5%降至2.0%～2.6%，接近或達(dá)到糯稻水平。汪秉琨等[5]構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體pGK03-Wx-gRNA(靶點(diǎn)1和2分別在Wx基因第1和第2外顯子)，利用工程菌EHA105遺傳轉(zhuǎn)化超級(jí)稻楚粳27，稻米直鏈淀粉含量從17.5%降到1.93%。黃李春等[7]編輯Wx基因編碼的GBSSI蛋白C末端非關(guān)鍵位點(diǎn)(Wx基因第12和第13外顯子)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行編輯粳稻品種日本晴，直鏈淀粉含量從野生型的16.79%下降到3.69%～4.44%。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以Wx基因(靶點(diǎn)位于第1外顯子)為編輯對(duì)象構(gòu)建敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)粳稻品種圣稻22，共獲得T0代獨(dú)立株系20株，測(cè)序結(jié)果表明16個(gè)株系實(shí)現(xiàn)了對(duì)Wx基因的定點(diǎn)編輯，突變率為80%，純合及雙等位率為20%；T0代稻米外觀品質(zhì)檢測(cè)表明13個(gè)株系外觀呈現(xiàn)糯稻表型，直鏈淀粉含量測(cè)定表明有3個(gè)株系的直鏈淀粉含量降至2.0%以下。

綜上，利用CRISPR/Cas9對(duì)Wx基因進(jìn)行定向突變可以快速改良品種的直鏈淀粉含量目標(biāo)性狀，獲得糯性水稻材料，在水稻品種的定向改良方面具有巨大的應(yīng)用潛力。但在利用該技術(shù)培育新品種時(shí)，需要選擇適當(dāng)?shù)陌形稽c(diǎn)并培育較多的突變體，才能從中選到符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的糯稻品種。另外本研究?jī)H對(duì)T0代和T1代進(jìn)行了遺傳分析及表型鑒定，后續(xù)可對(duì)T2代株系進(jìn)行進(jìn)一步的基因型與表型鑒定，以獲得穩(wěn)定遺傳、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的糯性種質(zhì)。