王 艷，張志忠，徐前明

（1.合肥野生動物園 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 230036 ）

白鶴是瀕危滅絕的動物之一，因其對環(huán)境適應(yīng)能力較差,不能適應(yīng)于人類經(jīng)濟(jì)活動導(dǎo)致的生存條件劇烈變化。因此, 野外白鶴數(shù)量正在急劇減少。根據(jù)國際鶴類研究中心發(fā)布的數(shù)據(jù),60年代初期有幾千只白鶴，而到了1978年全世界只剩下兩百多只。國際生物學(xué)界認(rèn)為白鶴瀕臨滅絕, 將白鶴收錄在《紅皮書》中作為警示。

球蟲病﹑血液原蟲病是導(dǎo)致白鶴大批死亡的主要疾病。我國禽類感染球蟲較為常見，野生禽類也較為普遍，但白鶴發(fā)生該病較為少，白鶴球蟲在國內(nèi)外報道資料不為常見，累積資料較少，尚無詳盡統(tǒng)計資料給予描述ITS基因在球蟲蟲種鑒定上的應(yīng)用。本次對所分離的白鶴球蟲進(jìn)行鑒定，以便為白鶴球蟲分類奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例來源

采集糞便樣品來自合肥野生動物園救助野生白鶴。

1.2 細(xì)胞與載體

提供自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實驗室的大腸桿菌DH5α；從TaKaRa公司購買的pMD-19T載體。

1.3 主要儀器

PCR儀（Applied Biosystems公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技公司，型號JS680D）；DHP恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器廠有限公司,型號XMT-A7000）；冷凍高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技）。

1.4 主要試劑

瓊脂糖，SDS和Tris堿（均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；Blood DNA kit（上海索萊寶生物科技有限公司）；膠回收試劑盒（QIAGEN公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自上海瑞楚生物科技有限公司）；普通肉湯（上海喬羽生物科技有限公司）；實驗室提供的鮮血營養(yǎng)瓊脂平板。PCR擴(kuò)增所用試劑：TaqDNA聚合酶﹑PCR緩沖液﹑MgCl2﹑dNTPs﹑DNA Maker DL2000﹑蛋白酶K均為TaKaRa公司產(chǎn)品。姬姆薩染料（購自Sigma公司）。

2 方法

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因

2.1.1 球蟲卵囊分離與純化

從合肥市野生動物園收集白鶴糞便，按照張龍樂等【2】報道的方法，采用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行球蟲卵囊分離與純化。

2.1.2 DNA提取

第一，將上述收集的1×105個球蟲卵囊用玻璃珠打碎，加入300μL細(xì)胞裂解液和20μL蛋白酶K作用4h，再向每管再加入酚和氯仿各200μL，小心顛倒混勻幾下。13000 rpm 離心13 min。轉(zhuǎn)移上清至新管。

第二，加入600μL氯仿：異戊醇(24:1)，震蕩10s，14000rpm離心3min。

第三，取上清液至新管，再向該EP管中加入2倍體積即200μL的無水乙醇。

第四，在-20℃的冰箱中冷凍保存30min。13000rpm 離心13min。丟棄上清。

第五，加入500μL的75%乙醇注入EP管中，輕輕地轉(zhuǎn)上幾下，清洗下EP管，然后去掉液體。

第六，干燥箱內(nèi)干燥20min。

第七，加入30μL的TE緩沖液，來回吹打幾次即可，所提取的基因組用于PCR反應(yīng)。

2.1.3 引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank.U88565用Primer5.0設(shè)計一對引物，預(yù)計擴(kuò)增的片段為539bp，引物由華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

2.1.4 PCR擴(kuò)增目的基因

取根據(jù)模板的編號進(jìn)行相應(yīng)編號的EP管按照下面的體系加樣：

mix（Taq酶和dNTP） 12.5μl上下游引物 各1μl DNA模板 1μl dd水 9.5μl Total 25μl

PCR反應(yīng)參數(shù)如下：預(yù)變性：94℃ 5min；變性：94℃45s；退火：56℃ 30s；復(fù)性：72℃ 30s；進(jìn)行35個循環(huán)，完成后在72℃ 延長10min，于4℃下保存。

2.1.5 瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（100V，40min）后，全自動凝膠成像儀分析并拍照。

2.2 PCR產(chǎn)物的純化

按照回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

2.3 重組質(zhì)粒PMD19-T- ITS-1的構(gòu)建

2.3.1連接PCR產(chǎn)物與T載體

連接體系如下：

PMD-19T 1μl SolutionⅠDNA回收片段ddH2O5μl 3μl 1μl總體積 10μl

短暫離心后于4℃下保存過夜。

2.3.2 轉(zhuǎn)化

方法步驟如下：

第一，10μL連接產(chǎn)物與100μL感受態(tài)細(xì)胞混勻后，冰上作用30min。第二，然后42℃作用90s。第三，加入1μLLB培養(yǎng)基，180r /min振蕩培養(yǎng)1h。第四，12000 r/min離心20s，去掉800μL，剩余的用涂棒均勻涂布在Amp平板上，放置10min后，倒置恒溫培養(yǎng)16h。

2.3.3陽性菌的克隆鑒定

用滅菌的槍頭從平板上挑取4個單菌落，置入滅菌的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含50μg/ ml Amp）至飽和。然后采用菌落PCR方法對其鑒定。

2.3.4基因的測序與比對

將經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆送至上海生物工程公司進(jìn)行測序鑒定，測定的序列經(jīng)NCBI中Blast工具進(jìn)行序列比對，同時采用DNAstar軟件對其抗原性進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 卵囊分離結(jié)果

圖1 白鶴球蟲卵囊形態(tài)特征（400×）

將所得球蟲進(jìn)行孢子化試驗（置入2.5%重鉻酸鉀溶液，28℃），發(fā)現(xiàn)該球蟲最早孢子化時間約為23h。對其卵囊形態(tài)觀察，其大小約為16-18μm×8-12μm，孢子化后4個孢子囊，每個孢子囊中含有2個子孢子。在外形上，一端窄，一端稍頓，無極孔和極冒等結(jié)構(gòu)。初步判定屬于艾美耳球蟲屬。

3.2 PCR擴(kuò)增目的基因結(jié)果

用自行設(shè)計并由華大基因生物技術(shù)有限公司合成的一對引物，分別擴(kuò)增該糞便基因組DNA，得到PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，參照2000 DNA Marker 標(biāo)記，在500～750 bp間出現(xiàn)一條DNA特異性條帶，與預(yù)期在539bp相符，沒有非特異性條帶出現(xiàn)，擴(kuò)增成功，瓊脂糖凝膠電泳圖：

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 ITS-1基因序列測定結(jié)果

CGGcCAGTGcCAaGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGGTCAGGAAGTTACTTAAATAGAGCCCTCTAAAGGATGCAAAACTCGTAACACGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACTTGTTCGAAATGATAATGGAATGGATCTTCCTTATCGATTTCGGATGATTTCCCACCGCATTGTATCAATCATTGAATCCGTGGCGTCTGCATGCATGGATTGGTGGCCGGCCCATCCGTGCATACCAATGGGATCATATGGATATTCACCCCACAAAGGTTTCTCTTTTTTATTTAAAGCTTAACTACTACTGCATATATACGGCGATTTGCGCAAAATGAGGAGCCGCATGCGGGTCGGCATGCAGCCCCGGGCAGTGGGGCATTGCACGGCGGCGAGGATGTGACCTTGTGTCACTTCGCTCCCCGGGCAAACATCGTTATGAAATCGCGATCTATATACCCACGGGTATTATGTTGTATGTTATTTTAAAAACTTTTTACAATGGATGTCTTGGCTCGTGCAT

所得基因經(jīng)華大生物公司測序，所得序列長度為539bp，其中G+C含量為48.2%，A+T含量為51.8%。

3.4 序列同源性分析

將測序結(jié)果與GenBank中其他分離株基因序列進(jìn)行了序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該分離株的基因與其他毒株的核苷酸同源性均在96%以上，由繪制的進(jìn)化樹分析可知，該分離株與艾美球蟲屬（A株）（登錄號為MF356556.1）親緣關(guān)系最近，與其他分離株的核苷酸同源性為77%～96%.

3.5 ITS-1基因遺傳進(jìn)化樹分析

由圖3可知，采用Mage軟件分析，運(yùn)用最大簡約法計算白鶴球蟲（Grane eimeria）ITS-1與所報道的E. gruis在遺傳距離上最為接近，而與其他球蟲不在同一分支上，且離隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）遺傳距離差距最大。

圖3 所得基因遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果

4 討論

4.1 白鶴球蟲種類鑒定

根據(jù)臨床資料及實驗室檢驗結(jié)果， 本園白鶴發(fā)生的疫病主要為球蟲感染所致。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，采用孢子化時間測定，卵囊指數(shù)和卵囊大小，外形特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。所測的指數(shù)與雞球蟲均不完全相同，與孔雀球蟲也不一致。與萬雪﹑劉冰許等報道丹頂鶴球蟲種類也不一致，他們發(fā)現(xiàn)丹頂鶴球蟲大小為卵囊大小約為18μm ×16μm，這種球蟲寬度明顯大于本次發(fā)現(xiàn)的球蟲寬度，其外形是寬橢圓形，而本次發(fā)現(xiàn)白鶴球蟲是長橢圓形[3，4]。采用分子生物學(xué)鑒定方法，根據(jù)ITS-1基因?qū)ζ浞N類鑒定，這種方法以備廣泛采用和實踐，如辛玲等人采用該方法鑒定雞球蟲種類[5]。ITS-1基因在不同種球蟲是存在差異性的，是作為種類鑒定的理想靶分子基因，不同物種ITS基因差異是較大的，這樣可以較好地區(qū)別出不同種類球蟲。本次擴(kuò)增出ITS-1基因在同源性上，與已知柔嫩艾美耳球蟲﹑火雞球蟲等差異性較大，同源性最高為96%（但只是擴(kuò)增539bp中的部分序列），部分同源性更低，只有77%，初步說明本次白鶴球蟲與已報道球蟲ITS-1基因序列并不是同一序列，差異較大，可推測為它不同于其他球蟲。在對作遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與所報道的Eimeria gruis在遺傳距離上最為接近，而與其他球蟲不在同一分支上，且離隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）遺傳距離差距最大。

4.2 球蟲病的發(fā)生與環(huán)境衛(wèi)生﹑飼養(yǎng)密度﹑氣候﹑飼養(yǎng)管理﹑鶴鳥日齡大小等因素呈密切相關(guān)的。所以球蟲病防治必須搞好場地環(huán)境衛(wèi)生， 搞好舍內(nèi)衛(wèi)生制度， 做好消毒措施， 并保持籠舍干燥清潔， 保持飲水和食物的干凈清潔。營養(yǎng)條件是控制球蟲病另外重要手段，應(yīng)供給鶴群充足營養(yǎng)的飼料， 補(bǔ)充足夠維生素A和C，發(fā)病時減少飼料中的鈣含量等，對于球蟲病控制也是十分必要的。一旦發(fā)生球蟲病，除了藥物，應(yīng)給予魚肝油配合治療，提高療效。