李澤鳳向南星魏春梅李新藝孟丹晨黃海泉黃美娟

(西南林業(yè)大學園林園藝學院/國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術工程研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術工程研究中心/西南林業(yè)大學園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224)

植物木質(zhì)化是指木質(zhì)素形成并沉積在細胞壁中的一種生物學過程[1，2]，一般在次生細胞壁中發(fā)生，且木質(zhì)素與植物的進化歷程緊密相關，這可能對植物從水生環(huán)境登陸到陸地環(huán)境生活發(fā)揮著關鍵作用[3]。較高的木質(zhì)化程度不僅可以提高植物的抗旱性[4]，而且能提高植物的觀賞價值。木質(zhì)素是細胞壁的重要組分之一，主要在細胞次生壁中沉積，如導管、纖維和表皮等[5]，具有硬度強、不溶水性以及不易被降解的化學特性，在植物生長和發(fā)育過程中起機械支撐作用，也是植物防御的屏障和水分運輸所必需的[6-8]。關于木質(zhì)素的合成調(diào)控已有研究表明，MYB46可直接對木質(zhì)素途徑進行調(diào)控[9]；小麥中的TaMYB[10]以及玉米中的ZmMYB46和ZmMYB31等[11]基因參與了調(diào)控木質(zhì)素的生物合成；火炬松(Pinus taedaL.)中的MYB4[12]能與木質(zhì)素合成基因的啟動子區(qū)的AC元件結合；桉樹(Eucalyptus grandis)中的MYB2會下調(diào)結構基因CCR的表達[13]，推測會抑制木質(zhì)素的生物合成；除此之外，AtWRKY12可與NST2的啟動子區(qū)域結合，進而負調(diào)控植物細胞中木質(zhì)素的表達[14]。MYB、NAC和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子都參與了木質(zhì)素的表達調(diào)控，但尤以MYB轉(zhuǎn)錄因子報道得最多。

按照MYB結構域數(shù)目，MYB類轉(zhuǎn)錄因子被分為R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB以及4R的MYB[15]。已有眾多研究表明MYB4的N端具有特定的R2、R3結構域，因此可以推測其屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。在木質(zhì)素合成調(diào)控網(wǎng)絡中，郭亞玉等[16]認為SND1S作用于MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子，還可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來調(diào)控木質(zhì)素的合成。MYB4轉(zhuǎn)錄因子通過參與木質(zhì)素的調(diào)控過程而影響植物木質(zhì)部細胞壁的加厚，如在轉(zhuǎn)BpMYB4基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株中木質(zhì)素含量降低，因此BpMYB4可作為木質(zhì)素生物合成的抑制因子[17]；Shen等[18]研究表明，在煙草和柳枝稷中過表達PvMYB4基因，木質(zhì)素含量顯著減少，從而影響其生長發(fā)育質(zhì)量；擬南芥的MYB4轉(zhuǎn)錄因子會抑制木質(zhì)素的合成，其同源基因MYB32和MYB7則負調(diào)控木質(zhì)素的相關合成途徑[19，20]。由此可見MYB4轉(zhuǎn)錄因子在植物中的過表達可能負調(diào)控植物木質(zhì)素的合成，進而影響植物的木質(zhì)化程度及次生細胞壁加厚。

鳳仙花屬植物具有經(jīng)濟、藥用、觀賞和園藝價值[21]。綠萼鳳仙花(Impatiens chlorosepala)是鳳仙花科(Balsaminaceae)鳳仙花屬(Impatiens)的一年或多年生植物，生于山谷水旁陰處或疏林溪旁，其花形奇特，花淡黃色或橘黃色，低矮，分枝能力強，莖肉質(zhì)實心。綠萼鳳仙花觀賞價值極高，可以作為園林地被植物予以開發(fā)。木質(zhì)素含量能影響植株木質(zhì)化程度，木質(zhì)化程度高的植物株型挺拔、抗逆性強、觀賞價值高。迄今為止，國內(nèi)外尚未見有關綠萼鳳仙花木質(zhì)素調(diào)控基因MYB4的相關報道。

本研究克隆了綠萼鳳仙花MYB4基因，并對其序列進行相關分析；在此基礎上，采用qRTPCR探究其在綠萼鳳仙花不同部位的表達模式，進而探究MYB4基因在木質(zhì)素合成過程中的功能和作用，以期為進一步研究綠萼鳳仙花中MYB4基因在木質(zhì)素合成中的分子機制提供理論支持，并為后期增加鳳仙花木質(zhì)化程度及品種改良提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠萼鳳仙花于2020年7月種植于西南林業(yè)大學樹木園溫室大棚，2021年10月取其生長健壯的根尖、地上5 cm的莖基部及從上往下第四片成熟葉。

試劑材料:RNA提取試劑盒(OMEGA)、凝膠回收試劑盒(昆明碩陽科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(昆明云科生物技術有限公司)、DH5α菌株(TAKARA)、pMD19-T載體(TAKARA)等。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與MYB4基因的克隆 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取綠萼鳳仙花根、莖和葉的總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。使用課題組已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對綠萼鳳仙花MYB4基因設計特異性引物，詳見表1。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一鏈為模板進行擴增，擴增體系(50μL):10×Easy TaqBuffer(Mg2＋)6μL，dNTP 4μL，Easy TaqDNA Polymerase 0.5μL，上下游引物各2.5μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 32μL。擴增程序:95℃5 min；95℃50 s，55℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。對目的片段進行回收并純化后克隆連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，挑選陽性克隆進行驗證、測序。

表1 綠萼鳳仙花MYB4基因cDNA序列擴增引物

1.2.2MYB4基因序列分析 運用ExPasy-Prot-Param軟件對MYB4基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析；利用CDD工具對目的基因的結構域進行預測；使用BLAST功能找出與綠萼鳳仙花MYB4基因同源性相對較高的其他植物的氨基酸序列，通過DNAMAN軟件完成相關序列的同源性分析，并使用MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3MYB4基因表達模式分析 將綠萼鳳仙花根、莖和葉3個部位的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并稀釋10倍備用。設計qRT-PCR引物(表2)，qRTPCR擴增體系(20μL):qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，ddH2O 8.2μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 1μL。擴增程序:95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃1 min，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。內(nèi)參基因為IcActin，每個樣品3個重復，并將根定義為1個單位作為對照，采用2-△△Ct對目的基因在根、莖和葉3個部位的相對表達量進行計算，利用SPSS對其進行顯著性分析。

表2 綠萼鳳仙花MYB4基因qRT-PCR擴增引物

2 結果與分析

2.1 綠萼鳳仙花MYB4基因的克隆

通過PCR擴增，獲得IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3基因全長cDNA序列，分別為666、888、771 bp(圖1)，編碼221、295、256 aa。將其cDNA序列與基因組gDNA比較發(fā)現(xiàn)，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3基因組序列均在ATG下游263 bp處含有長度分別為83、107、117 bp的內(nèi)含子。

圖1 綠萼鳳仙花MYB4基因PCR擴增結果

2.2 綠萼鳳仙花MYB4基因的序列結構分析

綠萼鳳仙花MYB4基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析結果(表3)表明，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3的不穩(wěn)定指數(shù)均高于40，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水指數(shù)為負值，屬于親水性蛋白。通過CDD工具分析結果表明，3個MYB4蛋白均屬于MYB超家族蛋白成員，具特有的SANT結構域和穩(wěn)定的PLN03091結構域(圖2)。

表3 綠萼鳳仙花MYB4蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

圖2 綠萼鳳仙花MYB4蛋白質(zhì)的保守結構域

2.3 綠萼鳳仙花MYB4基因的同源性及系統(tǒng)進化分析

對綠萼鳳仙花及其他物種MYB4基因的氨基酸序列進行分析，結果表明，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3與其他物種的相似性在62%左右(圖3)。N端存在保守的R2和R3 DNA結合結構域，同源性較高；C端同源性相對較低，且同時具有抑制型的保守基序EAR。系統(tǒng)親緣關系結果(圖4)表明，進化樹分為兩大分支，IcMYB4-1和IcMYB4-2處于一個分支，推測其可能為直系同源關系，而IcMYB4-3與前兩者分屬兩個分支，推測其可能為旁系同源關系。

圖3 MYB4基因的同源氨基酸序列比對

圖4 基于綠萼鳳仙花MYB4基因氨基酸序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 綠萼鳳仙花MYB4基因的表達分析

研究發(fā)現(xiàn)，3個IcMYB4基因在綠萼鳳仙花的3個不同部位(根、莖和葉)均有表達(圖5)。以根為參照，IcMYB4-1在綠萼鳳仙花不同部位的表達均為最低，表現(xiàn)為在根中最多，葉次之，莖最少；IcMYB4-2和IcMYB4-3基因在綠萼鳳仙花不同部位的表達趨勢一致，表現(xiàn)為在根、莖和葉中依次升高。在綠萼鳳仙花的3個不同部位中，根木質(zhì)化程度相對較高，含木質(zhì)素較多，而葉含木質(zhì)素較少，推測IcMYB4-1基因可能對綠萼鳳仙花木質(zhì)素合成起正調(diào)控作用，而IcMYB4-2和IcMYB4-3對綠萼鳳仙花的木質(zhì)素合成起負調(diào)控作用。

圖5 MYB4基因在綠萼鳳仙花3個不同部位的表達模式分析

3 討論與結論

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的整個生長過程及其響應生物和非生物脅迫的過程[22]。在MYB家族中，R2R3-MYB蛋白在木質(zhì)素合成及次生壁增厚等方面發(fā)揮著重要作用[23，24]。本研究從綠萼鳳仙花中成功克隆了木質(zhì)素合成相關轉(zhuǎn)錄因子IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3，cDNA全長分別為666、888、771 bp，編碼221、295、256 aa，均屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，與李嘉哲等[25]在山新楊中的研究結果一致；且都含有一個內(nèi)含子，與趙佳等[26]對月季花青素相關R2R3-MYB蛋白的研究結果一致。3個MYB4蛋白均屬于MYB超家族蛋白成員，含有MYB家族R2和R3的DNA結合結構域，在N端同源性較高，C端差異較大，并且存在保守抑制型基序EAR[27]，與已有研究結果一致[28]；IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3與其他物種MYB4基因的氨基酸序列同源性在62%左右。上述研究均證明在各物種之間MYB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結構域是高度保守的[29]。系統(tǒng)進化分析表明IcMYB4-1和IcMYB4-2處于一個分支，推測其可能為直系同源關系；而IcMYB4-3與前兩者分屬不同分支，因此推測可能為旁系同源關系。

已有研究表明，MYB4基因在不同植物中的拷貝數(shù)不同，且在大多數(shù)植物的各個部位均有表達；即使在同一物種，不同部位的表達量也具有顯著差異。例如在茶樹兩個MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能驗證中，CsMYB4-5與CsMYB4-6都在根中表達量較高，在莖中表達量較低[30]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3在綠萼鳳仙花的3個部位均有表達；其中，IcMYB4-1的表達量在根中最多，莖和葉的表達量較少，與李嘉哲等[25]的研究結果一致；IcMYB4-2和IcMYB4-3的表達趨勢一致，均為在葉中最多，莖次之，根最少，與對當歸MYB4轉(zhuǎn)錄因子的研究結果一致[31]。以上結果表明，MYB4轉(zhuǎn)錄因子在不同植物甚至是同一植物的不同部位中可能發(fā)揮著不一樣的功能和作用。

有研究證明小麥的TaMYB4轉(zhuǎn)錄因子在煙草中異源過表達時，其總木質(zhì)素含量下降[10]；象草PpMYB4基因在煙草中過表達時，轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量顯著低于野生型[13]。這些研究表明MYB4基因在木質(zhì)素的合成調(diào)控中起到了抑制作用。在山新楊中PdPapMYB4在木質(zhì)化莖中大量表達，遠高于幼莖[25]，說明MYB4基因可能在不同植物中對木質(zhì)素的調(diào)控作用不同。IcMYB4基因在綠萼鳳仙花的木質(zhì)素合成調(diào)控中起到了重要的作用，但其具體調(diào)控機制和功能還需進一步驗證。