熊菊萍，肖瀅宇，王 穩(wěn)，韓青松，高小龍，李增魁，文 英，仝麗娜*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 810000；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院 325006）

沙門氏菌（Salmonella）為革蘭氏陰性兼厭氧桿菌，屬于腸桿菌科沙門氏菌屬，不形成芽孢﹑多數(shù)無(wú)莢膜﹑多單個(gè)存在[1]。該菌通常寄生在動(dòng)物的腸道中，對(duì)大部分動(dòng)物均有致病性，能引起多種動(dòng)物的沙門氏菌病，癥狀以腹瀉和敗血癥等為主。同時(shí)，沙門氏菌是人類細(xì)菌性食物中毒的主要病原之一，在人醫(yī)﹑獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上具有重要意義[2]。該菌血清型眾多，目前已鑒定出2500多種[3]。常見(jiàn)的雞沙門氏菌病有雞白痢﹑雞傷寒以及雞副傷寒，分別由雞白痢沙門氏菌﹑雞傷寒沙門氏菌和其他具有運(yùn)動(dòng)性的沙門氏菌（主要為腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌）引起。沙門氏菌感染雛雞后，可導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，死亡率較高，感染成雞后，可引起腹膜炎﹑輸卵管炎或造成隱性感染等[4,5]，造成生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)降低，并且該菌可垂直傳播，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大[6]?？股氐膽?yīng)用，不僅有效降低和緩解了畜禽包括沙門氏菌病在內(nèi)的多種細(xì)菌病毒防控的壓力，也起到了促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，然而隨著養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素類藥物的廣泛﹑持續(xù)﹑不合理﹑不規(guī)范使用甚至濫用，使沙門氏菌對(duì)抗生素類藥物的耐藥性越來(lái)越普遍，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)[7,8]。因此，調(diào)查了解沙門氏菌耐藥性狀況，對(duì)指導(dǎo)我省養(yǎng)雞場(chǎng)合理用藥具有重要意義。2020年10月，青海湟源縣某散養(yǎng)雞場(chǎng)部分雛雞發(fā)病，病雞精神沉郁﹑劇烈腹瀉，后期死亡。為確定病雞死亡原因，本研究無(wú)菌采集病死雞臟器病料，分離到一株疑似菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢﹑生化鑒定﹑16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序后，鑒定為沙門氏菌，并對(duì)分離菌進(jìn)行了致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，旨在為本地區(qū)雞沙門氏菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來(lái)自青海省湟源縣某蛋雞場(chǎng)病死雞。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基﹑MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；SS瓊脂﹑細(xì)菌微量生化鑒定管和抗菌藥物藥敏紙片購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒和DL 2000 DNA Maker購(gòu)自天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1周齡SPF雞購(gòu)自寧波純派農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.4 分離培養(yǎng)與鏡檢

采用無(wú)菌操作，將采集的肝臟﹑脾臟樣品進(jìn)行沙門氏菌的分離純化及鑒定。以平板劃線法將樣品接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)約24 h。用接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)的菌落至SS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。

用無(wú)菌接種環(huán)挑取1～2環(huán)生理鹽水于載玻片中央，再用滅菌后的接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后的沙門氏菌疑似菌落的單個(gè)菌落，與載玻片中央的生理鹽水混勻，將混合物涂布至直徑1cm左右的薄層，室溫干燥后用酒精燈加熱玻片固定菌。瑞氏染色法將制好的玻片染色，用電子顯微鏡觀察菌體的形態(tài)特征。

1.5 生化鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)或棉簽將上述純化培養(yǎng)后的菌落接種于色氨酸肉湯﹑賴氨酸脫羧酶﹑尿素酶﹑氰化鉀﹑山梨醇﹑水楊苷﹑丙二酸鹽﹑衛(wèi)矛醇半固體﹑ONPG﹑甘露醇細(xì)菌生化鑒定管內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18～24 h。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》判定生化鑒定結(jié)果。

1.6 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增

水煮法提取分離純化后的沙門菌DNA。設(shè)計(jì)16S rRNA 基因 引 物，16S rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SrRNA-R: 5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’，目的片段1500 bp。以提取的沙門氏菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×Taq Mix 25μL﹑上下游引物各1μL﹑模板2μL，ddH2O將體系補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段切下后用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.7 雛雞致病性試驗(yàn)

將10只1周齡SPF雛雞分為兩組，每組各5只，第一組為試驗(yàn)組，第二組為對(duì)照組。第一組試驗(yàn)組的雛雞腹腔注射1mL麥?zhǔn)媳葷岫葹?的分離菌菌液，第二組試驗(yàn)對(duì)照組腹腔注射1mL無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯。每12h觀察一次各組雛雞的健康狀況和死亡情況。將死亡的雛雞進(jìn)行尸體剖檢，觀察其內(nèi)臟病變并采集臟器進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將純化的細(xì)菌接種到SS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落接種于5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃﹑220 r/min搖床培養(yǎng)14h。用滅菌PBS調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫取Ｓ脺缇藓瀸⑾♂尯玫木壕鶆蛲坎加贛H瓊脂平板上，放置5min后貼上藥敏紙片。將培養(yǎng)皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48h。測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果

從該雞場(chǎng)病料中分離的細(xì)菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)半透明﹑表面光滑﹑邊緣整齊的圓形菌落（圖1A）；革蘭染色鏡檢為紅色﹑長(zhǎng)短不一的短桿菌，判斷為革蘭陰性菌（圖1B）。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗(yàn)

分離菌接種微量生化鑒定管后，生化鑒定結(jié)果如表1所示，賴氨酸脫羧酶﹑山梨醇﹑水楊苷和甘露醇試驗(yàn)呈陽(yáng)性；色氨酸肉湯﹑尿素酶﹑氰化鉀﹑丙二酸鹽﹑衛(wèi)矛醇半固體﹑ONPG試驗(yàn)反應(yīng)呈陰性，與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中沙門氏菌的生化特征相符合。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rRNA和invA基因擴(kuò)增

以水煮法制備的分離菌DNA為模板，用16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示成功擴(kuò)增出1500 bp的16S rRNA基因條帶（圖2）。切膠回收1500 bp的16S rRNA條帶，膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank公布的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與沙門氏菌同源性最高，為99.53%。由以上結(jié)果可判定該菌株為沙門氏菌。

圖2 16S rRNA 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 雛雞致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組雛雞在腹腔接種菌液后12h開(kāi)始發(fā)病，36h后出現(xiàn)死亡，48h后全部死亡。將死亡雛雞解剖后從臟器中成功分離出沙門氏菌；第二組對(duì)照組所有雛雞均狀況良好，無(wú)死亡狀況。以上結(jié)果表明，該分離菌具有致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，該菌株對(duì)阿莫西林﹑頭孢唑啉﹑頭孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四環(huán)素﹑多西環(huán)素﹑環(huán)丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽諾沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，對(duì)萬(wàn)氨芐西林﹑慶大霉素﹑鏈霉素﹑萬(wàn)古霉素和利福平有耐藥性。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

雞沙門菌病可通過(guò)多種途徑進(jìn)行傳播，可水平傳播，也可通過(guò)種蛋垂直傳播，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害較大[9]。為查明湟源縣某蛋雞場(chǎng)病雞發(fā)病原因，本研究無(wú)菌采集病雞臟器樣品后，進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)。為達(dá)到快速﹑準(zhǔn)確鑒定疑似菌目的，從臟器分離出疑似菌后，先進(jìn)行了16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)分離菌與沙門氏菌同源性最高，為99.34%。隨后，對(duì)分離菌進(jìn)行了革蘭氏染色，并接種沙門氏菌微量生化鑒定管，革蘭氏染色鏡檢和生化鑒定結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)分離菌為沙門氏菌。后期將對(duì)分離的此株沙門氏菌進(jìn)行進(jìn)一步血清學(xué)分型鑒定。為確定該分離菌為致病菌，接種1周齡SPF小雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒后小雞均發(fā)病死亡，并且從病死雞臟器中分離出該菌，表明此菌為該雞場(chǎng)此次疫情的病原?？股刈鳛榭刂萍?xì)菌病感染的一種有效手段，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。但由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致了越來(lái)越多的細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，多重耐藥的沙門氏菌也不斷從雞場(chǎng)分離出來(lái)[10-12]，一定程度上增加了細(xì)菌病防控難度。為指導(dǎo)合理用藥，本研究評(píng)價(jià)了該株沙門氏菌的耐藥性，選擇8大類18種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌株對(duì)阿莫西林﹑頭孢唑啉﹑頭孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四環(huán)素﹑多西環(huán)素﹑環(huán)丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽諾沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，對(duì)萬(wàn)氨芐西林﹑慶大霉素﹑鏈霉素﹑萬(wàn)古霉素和利福平有耐藥性，表明該菌株對(duì)頭孢類﹑四環(huán)素類﹑喹諾酮類﹑氯霉素類藥物敏感，而對(duì)青霉素類﹑氨基糖甙類和多肽類等多種藥物產(chǎn)生了耐藥性，且為多重耐藥。與先前學(xué)者報(bào)道的一致，禽源沙門氏菌對(duì)常用抗菌藥耐藥情況較嚴(yán)重[10,11]。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)菌自身特性﹑耐藥基因的傳播和藥物的使用情況等諸多因素有關(guān)[13]。因此，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生細(xì)菌性疾病時(shí)，準(zhǔn)確快速鑒定致病菌，進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，選擇敏感藥物進(jìn)行治療至關(guān)重要。同時(shí)，平時(shí)飼養(yǎng)管理中，規(guī)范臨床抗生素使用，矯正抗生素的不規(guī)范使用，不同敏感抗生素之間交替使用，可有效減少多重耐藥菌株的出現(xiàn)。