周 震，王貞禎，魏 勇，解津剛，馬忠全，彭夏雨*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 832003；2.新疆天潤乳業(yè) 830000；3.新疆天潤建融牧業(yè) 843015）

近年來，在國家和各級地方政府奶業(yè)振興計劃的推動下，全國奶業(yè)發(fā)展取得了可喜的成就?！?020中國奶業(yè)質(zhì)量報告》顯示，2019年中，我國全國奶產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)到3297.6萬t，位于全球第四位，其中規(guī)?；膛稣冀^對主導(dǎo)地位。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國規(guī)模牛場數(shù)量已超過4000個，規(guī)模牛場存欄荷斯坦奶牛達(dá)550萬頭，占中國奶牛存欄量的76%[1]。我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)雖然取得了長足的發(fā)展，但是，群體生產(chǎn)水平和效益與世界發(fā)達(dá)國家相比還存在一定的差距，尤其是育種方面還存在單產(chǎn)水平低﹑育種水平低﹑良種數(shù)量少﹑良種覆蓋率低等方面的問題。奶牛生產(chǎn)力性狀中產(chǎn)奶性狀是最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，受微效多基因控制，是奶牛選育的重要方向。作為數(shù)量性狀，受環(huán)境和遺傳雙重影響，近年來的研究表明，泌乳相關(guān)激素如催乳素﹑雌激素﹑生長激素等對產(chǎn)奶性狀有著較大的影響[2]，而其中催乳素作為泌乳直接相關(guān)激素，其基因表達(dá)模式和分泌對產(chǎn)奶性狀有重要作用。

催乳素是由垂體分泌的一種多肽類激素，它具有啟動和維持泌乳，促進(jìn)乳腺和性腺發(fā)育的功能。在牛上，催乳素基因位于23號常染色體上，長度為8616bp，編碼區(qū)大小690bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。其指導(dǎo)合成的催乳素經(jīng)垂體釋放入血后，與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，激活JAK2/STAT5信號傳導(dǎo)通路，啟動泌乳[3]。周國利等[4]對奶牛PRL基因外顯子3的RsaⅠ位點進(jìn)行酶切分型，結(jié)合產(chǎn)奶性狀來看可以得出，AB的產(chǎn)奶性狀略高于AA。O?UZKAN S B[5]研究了催乳素基因外顯子3的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢測種群處于哈代－溫伯格平衡狀態(tài)。本研究以新疆南疆某地區(qū)中國荷斯坦奶牛為材料，采用PCR-SSCP方法對催乳素基因外顯子3進(jìn)行研究，并結(jié)合生產(chǎn)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，以期為南疆地區(qū)奶牛分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血液樣本的采集

選取高產(chǎn)（產(chǎn)奶量≥9000kg）﹑中產(chǎn)（6000kg≤產(chǎn)奶量＜9000kg）﹑低產(chǎn)（產(chǎn)奶量＜6000kg）奶牛共428頭擁有完整產(chǎn)奶周期﹑2～4胎次的中國荷斯坦奶牛，其中高產(chǎn)253頭﹑中產(chǎn)136頭﹑低產(chǎn)42頭，對其進(jìn)行尾根靜脈采血3mL，肝素鈉抗凝，-20℃保存?zhèn)溆?，同時針對上述牛只進(jìn)行血清的收集，-20℃冷凍保存。

血液全基因組提取試劑盒﹑PCR-Mix預(yù)混液均購自北京天根生物股份有限公司；引物由上海生工生物有限責(zé)任公司合成；牛血清催乳素含量Elisa檢測試劑盒購自晶美生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 DHI生產(chǎn)性能的收集

收集所研究428頭奶牛的近6個月DHI測定結(jié)果，并使用Excel表格進(jìn)行整理和分型。

1.2 方法

1.2.1 血液全基因組DNA的提取

使用天根血液全基因組提取試劑盒進(jìn)行血液總DNA的提取，并使用TE溶解至100μL，于-20℃冷凍備用。

1.2.2 引物的設(shè)計與PCR反應(yīng)

參考NCBI上的牛催乳素基因序列，使用Primer 5 對牛催乳素基因外顯子3進(jìn)行引物的設(shè)計，引物設(shè)計如下：

F: 5’-CAAACAACCCTAAACGAAT-3’

R: 5’-GAAAACCCGGATAAAAG-3’

PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各0.4μL﹑模板1μL﹑mix 7.5μL﹑水6.2μL，共15.5μL；反應(yīng)條件：94℃變性5min，94℃變性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸45s，反應(yīng)設(shè)置35個循環(huán)，最后4℃保存，擴(kuò)增目的片段大小為172bp。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的變性以及非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳

取2.5μL PCR產(chǎn)物和8μL變性劑混合，95℃變性15min，取出后立即放入-20℃冰箱中備用。

配置8%聚丙烯酰胺凝膠（37.5:1），取37.5:1的丙烯酰胺制膠液26.6mL﹑5×TBE 20mL﹑水52.7mL﹑10%AP1.4mL﹑TEMED 150μL（以上試劑均購自上海生工生物公司），混合均勻后迅速倒入制膠板中，排除空氣插上點樣梳，靜置1h后取上一步的PCR變形產(chǎn)物10μL點樣，于120V電壓電泳12h后，經(jīng)固定染色和顯影后置于燈上觀察并記錄，相關(guān)固定染色液以及顯影液如表1所示。

表1 固定染色液配方

表2 顯影液配方

1.2.4 牛血清催乳素含量的檢測

按所購Elisa檢測試劑盒（購自晶美生物技術(shù)有限公司）說明書的要求進(jìn)行操作。

1.2.5 DNA測序與序列分析

挑選不同基因型的DNA樣本送往上海派森諾生物公司進(jìn)行測序，并使用DNAMAN軟件針對測序結(jié)果進(jìn)行比對。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

利用表3軟件對其功能進(jìn)行分析：

表3 生物信息學(xué)功能分析方法表

1.2.7 關(guān)聯(lián)分析

利用excel 2016表格對所收集的產(chǎn)奶相關(guān)形狀進(jìn)行整理，使用SPSS 25.0的獨立樣本T檢驗方法對其進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。數(shù)據(jù)結(jié)果使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對催乳素含量和產(chǎn)奶相關(guān)性狀使用excel 2016進(jìn)行多元線性回歸分析，認(rèn)為R2＞0.6時為高度相關(guān)，R2＜0.4時為低度相關(guān)，認(rèn)為0.4≤R2≤0.6時為中度相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 血液全基因組DNA提取

圖1 血液全基因組DNA提取結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果

所提DNA的260/280OD值均在1.8～2.0之間，且電泳結(jié)果顯示樣本條帶明亮，可以作為PCR反應(yīng)模板使用。

2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，擴(kuò)增目的片段大小為172bp，電泳結(jié)果如圖2。

圖2 牛催乳素基因外顯子3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

產(chǎn)物純凈，無雜帶，引物特異性好，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期，可以進(jìn)行下一步試驗。

2.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

牛催乳素基因外顯子3的PCR變性產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，得到1種基因型。

圖3所示中，序號1-11均為由4個變性條帶構(gòu)成的1種基因型。

圖3 PCR變性產(chǎn)物的非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

2.4 牛催乳素基因型外顯子3的序列分析

經(jīng)PCR-sscp試驗驗證，只得到1種基因型，將所得的PCR產(chǎn)物送往上海派森諾生物公司進(jìn)行測序，并使用DNAMAN以及Chromas軟件針對測序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果如圖4。

圖4 各分組的基因測序套峰圖

如圖4所示，高產(chǎn)組﹑中產(chǎn)組以及低產(chǎn)組的測序結(jié)果顯示，在78bp處均為T，沒有發(fā)生堿基的突變。

2.5 生物信息學(xué)分析

使用在線網(wǎng)站Expasy中的Protparam以及ProtScale功能對其進(jìn)行理化性質(zhì)和蛋白親疏水性的分析，分析結(jié)果如圖5：

圖5 親疏水性分析結(jié)果

PRL蛋白的分子式為C1134H1805N313O343S15，其相對分子量大小為25792.6，理論等電點為5.98，由229個氨基酸組成，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）有27個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg + Lys）有23個。圖5的親疏水性分析結(jié)果顯示，在第100個氨基酸的位置，其疏水性最強(qiáng)，在第110個氨基酸前后親水性達(dá)到最高。

2.6 產(chǎn)奶相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)性分析

2.6.1 各分組產(chǎn)奶相關(guān)形狀的關(guān)聯(lián)分析

將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理匯總?cè)绫?：

表4 各組產(chǎn)奶相關(guān)性狀及其關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

在產(chǎn)奶量方面，高產(chǎn)組和中產(chǎn)組相比較差異極顯著（P＜0.01），高產(chǎn)組和低產(chǎn)組相比差異極顯著（P＜0.01），中產(chǎn)組和低產(chǎn)組相比差異極顯著（P＜0.01）；但是在乳脂率和乳蛋白率方面相比，則結(jié)果均顯示差異不顯著（P＞0.05）。

2.6.2 催乳素含量與產(chǎn)奶相關(guān)性狀的相關(guān)性分析

由表5可以得出，當(dāng)泌乳90d時，催乳素的含量與產(chǎn)奶量﹑乳脂率﹑乳蛋白率的相關(guān)性均較低；當(dāng)泌乳210d時，催乳素的含量與產(chǎn)奶量呈現(xiàn)中度相關(guān)（R2=0.4244），而與乳脂率和乳蛋白率的相關(guān)性較低。

表5 不同泌乳天數(shù)的催乳素含量與產(chǎn)奶相關(guān)性狀的相關(guān)性分析表（R2）

2.6.3 組催乳素含量的關(guān)聯(lián)性分析

表6 各組催乳素含量關(guān)聯(lián)分析表 mIU/L

在針對催乳素含量的比較中，在泌乳90d時，高產(chǎn)組和中產(chǎn)組比較差異不顯著（P>0.05），高產(chǎn)組和低產(chǎn)組比較差異極顯著（P＜0.01），中產(chǎn)組和低產(chǎn)組比較差異顯著（P<0.05）；而在泌乳210d時，高產(chǎn)組和中產(chǎn)組相比較差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

大量研究結(jié)果表明，牛催乳素基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀有關(guān)。BRYM[6]用PCR-SSCP和測序方法在牛催乳素遠(yuǎn)端啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個新的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明，AA基因型牛垂體催乳素基因表達(dá)水平高于GG基因型牛。在對外顯子2的研究中，劉瑞鑫等[7]對44頭娟姍牛的PRL外顯子2和外顯子4進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)基因型組合A2G2A4A4的個體的產(chǎn)奶性狀優(yōu)于其他3種基因型組合的個體，差異顯著（P＜0.05）。這表明了在娟姍牛群體中催乳素基因的突變與產(chǎn)奶性狀具有關(guān)聯(lián)性。

在外顯子3的多態(tài)性的研究中，周國利等[4]對奶牛PRL基因外顯子3的RsaⅠ位點進(jìn)行酶切分型，結(jié)合產(chǎn)奶性狀來看可以得出，AB的產(chǎn)奶性狀略高于AA。O?UZKAN S B[5]研究了催乳素基因外顯子3的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢測種群處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，Singh等[8]研究了PRL內(nèi)含子3和β-球蛋白基因的外顯子4和內(nèi)含子4之間的跨越區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Frieswal奶牛PRL的AA基因型頻率高于AB和BB。PRL中的AA和BB基因型以及BLG中的AB和BB基因型可能更適合于提高產(chǎn)奶量。在本研究中，PRL基因外顯子3不存在多態(tài)性，只存在1種基因型，可能是由于選擇進(jìn)行試驗的南疆該地區(qū)相對封閉，在引入凍精進(jìn)行改良時，父系的選擇較少，引起外顯子3的遺傳較為穩(wěn)定，其變異較少，此外，試驗所選擇牧場低產(chǎn)牛由于淘汰的原因，在本研究中選擇數(shù)量較少，使得群體選擇有誤差，后續(xù)研究需要擴(kuò)大選擇群體范圍，增加分析數(shù)量，對研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步證實。

在本研究中，催乳素的分泌量與產(chǎn)奶相關(guān)性狀相關(guān)度均不強(qiáng)并且在對外顯子3進(jìn)行分型中只得到了1種基因型，但是催乳素的分泌量以及泌乳量仍存在較大差異，這表明其控制泌乳的基因的表達(dá)存在著不同的差異。

在外顯子4和外顯子5的研究中，王麗娟等[9]對第4外顯子8398位點進(jìn)行分析，結(jié)合生產(chǎn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在泌乳Ⅱ期AG基因型的產(chǎn)奶量極顯著高于GG基因型，但是在乳蛋白率和線性評分方面，則是GG基因型顯著高于AG基因型。李崢等[3]研究了荷斯坦奶牛催乳素基因5′側(cè)翼區(qū)調(diào)控序列，結(jié)果顯示，在該序列的906位點處存在突變，該位點多態(tài)對荷斯坦牛的產(chǎn)奶量以及乳脂率均有影響。李吉濤[10]對牛催乳素的5調(diào)控區(qū)針對乳蛋白率進(jìn)行了分析，AA與BB相對比差異極顯著，這二者分別于AB基因型相比較則差異不顯著。另外，在頭胎牛中，并沒有出現(xiàn)AA的基因型，推測是由于樣本過少，后期可擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行補(bǔ)充。除此之外他還對催乳素基因進(jìn)行了酶切分型[11]，3種基因型的產(chǎn)奶量均差異顯著，且BB＞AB＞AA，說明了B為優(yōu)勢基因；在乳蛋白率方面，基因型對其有著極顯著的影響，這說明催乳素基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶性狀有著重要的影響。

在今后的試驗中，可加大樣本的采集檢測數(shù)量，并逐漸增加檢測的位點，可選擇多種方法進(jìn)行檢測，并結(jié)合產(chǎn)奶相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，確定優(yōu)勢基因和符合生產(chǎn)利益的經(jīng)濟(jì)基因，為分子育種提供理論依據(jù)。