李 慧, 岳躍森, 滕 珂, 張全剛, 滕文軍, 張 輝, 溫海峰, 武菊英*, 范希峰*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院, 北京 100097； 2.北京市首發(fā)天人生態(tài)景觀有限公司, 北京 102600)

隨著我國城市建設(shè)的加快，城市園林綠地面積迅速增加。近30年來我國草坪業(yè)高速發(fā)展，其作為城鄉(xiāng)綠色空間，為增益人類福祉貢獻(xiàn)了重要的社會(huì)價(jià)值[1-2]。苔草(Carexspp.)具有適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是我國草坪研究一類理想的鄉(xiāng)土草種[3]。

白穎苔草(Carexrigescens)為莎草科(Cyperaceae)苔草屬(CarexLinn.)的一種多年生草坪草，全球約有1 966種，廣泛分布于南極洲以外的大陸，在我國集中分布于北部地區(qū)[4-5]。白穎苔草可以適應(yīng)惡劣的土壤和環(huán)境條件，對(duì)非生物應(yīng)激物具有較強(qiáng)的耐受性[6]；此外其草葉纖細(xì)、外形美觀，成坪后覆蓋程度好，耐踐踏且管理較為粗放，可作為我國北方開闊森林和休閑草坪草種[7-8]。然而白穎苔草種子具有一定程度的休眠，導(dǎo)致其發(fā)芽速度慢，這一問題限制了白穎苔草在園林景觀中的大面積應(yīng)用。因此研究白穎苔草的種子發(fā)芽特性具有重要意義。

近年來，對(duì)白穎苔草的研究主要集中在耐鹽機(jī)制[9-10]上，其觀賞價(jià)值[7,11]、藥物應(yīng)用[12]少有研究。種子發(fā)芽特性的研究主要集中于適宜的發(fā)芽環(huán)境以及提高發(fā)芽率的方法上[11,13]，例如孫彥等研究發(fā)現(xiàn)白穎苔草種子的最適發(fā)芽溫度為變溫30℃/20℃，25℃/15℃，發(fā)芽率達(dá)87.75%，而在恒溫20℃，30℃環(huán)境下其發(fā)芽率低于4.00%；變溫環(huán)境下，經(jīng)10%或20%NaOH浸種40 min其發(fā)芽率高達(dá)93.50%～94.00%；通過層積處理90 d，發(fā)芽率也可達(dá)90.00%[14]。本文以恒溫和變溫環(huán)境下白穎苔草發(fā)芽的種子互為對(duì)照，探究不同溫度環(huán)境下白穎苔草種子發(fā)芽過程中營養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)酶活性的變化情況，為研究苔草種子的發(fā)芽機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

供試白穎苔草種子于2020年5月在國家精準(zhǔn)試驗(yàn)基地采集，2020年9月進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)及生理指標(biāo)測定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)芽試驗(yàn)種子處理方法 設(shè)置變溫：30℃/20℃，恒溫：20℃，30℃三個(gè)溫度環(huán)境。用10%次氯酸鈉將籽粒飽滿的種子震蕩浸種消毒30 min，消毒后用蒸餾水沖洗5～6次，瀝干水分待用。種子播種于內(nèi)部墊有3層濾紙、12 cm×12 cm×5 cm的發(fā)芽盒中，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)。發(fā)芽盒置于光周期為光照8 h/黑暗16 h，濕度為80%，光照度為24 000 lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)定量補(bǔ)加蒸餾水，保持濾紙濕潤。當(dāng)胚根突破種皮且超過種長1/2時(shí)開始計(jì)數(shù)[15]，每天統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽數(shù)，當(dāng)發(fā)芽數(shù)連續(xù)3天保持不變時(shí)結(jié)束試驗(yàn)[16]，測定不同溫度下種子的發(fā)芽指標(biāo)。

1.2.2生理指標(biāo)分析種子處理方法 種子前處理同1.2.1。每個(gè)發(fā)芽盒中播種0.1 g白穎苔草種子，蒸餾水培養(yǎng)。以不同發(fā)芽階段種子發(fā)芽率差異為取樣標(biāo)準(zhǔn)，在播種后的第3 d(S1-發(fā)芽率0)、7 d(S2-發(fā)芽率10%)、9 d(S3-發(fā)芽率30%)、10 d(S4-發(fā)芽率50%)、13 d(S5-發(fā)芽率80%)時(shí)取樣，每次每個(gè)溫度下隨機(jī)取3個(gè)發(fā)芽盒的種子(3個(gè)重復(fù))，共計(jì)45個(gè)發(fā)芽盒。每15個(gè)發(fā)芽盒分別置于溫度為30℃/20℃，30℃，20℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其余培養(yǎng)環(huán)境和方法與發(fā)芽試驗(yàn)相同。每次取樣后用液氮冷凍15 min，然后放入-80℃保存，用于生理指標(biāo)測定。

1.2.3發(fā)芽指標(biāo)測定

種子發(fā)芽勢=初期(第7天)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

種子發(fā)芽率=終期(第20天)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為當(dāng)天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù);

平均發(fā)芽時(shí)間=∑nt/∑n，式中：n為在時(shí)間t時(shí)，新發(fā)芽的種子數(shù)，t為發(fā)芽時(shí)間。

1.2.4營養(yǎng)物質(zhì)含量及酶活性測定 按蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒及程序處理，用分光光度計(jì)分別測定3種溫度下5個(gè)發(fā)芽階段的白穎苔草種子的可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉含量。3種溫度下5個(gè)發(fā)芽階段的白穎苔草種子的過氧化物酶活性按蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒及程序處理進(jìn)行測定；采用3，5二硝基水楊酸(DNS)法[17]測定不同溫度下不同發(fā)芽階段白穎苔草種子的淀粉酶活性。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 通過SPSS 18.0軟件對(duì)每一階段不同溫度下的生理數(shù)據(jù)采用Duncan法進(jìn)行多重比較，運(yùn)用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽狀況分析

由表1可知，白穎苔草種子的發(fā)芽對(duì)不同溫度環(huán)境響應(yīng)有所不同。白穎苔草種子在變溫條件下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)顯著高于恒溫條件下(P<0.05)，30℃/20℃下其發(fā)芽勢比兩恒溫下高12.00%，30℃/20℃下發(fā)芽率比20℃，30℃分別高出74.00%，86.00%，30℃/20℃下其發(fā)芽指數(shù)比20℃，30℃分別提高了3.94，4.48；變溫條件下其平均發(fā)芽時(shí)間可比恒溫條件下提前2 d左右，達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，表明適宜的溫度環(huán)境是白穎苔草種子發(fā)芽的關(guān)鍵。

表1 不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽指標(biāo)Table 1 Germination indexes of C. rigescens seeds under different temperature

2.2 不同溫度下白穎苔草種子營養(yǎng)物質(zhì)含量變化

不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中淀粉含量總體呈下降趨勢(圖1A)。隨著種子的發(fā)芽，種子內(nèi)存儲(chǔ)的淀粉逐漸分解轉(zhuǎn)化為糖類，在30℃/20℃，30℃，20℃環(huán)境下，種子內(nèi)部淀粉含量的變化范圍分別為6.98～6.32，7.11～6.76，7.10～6.74 mg·g-1，其中，變溫環(huán)境下，白穎苔草種子發(fā)芽過程中分解的淀粉最多，此環(huán)境下種子內(nèi)部的淀粉含量均低于恒溫環(huán)境下，30℃下的淀粉含量高于20℃下，說明種子發(fā)芽越多，淀粉的分解量越多。除S4時(shí)期外，30℃/20℃環(huán)境下淀粉含量與30℃環(huán)境下的淀粉含量均達(dá)到了差異顯著水平(P<0.05)。

白穎苔草種子發(fā)芽過程中，種子內(nèi)部的可溶性糖含量也總體呈降低趨勢(圖1B)。僅S1時(shí)期30℃/20℃環(huán)境下種子內(nèi)部可溶性糖含量顯著低于恒溫20℃環(huán)境下(P<0.05)，其余均未達(dá)到差異顯著水平。但除S2外，其余4個(gè)時(shí)期，變溫下白穎苔草種子內(nèi)部的可溶性糖含量均低于恒溫下。在30℃/20℃，30℃，20℃環(huán)境下，種子發(fā)芽過程中可溶性糖消耗量分別為5.28，6.55，7.14 mg·g-1。

由圖1C可知，不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中可溶性蛋白含量發(fā)生著不同變化。隨著種子發(fā)芽，變溫環(huán)境下可溶性蛋白含量由0.74 mg·g-1降低至0.14 mg·g-1；而恒溫環(huán)境下則先升高后降低，30℃，20℃環(huán)境下種子內(nèi)部的可溶性蛋白含量分別在S2(0.53 mg·g-1)，S4(0.72 mg·g-1)達(dá)到最大值。S1時(shí)期變溫環(huán)境下種子內(nèi)部的可溶性蛋白含量顯著高于恒溫環(huán)境(P<0.05)；而在S4，S5時(shí)期變溫環(huán)境下的蛋白含量則顯著低于恒溫環(huán)境下(P<0.05)；在S2，S3時(shí)期變溫和恒溫環(huán)境下的可溶性蛋白含量則均未達(dá)到差異顯著水平。不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化表明其對(duì)于種子的發(fā)芽至關(guān)重要。

2.3 不同溫度下白穎苔草種子相關(guān)酶活性變化

2.3.1淀粉酶活性變化 白穎苔草種子發(fā)芽過程中內(nèi)部的淀粉酶活性受溫度影響(圖2)。變溫環(huán)境下酶活性先升高后降低，在S2達(dá)到最大為18.19 mg·(g·min)-1；恒溫處理下種子內(nèi)部的酶活性整體呈降低趨勢，均在S5階段略微升高。除S5時(shí)期外，變溫環(huán)境下淀粉酶活性均高于恒溫環(huán)境下，且在S2，S3達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。這說明變溫環(huán)境下種子發(fā)芽過程中蔗糖和淀粉代謝途徑比恒溫環(huán)境下更為活躍，且隨著種子發(fā)芽的完成，該代謝途徑逐漸減弱。

2.3.2POD活性變化 不同溫度下，白穎苔草種子各發(fā)芽階段過氧化物酶活性不同(圖3)。30℃/20℃變溫、20℃恒溫下，隨著種子的發(fā)芽，POD活性呈上升趨勢；30℃下種子內(nèi)部的POD活性變化較小，在50～150 U·g-1范圍內(nèi)波動(dòng)。S2—S5時(shí)期，變溫下種子內(nèi)部的POD活性均高于恒溫下，且變溫下種子POD活性至少與一個(gè)恒溫下種子POD活性達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。

圖1 不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量Fig.1 Nutrient content during seed germination of C. rigescens at different temperature treatments注：不同小寫字母表示不同溫度間差異顯著(P<0.05)；下圖同Note:Different lowercase letters indicate significant differences at different temperature treatments at the 0.05 level;the same as below

圖2 不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中淀粉酶活性Fig.2 Activities of amylase during seed germination of C. rigescens at different temperature treatments

圖3 不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽過程中POD活性Fig.3 Activities of POD during seed germination of C. rigescens at different temperature treatments

3 討論

3.1 白穎苔草種子發(fā)芽過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量變化

種子發(fā)芽期間發(fā)生了許多生理代謝變化，包含酶的活化、生成，細(xì)胞生理活性恢復(fù)，進(jìn)而使種子內(nèi)部營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)發(fā)生了重大改變[18]。發(fā)芽過程中種子內(nèi)部淀粉、可溶性糖含量的變化能夠反映其可利用物質(zhì)和能量的供應(yīng)基礎(chǔ)水平[19]；部分可溶性蛋白是參與各種代謝的酶，因此其含量成為衡量植物代謝狀況的重要指標(biāo)[20]，此外可溶性蛋白對(duì)于植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營養(yǎng)狀況等有著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著種子的發(fā)芽，其內(nèi)部淀粉、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下逐步分解，為胚生長提供碳源、氮源和能量，營養(yǎng)物質(zhì)及酶的變化反映了植物種子發(fā)芽階段營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，調(diào)控著種子的整個(gè)發(fā)芽階段[21]。

淀粉作為種子內(nèi)部重要且分布廣泛的碳水化合物與營養(yǎng)物質(zhì)，在發(fā)芽過程中可通過自身代謝、利用可溶性糖或其他營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化而來。本研究中，恒溫下的淀粉含量高于變溫條件，且除S4時(shí)期外，30℃/20℃與30℃下的淀粉含量達(dá)到了顯著差異水平，說明在變溫下，淀粉被分解成小分子物質(zhì)，作為構(gòu)成新組織的成分和產(chǎn)生能量的原料被運(yùn)轉(zhuǎn)到生長部位，為種子發(fā)芽所利用。變溫下白穎苔草種子發(fā)芽過程中淀粉含量持續(xù)降低，說明種子的發(fā)芽需要大量的淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖來為其一系列代謝活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)及能量。這與龍葵(Solanumnigrum)[22]、光皮樹(Swidawilsoniana)[23]種子的研究結(jié)果基本一致。而恒溫環(huán)境下S5時(shí)期白穎苔草種子內(nèi)部淀粉含量趨于穩(wěn)定可能是少數(shù)發(fā)芽的種子對(duì)可溶性糖的需求減少，原本種子內(nèi)部的可溶性糖能夠滿足發(fā)芽后種子生長所需，使得淀粉含量基本不變。

可溶性糖作為種子可吸收的小分子化合物，是種子發(fā)芽過程中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，既為種子發(fā)芽過程中呼吸代謝提供ATP，又為不斷合成新細(xì)胞所必需的蛋白質(zhì)及纖維素等提供原料[24-26]。變溫下，可溶性糖含量持續(xù)降低，這與無患子(SapindusmukorossiGaertn)[27]的研究結(jié)果類似；馬琳等研究發(fā)現(xiàn)東北延胡索(Corydalisambigua)[28]種子發(fā)芽過程中可溶性糖含量逐漸降低。說明可溶性糖被作為呼吸底物而消耗，為發(fā)芽過程中新的蛋白質(zhì)合成提供碳骨架以及ATP的合成提供底物。除S2時(shí)期，恒溫條件下種子的可溶性糖含量均高于變溫條件下，說明變溫環(huán)境下白穎苔草種子的發(fā)芽需要更多的可溶性糖來為器官建成提供物質(zhì)基礎(chǔ)與能量，并供應(yīng)各種生理活動(dòng)的進(jìn)行。

可溶性蛋白作為生物體的主要組成成分之一，其含量間接反映著植物體內(nèi)物質(zhì)代謝的強(qiáng)弱，為種子發(fā)芽提供氮素營養(yǎng)及能量[29]。可溶性蛋白在種子發(fā)芽過程中處于一個(gè)循環(huán)過程，它在水解酶的作用下水解為氨基酸等其他小分子化合物，水解后的氨基酸在脫氨、轉(zhuǎn)氨、脫羧等生理過程下同其他有機(jī)物質(zhì)合成新的氨基酸，用于新結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的合成，為呼吸氧化提供碳架[30]，以參與種子后期的一系列生命活動(dòng)[31-32]。本研究中，變溫及恒溫30℃下白穎苔草種子內(nèi)部可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降，這與川續(xù)斷(Dipsacusasperoides)[33]、紅花瘤果茶(Camelliarubituberculata)[34]、珙桐(Davidiainvolucrata)[35]種子發(fā)芽過程中可溶性蛋白含量的變化趨勢基本一致，說明蛋白質(zhì)的降解大于合成，分解成溶解狀態(tài)的氨基酸被運(yùn)轉(zhuǎn)到胚軸部分后合成新蛋白質(zhì)，參與了胚根的生長。變溫下可溶性蛋白含量下降趨勢極為明顯，表明此時(shí)種子內(nèi)部代謝活動(dòng)更活躍，需更多酶促反應(yīng)為種胚提供營養(yǎng)。20℃下后期可溶性蛋白含量增加，可能是因?yàn)橘A藏蛋白降解過程中產(chǎn)生了過度蛋白[36]，同時(shí)代謝旺盛的組織中多余的N3H以游離以外的形式貯存起來使得新蛋白質(zhì)合成[37]，由于少量種子發(fā)芽及其幼苗生長所需養(yǎng)料和能量較少，新合成的蛋白質(zhì)數(shù)量多于生命活動(dòng)所需降解的蛋白質(zhì)數(shù)量，導(dǎo)致后期含量增加。30℃下可溶性蛋白含量降低緩慢且后期沒有增加，可能是因?yàn)榉N子發(fā)芽數(shù)量較少，體內(nèi)代謝活動(dòng)較弱。

3.2 白穎苔草種子發(fā)芽過程中相關(guān)酶活性活性變化

種子解除休眠、開始發(fā)芽過程中，各種酶開始一系列變化，調(diào)節(jié)著種子貯藏物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化[38]。種子發(fā)芽時(shí)，淀粉在淀粉酶的作用下分解為可溶性物質(zhì)，并釋放出大量ATP供胚吸收利用。本研究發(fā)現(xiàn)，變溫下，S2時(shí)期白穎苔草種子內(nèi)部淀粉酶活性迅速增加，表明此時(shí)淀粉酶催化的水解活動(dòng)非?；钴S，白穎苔草種子開始發(fā)芽，隨后，淀粉酶活性開始降低，可能是種子內(nèi)部淀粉含量減少，淀粉水解活動(dòng)減弱。恒溫下，淀粉酶活性整體呈下降趨勢，可能是因?yàn)榇藯l件下，大多數(shù)種子沒有萌動(dòng)，種子的代謝活動(dòng)較弱，呼吸作用所需的能量較少，對(duì)可溶性糖的需求不大使得淀粉酶水解淀粉這一過程較弱，因此淀粉酶活性減弱且較低。

在種子發(fā)芽過程中呼吸強(qiáng)度升高，POD活性增強(qiáng)，影響一系列生理活性分子的合成與分解[39]；在惡劣環(huán)境下種子內(nèi)部會(huì)積累活性氧，對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，POD作為抗氧化系統(tǒng)的主體之一，可直接體現(xiàn)種子的抗氧化能力，有效清除活性氧，進(jìn)而利于種子發(fā)芽。本研究中發(fā)現(xiàn)，變溫下白穎苔草種子發(fā)芽過程中，POD活性升高，迷人杜鵑(Rhododendronagastum)[40]、青蒿(Artemisiacarvifolia)[41]、掌葉木(Handeliodendronbodinieri)[42]種子發(fā)芽過程中POD活性也在升高。變溫下POD活性升高時(shí)，吲哚乙酸氧化酶活性可能會(huì)降低，有助于細(xì)胞中IAA積累[43]，累積的IAA可通過促進(jìn)細(xì)胞的伸長而使種胚伸長；李莉[44]研究發(fā)現(xiàn)POD與萵苣種子發(fā)芽中的細(xì)胞壁松弛相關(guān)，LsPOD1基因的抑制表達(dá)，降低了POD酶活，羥基自由基減少，細(xì)胞壁無法松弛，細(xì)胞難以伸長生長[45]，從而抑制了種子的發(fā)芽；此外，三羧酸循環(huán)是種子進(jìn)行呼吸作用主要的方式之一[46]，POD可參與NADH、草酰乙酸的氧化[47]，所以POD活性的提高可能會(huì)使草酰乙酸和NADH的量減少，從而加快蘋果酸生成更多的NADH、草酰乙酸，刺激三羧酸循環(huán)的正向進(jìn)行，進(jìn)而利于種子發(fā)芽。本研究中恒溫下，POD活性低于變溫下，使得白穎苔草種子的發(fā)芽狀況較差，30℃下POD活性又低于下20℃下POD活性，說明種子發(fā)芽與POD活性息息相關(guān)。因此，在白穎苔草種子的發(fā)芽過程中POD活性升高可能有助于細(xì)胞分裂與生長、呼吸作用等過程，進(jìn)而利于發(fā)芽。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)不同溫度下白穎苔草種子發(fā)芽特性的研究，發(fā)現(xiàn)30℃/20℃能顯著促進(jìn)白穎苔草種子的發(fā)芽。變溫下白穎苔草種子發(fā)芽過程中，種子內(nèi)部的淀粉、可溶性糖含量及可溶性蛋白含量逐漸降低；淀粉酶活性呈先升高后下降的趨勢，POD活性逐漸升高。變溫下淀粉、可溶性糖含量低于恒溫下，總體來說，變溫與恒溫下白穎苔草種子的淀粉、可溶性蛋白含量存在顯著差異；變溫下種子內(nèi)部淀粉酶和POD活性顯著高于恒溫下淀粉酶和POD活性。本研究為白穎苔草種子發(fā)芽生理特性的研究奠定了基礎(chǔ)。