陳三冬， 鞏海強(qiáng)， 尹國麗， 師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070)

青貯玉米(ZeamaysL.)易貯藏、易消化、成本低且營養(yǎng)價值高，適口性好，可以增加奶牛奶產(chǎn)量，提高肉牛日增重和養(yǎng)殖效益[1-2]，近年來青貯玉米的種植面積迅速擴(kuò)大，截至2020年，我國青貯玉米種植面積已達(dá)100萬公頃[3]，為解決冬春飼草匱乏的問題作出了巨大貢獻(xiàn)。青貯玉米發(fā)酵完成后進(jìn)入飼喂階段，隨著開窖、取料和飼喂的進(jìn)行，青貯飼料與氧氣產(chǎn)生接觸，易使飼料發(fā)生二次發(fā)酵，發(fā)生有氧腐敗[4]，有氧腐敗是引發(fā)青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)損失的重要原因[5]，此時好氧微生物大量繁殖，通過呼吸作用利用可溶性碳水化合物和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致可溶性碳水化合物等含量下降，同時產(chǎn)生熱量導(dǎo)致溫度上升引起發(fā)熱變質(zhì)[6]，使得青貯飼料品質(zhì)下降。

不同種類的微生物對青貯飼料品質(zhì)的影響也不相同[7]，其中乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸，防止了營養(yǎng)物質(zhì)流失[8]，保證青貯營養(yǎng)品質(zhì)，但乳酸菌含量過高會降低青貯飼料中抗真菌物質(zhì)的含量，乳酸等同時也為可降解氮化合物的好氧細(xì)菌等微生物提供了繁殖底物，使青貯飼料在有氧暴露后容易發(fā)生霉變[9-10]。賈春旺等[11]通過對不同比例青稞秸稈青貯飼料的研究發(fā)現(xiàn)好氧細(xì)菌利用水溶性碳水化合物和蛋白質(zhì)，造成青貯飼料品質(zhì)下降。王旭哲等人[12]研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的青貯玉米在開窖后，有氧穩(wěn)定的時間為131.71 h。

青貯飼料有氧暴露伴隨著青貯品質(zhì)的下降，使青貯飼料的利用有了時間限制，防止青貯飼料二次發(fā)酵，是青貯飼料在利用過程中的重中之重。由此，了解研究青貯玉米品質(zhì)有氧暴露后細(xì)菌微生物菌群構(gòu)成及變化特征，掌握有氧暴露后的穩(wěn)定的時間可有效預(yù)防有氧腐敗。目前，有關(guān)全株玉米青貯飼料在有氧暴露條件下，微生物對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)影響的研究報(bào)道較少。鑒于此，本試驗(yàn)旨在研究青貯玉米中有氧暴露后營養(yǎng)品質(zhì)的變化規(guī)律及其與細(xì)菌群落多樣性變化間相關(guān)性，通過對其養(yǎng)分含量、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌多樣性指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，明確有氧暴露后青貯玉米細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)成分的相關(guān)性，得到營養(yǎng)成分發(fā)生明顯變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，為青貯飼料的安全飼喂和防止青貯飼料有氧腐敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于甘肅省蘭州市西固區(qū)達(dá)家臺，地處北緯39.96，東經(jīng)116.40，年平均溫度8.50℃，年平均日照達(dá)2 780 h，≥ 10℃的年有效積溫2 700～3 300℃，年平均降水量327.70 mm。

供試玉米品種：糧飼兼用型，‘和盛5288’玉米(ZeamaysL. ‘Hesheng 5288’)。

試驗(yàn)小區(qū)面積為180 m2，播種時采用精量機(jī)播，行距65 cm，種植密度600 000株·hm-2，于蠟熟期收割，留茬高度15 cm，晾曬至水分含量65%左右，揉絲機(jī)切碎，混合均勻后裝入鋁箔真空袋中，每袋裝500 g，制作27袋，使用真空機(jī)抽真空狀態(tài)并封口，自然發(fā)酵35 d后，同一時間將青貯袋全部打開。試驗(yàn)以有氧暴露0 h，1 h，8 h，24 h，36 h，48 h，72 h，96 h，120 h為9個處理，分別記為K0h，K1h，K8h，K24h，K36h，K48h，K72h，K96h，K120h各處理3次重復(fù)，隨機(jī)選取三袋，在超凈工作臺中每袋稱取20 g青貯飼料，放入無菌水中震蕩30 min，震蕩后的上清液過0.22 μm濾膜，將濾膜保存在—80℃冰箱中，用于總DNA提取。袋中剩余青貯玉米放置105℃烘箱，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過22目篩，進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)的測定。

1.2 測定指標(biāo)和方法

參照AOAC[13]常規(guī)方法測定粗蛋白(Crude protein，CP)、干物質(zhì)(Dry matter，DM)、鈣(Calcium，Ca)、磷(Phosphorus，P)和粗灰分(Coarse ash)含量，采用范式(Van Soest)洗滌纖維測定方法來測定中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)含量；采用蒽酮比色法來測定可溶性糖(Water solublecarbohydrate，WSC)含量。

青貯玉米總DNA提取及細(xì)菌16S rDNA：基因擴(kuò)增使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取，使用酶標(biāo)儀(基因有限公司Gene Company Limited，型號synergy HTX)檢測提取核酸的濃度，以該檢測濃度下DNA濃度為模板，對細(xì)菌16Sr DNA V4區(qū)引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用濃度1.80%的瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(北京博美富鑫科技有限公司)后建立檢測文庫。通過Qsep-400方法對文庫進(jìn)行質(zhì)檢合格后使用Illumina Novaseq6000進(jìn)行上機(jī)測序。下機(jī)后使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效序列(Effective Reads)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.00軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線，QIIME2軟件對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，Origin繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯玉米有氧暴露過程中營養(yǎng)品質(zhì)的變化

隨著有氧暴露時間延長(表1)，蛋白質(zhì)含量總體呈下降趨勢，K0h的粗蛋白含量最高，有氧暴露1 h后粗蛋白顯著降低(P<0.05)，K0h至K1h蛋白質(zhì)含量的降幅為4.91%，K0h至K24h和K96h蛋白質(zhì)含量的降幅為6.12%，7.67%；中性洗滌纖維的含量隨有氧暴露時間的增加顯著上升(P<0.05)，有氧暴露120h中性洗滌纖維含量增幅為31.88%，且K0h至K1h內(nèi)中性洗滌纖維含量增幅最大，增幅為8.90%；K0h至K120h酸性洗滌纖維含量增幅為31.96%，且K72h至K96h內(nèi)酸性洗滌纖維含量增幅最大，增加了7.60%；可溶性糖含量隨有氧暴露時間的延長顯著降低(P<0.05)，K0h至K8h和K120h可溶性糖含量降幅分別是8.12%和33.20%，有氧暴露48h之前可溶性糖含量下降速度較慢，有氧暴露48 h后可溶性糖含量快速下降，K0h至K8h與有氧暴露48h可溶性糖含量降幅分別是8.12%和10.90%；干物質(zhì)含量隨有氧暴露時間呈現(xiàn)下降趨勢，K120h顯著小于K0h(P<0.05)，有氧暴露120 h干物質(zhì)含量降幅為6.70%，干物質(zhì)含量在有氧暴露48h后開始快速下降。有氧暴露后磷和鈣含量在不同暴露時間無顯著差異；K96h的灰分含量顯著高于其他處理(P<0.05)。

表1 有氧暴露過程中青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的變化Table 1 Effects of aerobic exposure of different time on the nutritional quality of silage maize

2.2 青貯玉米有氧暴露過程中細(xì)菌群落豐度與Alpha多樣性分析

高通量測序結(jié)果可得(表2)，從有氧暴露0 h到120 h時間段內(nèi)的有效序列在39 740和66 229之間波動，OTUs的數(shù)目分別是542，598，560，609，563，562，544，544和528，圖1樣品稀釋曲線都趨于平緩，結(jié)合覆蓋度均在99%以上，表明本試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)的合理性與真實(shí)性。Chao1指數(shù)和ACE代表物種豐富度，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在K36 h時最大，其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均在K36h下顯著高于K0h(P<0.05)；覆蓋度在K0h下顯著高于K36h(P<0.05)；Shannon-wiener能同時反映豐富度和均勻度，Shannon-wiener指數(shù)差在K0h時最高，在有氧暴露1 h內(nèi)大幅下降，說明K0h時細(xì)菌多樣性最高，有氧暴露1h內(nèi)細(xì)菌多樣性大幅降低。由圖2可知由，各時間點(diǎn)共有OTUs數(shù)目為371個，其中0 h，1 h，8 h，24 h，36 h，48 h，72 h，96 h，120 h所特有的OTUs數(shù)目分別是3，1，1，3，2，3，2，2，2個。

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)、豐富度與多樣性指數(shù)Table 2 Sample sequence numbers statistics,richness and diversity index

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samples

圖2 樣品花瓣圖Fig.2 Flower diagrams of samples

2.3 青貯玉米有氧暴露過程中細(xì)菌群落分布

2.3.1門水平的細(xì)菌群落變化 由圖3可知，有氧暴露不同時間下玉米青貯飼料細(xì)菌群落相對豐度前十的細(xì)菌門分別為：厚壁菌門(Firmicutes)(30.19%～52.34%)，疣微菌門(Verrucomicrobia)(0.39%～1.65%)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(1.15%～3.54%)，變形菌門(Proteobacteria)(31.3%～42.05%)，棒狀桿菌門(Rokubacteria)(0.51%～1.27%)，酸桿菌門(Acidobacteria)(3.72%～11.87%)，藍(lán)藻門(Cyanobacteria)(0.28%～1.39%)，放線菌門(Actinobacteria)(4.58%～10.56%)，擬桿菌門(Bacteroidetes)(1.96%～4.22%)，綠彎菌門(Chloroflexi)(1.14%～2.53%)，占細(xì)菌總數(shù)的97.61%～99.22%，厚壁菌門和變形菌門為該分類水平下優(yōu)勢細(xì)菌。除綠彎菌門和棒狀桿菌門外，其余8個優(yōu)勢菌門相對豐度在不同有氧暴露時間下存在著一定的差異。厚壁菌門相對豐度在K0h下顯著高于K36h，K48h和K120h(P<0.05)，與其他時間差異不明顯；變形菌門相對豐度在K0h下顯著小于K72h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；酸桿菌門相對豐度在K0h下顯著低于K48h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；放線菌門相對豐度在K0h下顯著低于K120h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；擬桿菌門相對豐度在K96h顯著高于K72h(P<0.05)，與K0h及其他時間差異不顯著，芽單胞菌門相對豐度在K0h顯著低于K48h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；疣微菌門相對豐度在K36h下顯著高于K0h，K1h，K8h，K72h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；藍(lán)細(xì)菌門相對豐度在K8h下顯著高于K0h及其他時間；厚壁菌門與放線菌門是有氧暴露不同時間下的優(yōu)勢菌，厚壁菌門在K0h，K1h，K8h，K24h，K36h，K96h時為優(yōu)勢菌門，放線菌門在K48h，K72h，K120h時為優(yōu)勢菌門，在有氧暴露36 h內(nèi)厚壁菌門相對豐度呈下降趨勢，變形菌門相對豐度呈先升高后下降的趨勢，在整個有氧暴露過程中厚壁菌門相對豐度的升高時變形菌門相對豐度降低，兩者可能存在競爭關(guān)系。

2.3.2屬水平的細(xì)菌群落變化 由圖4可知，不同有氧暴露時間下玉米青貯飼料細(xì)菌群落相對豐度前十的細(xì)菌屬分別為：乳酸菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、魏斯氏菌屬(Weissella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、RB41和沙雷式菌屬(Serratia)，占細(xì)菌總數(shù)的42.58%～70.20%，在整個有氧暴露過程中各細(xì)菌屬相對豐度在不同暴露時間下存在一定的差異，乳酸菌相對豐度在有氧暴露過程占比最高。乳酸菌屬相對豐度呈先下降后上升的趨勢，魏斯氏菌屬變化趨勢與之恰好相反，兩個屬之間可能存在競爭關(guān)系，乳酸菌屬相對豐度在有氧暴露0 h下顯著高于其他時間(P<0.05)，明串珠菌屬相對豐度在K120h顯著小于K0h以及其他時間(P<0.05)；除K96h外，uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae相對豐度在K1h和K8h下顯著高于K36h(P<0.05)，與K0h差異不顯著，魏斯氏菌屬相對豐度在K72h下顯著高于K24h，K48h，K120h(P<0.05)與K0h差異不顯著；寡養(yǎng)單胞菌屬相對豐度在K0h下顯著高于K120h(P<0.05)，與其他時間差異不顯著；醋酸桿菌屬相對豐度在K48h下顯著高于K0h，K24h和K72h(P<0.05)，與其他處理差異不顯著；uncultured_bacterium_c_Subgroup_6相對豐度在K72h下差異顯著高于K0h及其他時間(P<0.05)，鞘脂單胞菌屬相對豐度在K48h下顯著高于K0h和K72h(P<0.05)，與其他處理差異不顯著，RB41相對豐度在K36h下顯著高于K0h(P<0.05)，與其他處理差異不顯著，沙雷式菌屬相對豐度在K120h下顯著小于K0h，K1h和K96h(P<0.05)，與其他處理差異不顯著。

圖3 門分類水平下的細(xì)菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial community at phylum level

圖4 屬分類水平下的細(xì)菌群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at genus level

2.4 青貯玉米有氧暴露過程中細(xì)菌群落多樣性與營養(yǎng)品質(zhì)的相關(guān)性

在有整個氧暴露過程中青貯玉米中厚壁菌門相對豐度與可溶性糖和蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；變形菌門相對豐度與磷含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；擬桿菌門相對豐度與鈣含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，綠彎菌門相對豐度與中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；藍(lán)藻門相對豐度與灰分含量成極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 青貯玉米有氧暴露過程中細(xì)菌群落與營養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)性熱圖Fig.5 Heat map of correlation between bacteria community and nutritional quality during aerobic exposure of silage maize注：圖5中“FRI”表示厚壁菌門；“PRO”表示變形菌門；“ACI”表示酸桿菌門；“ACT”表示放線菌門；“BAC”表示擬桿菌門；“GEM”表示芽單胞菌門；“CHL”表示綠彎菌門；“VER”表示疣微菌門；“ROK”表示棒狀桿菌門；“CYA”表示藍(lán)藻門Note:In figure 5 “FRI” means Firmicutes；“PRO” means Proteobacteria；“ACI” means Acidobacteria；“ACT” means Actinobacteria；“BAC” means Bacteroidetes；“GEM” means Gemmatimonadetes；“CHL” means Chloroflexi；“VER” means Verrucomicrobia；“ROK” means Rokubacte

3 討論

3.1 有氧暴露時間對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)中隨用于暴露時間延長蛋白質(zhì)、可溶性糖和干物質(zhì)含量升高，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量降低。有氧暴露后空氣通過青貯面滲透至青貯飼料中[14]，隨青貯飼料中氧氣濃度的增加植物蛋白酶的活性升高[15]，同時厚壁菌門的大部分細(xì)菌可以分解蛋白質(zhì)[16-17]，兩者導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低；在有氧暴露初期，好氧細(xì)菌開始大量繁殖，將可溶性糖和蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)化為二氧化碳，這種以氣體形式損失的干物質(zhì)含量增加了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的比例[18]，同時降解纖維素的厚壁菌門相對豐度降低，可能具有纖維素分解能力的酸桿菌含量較少[19-20]，減緩了纖維素的分解；可溶性糖含量下降可能是好氧微生物和乳酸菌將可溶性糖分解成水、CO2和熱量[21]所致；可溶性糖等被好氧細(xì)菌降解和利用導(dǎo)致干物質(zhì)減少，這與Queiroz等[22]研究結(jié)果相一致。有氧暴露1 h內(nèi)粗蛋白和可溶性糖含量大幅度下降，理論上應(yīng)在有氧暴露1 h內(nèi)完成飼喂，這樣能夠有效防止?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)的流失和好氧細(xì)菌大量繁殖，但在實(shí)踐生產(chǎn)中，1 h內(nèi)全部完成利用的難度大，有氧暴露8 h內(nèi)在滿足了蛋白質(zhì)和干物質(zhì)含量高的同時，也要保證可溶性糖含量高，是最適的飼喂時間。

3.2 有氧暴露后細(xì)菌及其青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的相互影響

青貯原料的營養(yǎng)成分會影響青貯過程中微生物菌群的多樣性[23]，同樣微生物多樣性也與青貯品質(zhì)有一定的相關(guān)性[24]。Shannon-wiener指數(shù)差在K0h與K1h間最高，此時青貯飼料中細(xì)菌多樣性下降，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌屬越豐富，細(xì)菌群落的多樣性越少[25]，同時有氧暴露使厭氧細(xì)菌和兼性厭氧菌生長與繁殖受阻，導(dǎo)致細(xì)菌多樣性在短時間內(nèi)下降。K1h至K36h隨有氧暴露時間延長好氧細(xì)菌的滋生，細(xì)菌多樣性逐漸增加，在K36h時物種豐富度最高。乳酸菌屬在K0h下相對豐度最高，乳酸菌是典型的厭氧微生物，在厭氧情況下才可進(jìn)行正常的生命活動[26]，有氧暴露后可能抑制了部分乳酸菌的繁殖。明串珠菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬的相對豐度均在K120h顯著小于K0h，明串珠菌屬是兼性厭氧細(xì)菌，具有抑菌特性[27]，寡養(yǎng)單胞菌屬為好氧細(xì)菌，有氧暴露后氧氣充足，導(dǎo)致明串珠菌屬相對豐度降低，寡養(yǎng)單胞菌屬相對豐度降低可能是明串珠菌屬的抑菌作用導(dǎo)致。

本試驗(yàn)中綠彎菌門相對豐度與中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，有氧暴露后綠彎菌門相對豐度增加，研究發(fā)現(xiàn)部分綠彎菌門細(xì)菌具有捕食作用，能分泌大量不同種類的水解酶對宿主細(xì)菌消化吸收[28-29]，可能導(dǎo)致分解纖維素的部分細(xì)菌死亡，對中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解減慢；變形菌門在水體脫氮除磷過程中起重要作用[30]，強(qiáng)茹茹等[31]對解磷菌劑的研究表明在不同試驗(yàn)處理下，變形菌門的相對豐度均高于其他細(xì)菌門，有氧暴露后變形菌門相對豐度與青貯飼料中的磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，這進(jìn)一步驗(yàn)證了變形菌門對磷有降解作用。

4 結(jié)論

本研究表明，青貯玉米在有氧暴露過程中可溶性糖、粗蛋白和干物質(zhì)含量降低；有氧暴露1小時后蛋白質(zhì)含量顯著下降，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著升高；有氧暴露8 h前可溶性糖和干物質(zhì)含量變化不明顯；灰分、鈣和磷含量隨有氧暴露時間變化不明顯。

有氧暴露36 h后細(xì)菌多樣性最高；優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門和放線菌門，優(yōu)勢菌屬為乳酸菌屬；厚壁菌門、變形菌門和酸桿菌門對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)有顯著影響。與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，為防止?fàn)I養(yǎng)成分大量流失，青貯玉米應(yīng)在有氧暴露8 h內(nèi)完成飼喂。