王仕江，黃光云，2

（ 1． 南丹縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西 河池 547200 ； 2． 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)畜牧研究院，廣西 南寧 530001 ）

牛支原體屬于柔膜體綱、支原體屬，是介于細(xì)菌和病毒之間的最小、最簡單的能夠進(jìn)行自我復(fù)制的原核微生物，目前已分離鑒定出與牛病相關(guān)的支原體有20多種，牛支原體是其中一種。牛支原體可引起肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等，其中以引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病最常見[1]。1961年，有學(xué)者首次從患乳腺炎的牛分泌的牛乳中分離到牛支原體[2]；而出現(xiàn)呼吸道癥狀的病例則于1976年首次被報(bào)道。2008年，我國首次從患病犢牛肺臟中分離到牛支原體，之后國內(nèi)十多個(gè)省市陸續(xù)發(fā)生了牛支原體病，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[3]。牛支原體肺炎的臨床癥狀和病理變化與牛傳染性胸膜肺炎極為相似，對(duì)相關(guān)疾病的臨床診斷造成了困難。而且目前臨床中防控牛支原體病仍以使用抗生素為主，耐藥株的出現(xiàn)對(duì)該病的臨床防控也造成了一定阻礙?；诖耍疚膶?duì)牛支原體病的流行病學(xué)及臨床癥狀進(jìn)行簡單總結(jié)，主要梳理近年來牛支原體診斷及防治方法的研究進(jìn)展，以期為國內(nèi)大多數(shù)地方開展牛支原體病的防控工作提供參考。

1 流行病學(xué)

牛支原體病的流行與疫區(qū)牛群的流動(dòng)存在密切關(guān)系，牛一旦感染支原體很難根除，且攜帶時(shí)間可長達(dá)數(shù)年。支原體病的主要傳染源是患病牛和攜帶牛，自然感染5～7 d后，患病牛排出大量病原，傳播途徑主要為飛沫傳播、哺乳傳播、交配傳播等。此外，人工授精也是傳播該病的常見途徑，可引起睪丸炎、精囊炎，導(dǎo)致精子質(zhì)量降低[2]。牛支原體病的發(fā)生受到飼養(yǎng)管理、消毒情況以及牛自身的健康情況等多種因素的影響，一般情況下，冬季養(yǎng)殖場的衛(wèi)生和條件受限，發(fā)病率更高。此外，由于康復(fù)患?？沙掷m(xù)帶毒，導(dǎo)致感染牛支原體的養(yǎng)殖場會(huì)變成隱性流行區(qū)域。牛支原體感染肉牛和奶牛，肉牛易感性更強(qiáng)；以1周齡內(nèi)的犢牛最為易感，病死率極高。

2 臨床癥狀

牛支原體病可引起肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎等多種癥狀表現(xiàn)，不同年齡段的牛會(huì)出現(xiàn)不同的癥狀[4]。

2.1 呼吸系統(tǒng)疾病

自然感染牛支原體發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病多為犢牛，臨床中一般分為最急性型、急性型和慢性型。最急性型在臨床中較罕見，主要表現(xiàn)為體溫突然升高超過41.5 ℃、精神萎靡、呼吸急促等，病程一般為2～3 d，病情嚴(yán)重者甚至在1 d內(nèi)就會(huì)死亡[5]。急性牛支原體肺炎患牛表現(xiàn)發(fā)熱、持續(xù)分泌鼻涕，精神沉郁，反芻能力下降，咀嚼能力下降，頸部彎曲，眼球腫脹，病程一般為7～10 d，若在此階段內(nèi)不發(fā)生死亡，病牛大多向慢性型轉(zhuǎn)變。慢性型是牛支原體肺炎最普遍的一種形式，臨床癥狀較輕微，主要表現(xiàn)為被毛暗淡、體弱多病，部分病牛出現(xiàn)痢疾、咳嗽等[6]。

2.2 乳房炎及關(guān)節(jié)炎

感染牛支原體的奶牛多數(shù)只有一個(gè)乳區(qū)出現(xiàn)癥狀，部分兩個(gè)或更多乳區(qū)發(fā)生炎癥?；疾∪閰^(qū)觸診硬實(shí)，表現(xiàn)為發(fā)熱、腫脹，患病早期乳汁呈水樣，其中混有絮狀物；隨著病情發(fā)展，乳汁變?yōu)榈攸S色漿液樣物質(zhì)，甚至膿化[7]。出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的患病牛關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)大量積液，滑膜組織增生，關(guān)節(jié)周圍軟組織出現(xiàn)干酪樣壞死物。

2.3 耳炎

牛支原體引起耳炎的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，推測可能與咽部有關(guān)。因?yàn)檠使墓苓B接鼓室與咽部，口腔中的病菌由此進(jìn)入中耳，并隨著病程持續(xù)進(jìn)入內(nèi)耳，引發(fā)耳炎。部分牛出現(xiàn)頭頸歪斜等神經(jīng)癥狀，以2～18周齡居多。

3 病理變化及實(shí)驗(yàn)室診斷方法

根據(jù)患病牛的臨床表現(xiàn)及病理變化可作出早期判斷，也可采用觸診、聽診等方法進(jìn)行輔助檢查，但若要確診仍需運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)加以鑒別。常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)包括分離培養(yǎng)、涂片鏡檢及血清學(xué)、免疫學(xué)、分子生物技術(shù)等[8]。

3.1 病理變化

解剖患病?？梢姴∽兊闹饕恢檬切呐K和肺部，主要表現(xiàn)大葉性肺炎，整個(gè)心葉、尖葉和大部分膈葉發(fā)生實(shí)變，膈葉殘存的相對(duì)正常的肺組織出現(xiàn)肺氣腫；心衰，心肌質(zhì)軟，橫徑增寬，心內(nèi)膜出血明顯。出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的患病牛兩前肢腕關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)較明顯的壞死化膿灶，四肢的關(guān)節(jié)液黏稠且量增多[9]。

3.2 觸診和聽診

對(duì)病情較重的肉牛，聽診時(shí)能夠聽到肺泡音變淡或消失，呼吸音也多為摩擦聲；對(duì)支氣管進(jìn)行聽診會(huì)發(fā)現(xiàn)有明顯的啰音和胸腔的摩擦聲。

3.3 分離培養(yǎng)和涂片鏡檢

無菌采集病料，使用類胸膜肺炎微生物培養(yǎng)基進(jìn)行病原微生物培養(yǎng)，2～3 d 后用顯微鏡觀察固體培養(yǎng)基表面有無出現(xiàn)“煎蛋型”支原體典型菌落，液體培養(yǎng)基是否由紅色變?yōu)辄S色透亮，若是則需進(jìn)行下一步的生化試驗(yàn)。病料直接涂片鏡檢，也可作為輔助診斷方法。但病原培養(yǎng)和鏡檢不適合進(jìn)行快速臨床診斷，并且對(duì)操作人員具有一定要求，不適用于生產(chǎn)實(shí)踐。此外，感染肉牛的鮮血還可以用于檢測牛支原菌感染的凝血試驗(yàn)[10]。

3.4 血清學(xué)方法

目前常用的血清學(xué)檢測技術(shù)為ELISA 和膠體金免疫層析法。王艷芳等[11]獲得牛支原體延伸因子EF-Tu 蛋白并建立EF-Tu間接ELISA法，結(jié)果表明該方法適合大規(guī)模的血清學(xué)診斷檢測。金云云等[12]以牛支原體全菌蛋白經(jīng)超聲波裂解后的裂解物作為包被用抗原，建立檢測牛支原體血清抗體的間接ELISA 方法。使用該方法檢測牛布氏桿菌病、牛病毒性腹瀉黏膜病抗血清均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。劉洋等[13]比較了3種抗牛支原體血清抗體的ELISA 試劑盒檢測效果。ELISA 法多應(yīng)用于臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查[14-16]，但該方法也存在可能出現(xiàn)假陽性的情況。周華倩等[17]建立了牛支原體抗體的膠體金免疫層析試紙條；田可昕等[18]以牛支原體MilA基因重組蛋白P300為檢測靶標(biāo)抗原包被檢測線，山羊抗家兔IgG包被質(zhì)控線，金黃色葡萄球菌蛋白A 標(biāo)記膠體金溶液，建立牛支原體抗體膠體金免疫層析試紙條檢測方法，上述試紙條經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明均可應(yīng)用于牛支原體抗體現(xiàn)場快速檢測、群體監(jiān)測和輔助診斷。

3.5 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體間的結(jié)合、組織化學(xué)染色，對(duì)抗原、抗體進(jìn)行定量分析，能夠準(zhǔn)確判斷是否有病原感染，還可清晰地反映病原在組織器官和細(xì)胞中的定位及分布，具有很高的檢出率和準(zhǔn)確度[19]。金云云等[20]建立檢測牛支原體的間接免疫組織化學(xué)方法，分別以雞抗牛支原體免疫球蛋白Y（IgY）、羊抗雞IgG-HRP 為一抗和二抗，對(duì)牛支原體菌體涂片和牛支原體陽性肺臟組織切片進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示，試驗(yàn)建立的間接免疫組化方法可應(yīng)用于檢測臨床病例組織樣本及培養(yǎng)物中的牛支原體，具有特異性和可靠性。

3.6 分子生物學(xué)方法

目前，分子生物技術(shù)的研究有兩大類:聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和環(huán)-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）。PCR 技術(shù)是一種靈敏度高、專一性好的方法，但對(duì)技術(shù)和設(shè)備的使用要求很高，不適合在臨床上推廣。包世俊等[21]參照GenBank中牛支原體脂蛋白P48基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物Mb-F/Mb-R，建立了牛支原體PCR檢測方法，檢出率與病原分離的符合率為100%。楊麗等[22]建立了可用于牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌的單一和混合感染鑒別診斷的三重PCR 檢測方法，具有快速、準(zhǔn)確、簡便的特點(diǎn)。LAMP技術(shù)的操作方法比PCR技術(shù)簡單，設(shè)備條件也比較簡單，適用于臨床，但目前該技術(shù)還不完善，且使用比較少見[23]。范情等[24]建立的二重?zé)晒釲AMP 檢測方法靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好，能夠同時(shí)檢測大量樣本，可用于牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查。金云云等[25]基于牛支原體P81基因建立的LAMP檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速準(zhǔn)確，且不需要專門的儀器設(shè)備,可用于牛支原體臨床檢測。吳彤等[26]研制了一種檢測牛支原體的等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒，具有敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，適合基層獸醫(yī)現(xiàn)場檢測使用。

4 防治方法

4.1 預(yù)防措施

飼養(yǎng)場堅(jiān)持“自繁自養(yǎng)”的原則，若必需引進(jìn)的情況下，應(yīng)嚴(yán)禁從疫區(qū)引進(jìn)并在引進(jìn)前進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。選定引入牛后，應(yīng)盡可能縮短運(yùn)輸路程，若引入犢牛應(yīng)保證已斷奶一個(gè)月。肉牛引入養(yǎng)殖場后，必須進(jìn)行30～45 d 隔離觀察，隔離期結(jié)束后重新檢疫，通過后方可入群[27-29]。嚴(yán)格劃分牛場生活區(qū)、生產(chǎn)區(qū)，并設(shè)立專用的隔離區(qū)和獸醫(yī)室，在入口處設(shè)置消毒池；建立定期消毒制度，每個(gè)月必須消毒，轉(zhuǎn)群、出欄、進(jìn)牛前消毒，健全的防疫和驅(qū)蟲制度，定期進(jìn)行預(yù)防和驅(qū)蟲。疫情發(fā)生時(shí)應(yīng)認(rèn)真做好相應(yīng)工作，嚴(yán)格控制疫情范圍，并做好消毒、凈化等工作[30]。牛群一旦發(fā)生疫病，必須立即進(jìn)行隔離和治療，若病情嚴(yán)重不能治愈，必須馬上進(jìn)行無害化處理。對(duì)病牛及周圍進(jìn)行徹底消毒，每日可按實(shí)際情況進(jìn)行1～2次消毒。為提高肉牛的生產(chǎn)效益，必須進(jìn)行科學(xué)的飼養(yǎng)管理。肉牛到新的養(yǎng)殖場后的隔離飼養(yǎng)期間要注意驅(qū)蟲、健胃，密切關(guān)注肉牛的日常生活習(xí)慣，如采食、排泄等，并根據(jù)其行為習(xí)慣科學(xué)地調(diào)節(jié)管理方式。做好牛群飼養(yǎng)后的日常管理，營造舒適的生長環(huán)境，確保其生長速率和肥力，加強(qiáng)舍內(nèi)通風(fēng)，保持舍內(nèi)的溫度和濕度。

4.2 疫苗免疫

牛支原體無細(xì)胞壁，對(duì)常規(guī)抗菌藥物不敏感，且易產(chǎn)生耐藥性。因此，疫苗免疫成為預(yù)防牛支原體病的重要方向[4]。牛支原體疫苗多為弱毒疫苗和滅活疫苗，以預(yù)防控制呼吸道疾病癥狀為主，如牛支原體相關(guān)五聯(lián)苗、牛支原體單價(jià)苗等[31]。此外，關(guān)于牛支原體的亞單位疫苗也已開展了大量的研究。牛支原體膜蛋白具有良好的免疫原性，可作為牛支原體疫苗的候選[32]。白宇彤等[33]研究發(fā)現(xiàn)，牛支原體重組MBOVPG45_0212 蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)活性，為后續(xù)牛支原體生物學(xué)功能研究及疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。黃志成等[34]研究成功制備牛支原體重組LppB蛋白及其多克隆抗體，為LppB功能研究奠定基礎(chǔ)。

4.3 治療措施

牛支原體對(duì)常規(guī)使用的抗菌藥物具有耐藥性，特別是土霉素、替米考辛和壯霉素[35]。臨床中對(duì)牛支原體病的治療方式以對(duì)癥治療為主。針對(duì)出現(xiàn)呼吸道癥狀患牛，癥狀較輕者可在日糧中混入12 mg/kg左氧氟沙星治療[36]；嚴(yán)重者可靜脈注射10%葡萄糖注射液200 mL+10%氯化鈉注射液150 mL+40%烏洛托品30 mL+維生素C 注射液40 mL+地塞米松磷酸鈉7.5 mL+頭孢噻呋鈉1 g，連續(xù)用藥3 d[35]。為預(yù)防病牛出現(xiàn)肺水腫，可肌肉注射30%替米考星，連續(xù)用藥2～3 d。呼吸困難、體質(zhì)衰弱的病?？杉∪庾⑸?～10 mg/kg 硫酸卡那霉素+5 mg/kg 酒石酸泰樂菌素+0.1 g/kg 黃芪多糖；若病牛已對(duì)硫酸卡那霉素有抗藥性，可替換為氟苯尼考注射液。大環(huán)內(nèi)酯類及四環(huán)素類抗生素能夠治療其他器官的支原體感染，但對(duì)支原體乳腺炎無療效，因此治療支原體引起的奶牛乳腺炎首選藥物是氟喹諾酮類，也可使用紅霉素或阿奇霉素[7]。隨著中獸藥在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，有關(guān)中藥治療牛支原體病的試驗(yàn)研究逐漸增多。如由板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、知母、甘草組成的復(fù)方制劑可用于治療牛支原體肺炎；而且牛支原體對(duì)兩面針、甘草、黃檗等均具有較好的敏感性[37]。

5 結(jié)論

牛支原體病是肉牛生產(chǎn)中一種常見的傳染病，若不及時(shí)治療會(huì)對(duì)肉牛的健康產(chǎn)生很大危害。為此，農(nóng)場主和獸醫(yī)均需要采取相應(yīng)的措施，采用科學(xué)的診斷和控制技術(shù)，為肉牛養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生產(chǎn)經(jīng)營提供保證。