趙澤廣，李杰峰，張 寧，楊 威， 趙志強(qiáng)，孫艷玲，徐志媛，李 琴

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 056038；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 071000）

金黃色葡萄球菌是自然界中常見(jiàn)的一種致病菌，無(wú)芽孢﹑鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性，可以引起嚴(yán)重感染[1-2]。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌污染問(wèn)題已經(jīng)成為了世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與人類(lèi)和動(dòng)物健康的重大問(wèn)題。歐盟一些國(guó)家中由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性食物中毒事件占食源性疾病事件的5%[3-4]。我國(guó)金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位。隨著抗生素種類(lèi)越來(lái)越多，使用越來(lái)越頻繁，金黃色葡萄球菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重。蔡霞[5]等人對(duì)2018年7月～2021年3月淮南市某教學(xué)醫(yī)院金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析，結(jié)果顯示在160株金黃色葡萄球菌中有69株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。洪小蘭[6]等在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第910醫(yī)院2015年～2019年臨床標(biāo)本分離的1750株金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)728株MRSA。

生鮮肉在動(dòng)物屠宰﹑運(yùn)輸﹑儲(chǔ)存和售賣(mài)過(guò)程中，由于操作﹑溫度﹑環(huán)境等問(wèn)題，金黃色葡萄球菌污染也很常見(jiàn)。闞浩鵬[7]等人在濟(jì)南各類(lèi)型市場(chǎng)的180份市售生雞肉中檢測(cè)到55株金黃色葡萄球菌。田璐[8]等人以中國(guó)知網(wǎng)2000年～2019年文獻(xiàn)為基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)了生鮮肉微生物污染情況，結(jié)果顯示我國(guó)金黃色葡萄球菌在生鮮肉中檢出率為10.81%。

耐藥基因cfr是能夠介導(dǎo)噁唑烷酮類(lèi)藥物﹑林可酰胺類(lèi)藥物﹑截短側(cè)耳素類(lèi)藥物﹑氯霉素類(lèi)藥物以及鏈陽(yáng)菌素A這五大類(lèi)抗菌藥同時(shí)耐藥的多重耐藥基因[9]。由于cfr可介導(dǎo)惡唑烷酮類(lèi)藥物—治療耐藥陽(yáng)性菌最后一道防線，其已經(jīng)成為抗生素治療的嚴(yán)重威脅[10]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肉樣

2022年采集的保定市售生鮮肉23份，其中豬肉8份，羊肉﹑牛肉4份，雞肉7份。

1.1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯﹑7.5%氯化鈉肉湯﹑血平板﹑Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)﹑亞締酸鹽卵黃增菌液﹑凍干兔血漿均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；比濁管購(gòu)自比克曼生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；快速基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；M5 DL2000 DNA Maker﹑M5 DNA電泳用瓊脂糖﹑2× M5 HiPer HiFi PCR mix均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；TSA（TSB與瓊脂糖比例為4:3）瓊脂為試驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 肉樣處理 無(wú)菌采集適量肉樣于1.5mL離心管中并加入200μL生理鹽水，使用組織研磨器將其研磨至勻漿，再加入500μL生理鹽水，振蕩混勻，8000r/min離心5min。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取上清液接種于7.5%氯化鈉肉湯中。37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)菌分離 將培養(yǎng)的菌液接種于Baird-Parker平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑表面光滑﹑凸起﹑濕潤(rùn)﹑大小為2mm～3mm的具有光澤的灰黑色或黑色并伴有淺色邊緣和不透明圈（沉淀）的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢記錄菌體特征，挑選革蘭氏陽(yáng)性﹑成葡萄串狀排列的球菌接種于血平板，培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑光滑﹑凸起﹑金黃色（白色）﹑具有β溶血特征的菌落凍存，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 生化試驗(yàn) 將凍存的菌株復(fù)蘇后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)物和無(wú)菌生理鹽水分別接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～72 h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.5 血漿凝固酶試驗(yàn) 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5mL于凍干兔血漿，輕輕震蕩混勻，37℃培養(yǎng)，每半個(gè)小時(shí)觀察一次，觀察6 h，凝固則為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 將營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物濃度調(diào)至1.5×108CFU/mL，根據(jù)2021年美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）進(jìn)行種抗生素藥敏試驗(yàn)，判讀結(jié)果。

1.2.7 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)合成引物[11-13]（cfr﹑tetM﹑tetO﹑mecA﹑ermA﹑vanA﹑vanB），用分離菌培養(yǎng)菌液提取DNA進(jìn)行耐藥基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，（94℃1 min，Tm 1 min，72℃ 1 min）×35循環(huán)，72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 金黃色葡萄球菌耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

采集保定市售生鮮肉23份，進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定，結(jié)果顯示有1株從雞肉中分離的細(xì)菌表現(xiàn)出金黃色葡萄球菌典型特征。分離菌在Baird-Parker平板上長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1），表面凸起，光滑濕潤(rùn)，具有光澤，顏色黑色，同時(shí)伴有淺色邊緣和不透明光圈。血平板培養(yǎng)基上菌落較大，表面光滑，白色，凸起并伴有β溶血環(huán)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢（圖2），結(jié)果顯示該分離菌呈葡萄串狀或鏈狀排列的圓形球菌。

圖1 分離菌菌落特征

圖2 分離菌革蘭氏染色

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌可分解葡萄糖﹑麥芽糖﹑乳糖﹑蔗糖﹑精氨酸﹑尿素﹑淀粉，甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，液化明膠，可在高鹽肉湯中生長(zhǎng)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示（表3），該菌只對(duì)萬(wàn)古霉素﹑利奈唑胺敏感，對(duì)頭孢曲松鈉﹑左氧氟沙星﹑卡那霉素中介，對(duì)頭孢噻肟﹑氨芐西林﹑四環(huán)素﹑林可霉素﹑阿奇霉素﹑環(huán)丙沙星耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 耐藥基因cfr檢測(cè)結(jié)果 耐藥基因cfr檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性（圖3），目的條帶為746 bp。

圖3 cfr耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 其他耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 （圖4）顯示，該菌株攜帶耐藥基因tetM，其目的條帶為406 bp。

圖4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)的發(fā)展，食品安全已經(jīng)成為了社會(huì)關(guān)注度較高的問(wèn)題，金黃色葡萄球菌作為食品中第二大致病菌[14]，對(duì)其監(jiān)測(cè)尤為重要。周勇[15]等對(duì)2009年～2018年廣州市即食食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，從1399份食品中分離出157份陽(yáng)性菌株，分離率為11.22%。2015年秦磊[16]等人對(duì)唐山市10個(gè)縣區(qū)不同場(chǎng)所的217份食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，陽(yáng)性率為15.2%。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥性的研究越來(lái)越多，但是對(duì)攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌研究較少，這可能因?yàn)閏fr耐藥基因檢出率較低。

多數(shù)抗生素通過(guò)與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成來(lái)達(dá)到抑菌效果[17]。但是，多重耐藥基因cfr通過(guò)編碼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)23S核糖體RNA的2503位嘌呤殘基進(jìn)行修飾，從而降低抗生素與細(xì)菌核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的親和力，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)某些抗生素產(chǎn)生耐藥性[18]。另外，cfr基因是迄今為止唯一由包括質(zhì)粒在內(nèi)的可移動(dòng)元件介導(dǎo)的惡唑烷酮類(lèi)耐藥基因[19]，然而惡唑烷酮類(lèi)抗生素利奈唑胺作為臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌﹑耐萬(wàn)古霉素腸球菌和耐青霉素肺炎球菌最后一道防線[20]，cfr基因可以使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。因此，攜帶cfr耐藥基因的細(xì)菌傳播對(duì)公共衛(wèi)生安全形成了巨大隱患。cfr 多重耐藥基因陸續(xù)在包括動(dòng)物源和人源的葡萄球菌﹑腸球菌﹑巨型球菌﹑大腸埃希氏菌和變形桿菌等革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌株中均有報(bào)道[21-24]。尤其是在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌中更為常見(jiàn)[18]，且攜帶cfr的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床治療的難度更大[25]。

本研究從保定市售生鮮肉中分離到一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，但是mecA基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明該菌不是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。分離菌對(duì)6種抗生素表現(xiàn)為耐藥，3種抗生素表現(xiàn)為中介，出現(xiàn)了多重耐藥的情況，但是萬(wàn)幸的是該菌對(duì)萬(wàn)古霉素和利奈唑胺敏感。其他耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，分離菌攜帶有tetM耐藥基因，藥敏試驗(yàn)中分離菌對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥，耐藥表型與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從保定市售生鮮肉中分離得到了一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，具有嚴(yán)重的多重耐藥性，且同時(shí)攜帶tetM耐藥基因，本株多重耐藥金黃色葡萄球菌對(duì)生鮮肉市場(chǎng)公共衛(wèi)生安全具有一定風(fēng)險(xiǎn)。