宋婉晴，李俊發(fā)，崔 旭*

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 麻醉科，北京 100730；2.首都醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069

腦缺血/低氧損傷是缺血性卒中常見的病理生理過程，發(fā)病率、致死致殘率高, 目前臨床上仍缺乏有效的治療方法[1]。缺血/低氧預(yù)處理(ischemic-hypoxia preconditioning，I/HPC)是指在短時(shí)間內(nèi)給予機(jī)體亞致死性缺血/低氧刺激后，可顯著提高機(jī)體對(duì)繼發(fā)嚴(yán)重缺血/低氧事件耐受性的方法。

I/HPC可以用藥物預(yù)處理促進(jìn)內(nèi)源性物質(zhì)釋放或作用于信號(hào)通路來模擬。Herkinorin作為半合成阿片受體激動(dòng)劑，可通過調(diào)節(jié)短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)致缺血性卒中小鼠腦皮層半影區(qū)內(nèi)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)膜轉(zhuǎn)位水平，來發(fā)揮腦保護(hù)作用[2-3]。早期研究顯示，Herkinorin通過抑制NF-κB/NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)通路，減輕氧-糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)神經(jīng)元缺血損傷[4]。本研究擬在大鼠tMCAO模型上，進(jìn)一步探討Herkinorin對(duì)NLRP3的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量 200～220 g，雌雄各半 [南京大學(xué)動(dòng)物模式中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：Herkinorin、TTC染液(Sigma-Aldrich公司)；蛋白抽提試劑盒(Sangon公司)；PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；TUNEL染色試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；GAPDH抗體、IL-1β抗體、NLRP3抗體、p-p65抗體和p65抗體(Abcam公司)；β-抑制蛋白2(β-arrestin2)抗體、IκBα抗體、phos-IκBα抗體、Na-K ATPase抗體和caspase-1抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為假手術(shù)組(sham)、模型組(tMCAO)、Herkinorin組(Herkinorin)，每組6只。模型(tMCAO)組及Herkinorin組大鼠進(jìn)行造模處理-左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞2 h后再灌注24 h。Herkinorin組大鼠造模前腹腔給藥Herkinorin(10 mg/kg)1周，每天1次，缺血過程中給藥1次，sham組及tMCAO組給予等體積1% DMSO。再灌注24 h后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分、TTC染色、TUNEL染色、Western blot檢測(cè)和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分-神經(jīng)功能正常；1分-輕度神經(jīng)功能缺損：提尾時(shí)，動(dòng)物的左前肢屈曲；2分-中度神經(jīng)功能缺損：將動(dòng)物置于光滑平面上行走，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分-中度神經(jīng)缺損：靜止?fàn)顟B(tài)下，向左側(cè)傾斜；4分-意識(shí)減退，肢體無自發(fā)活動(dòng)；5分-對(duì)刺激無應(yīng)答或死亡。

1.2.3 TTC染色檢測(cè)腦梗死百分比及腦水腫率：取大鼠全腦視交叉及其前后各2 mm處的腦組織，置于含有2% TTC的磷酸緩沖溶液中，37 ℃避光溫孵10 min后取出腦片，用數(shù)碼相機(jī)拍照，通過Image pro-plus 6.0計(jì)算梗死百分比如下：梗死百分比(%)=蒼白區(qū)質(zhì)量/(蒼白區(qū)質(zhì)量+非蒼白區(qū)質(zhì)量)×100%。將染色后的腦組織置于105 ℃烘箱烘干，24 h后稱重(干重)。腦水腫率計(jì)算公式如下：腦組織含水量(%)=(1-腦組織干重/腦組織濕重)×100%；腦水腫率(%)=[各組腦組織含水量(%)-sham組腦組織含水量(%)]/sham組腦組織含水量(%)×100%。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取缺血半影區(qū)腦組織制成石蠟切片，置于電熱恒溫干燥箱中，60 ℃烘烤3 h，用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照說明書標(biāo)記后用蘇木精復(fù)染，用相差顯微鏡隨機(jī)選擇一個(gè)視野使用400×倍視野下拍照，細(xì)胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá): 取缺血半影區(qū)腦組織，制備全細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品、定量、電泳和轉(zhuǎn)膜后，分別加入一抗和二抗，用ECL發(fā)光顯色。將PVDF膜放入數(shù)碼凝膠圖像分析儀進(jìn)行曝光，所得圖片采用Image J 件進(jìn)行掃描。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算IκBα、p65、p-p65、pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase1、caspase1 p20、NLRP3的表達(dá)水平。

1.2.6 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測(cè)IκBα與β-arrestin2結(jié)合：取缺血半影區(qū)腦組織，Co-IP檢測(cè)IκBα與β-arrestin2結(jié)合水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Herkinorin預(yù)處理改善缺血性卒中鼠神經(jīng)功能評(píng)分

與sham組相比， tMCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著增加(P<0.01)；而與tMCAO組相比，Herkinorin組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降(P<0.01)(圖1D)。

2.2 Herkinorin預(yù)處理降低缺血性卒中鼠腦梗死百分比和腦水腫率

與sham組相比，tMCAO組大鼠腦梗死百分比與腦水腫率增加(P<0.01)；與tMCAO組相比，Herkinorin組大鼠腦梗死百分比與腦水腫率下降(P<0.01)(圖1A～C)。

2.3 Herkinorin預(yù)處理降低缺血性卒中鼠腦細(xì)胞凋亡水平

與sham組相比，tMCAO組大鼠腦組織缺血半影區(qū)中的細(xì)胞凋亡水平增加(P<0.01)；與tMCAO組相比，Herkinorin組大鼠腦組織缺血半影區(qū)中的細(xì)胞凋亡水平下降(P<0.01)(圖1E～F)。

A.TTC staining; B.brain infarct area percentage; C.cerebral edema rate; D neurological scores; E, F.TUNEL staining; *P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with tMCAO group

2.4 Herkinorin預(yù)處理對(duì)缺血性卒中鼠腦半影區(qū)內(nèi)IκBα、p65、p-p65、pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase1、caspase1 p20和NLRP3蛋白水平的影響

與sham組相比，tMCAO組大鼠腦組織缺血半影區(qū)內(nèi)IκBα和p65蛋白水平下降(P<0.01，圖2A～C)；p-p65(圖2A，D)、IL-1β(圖2A，E～F)、caspase1 p20(圖2A，G～H)和NLRP3(圖2A，I)蛋白水平增加(P<0.01)。與tMCAO組相比，Herkinorin組大鼠腦組織缺血半影區(qū)內(nèi)IκBα和p65蛋白水平增加(P<0.01，圖2A～C)；p-p65(圖2A，D)、IL-1β(圖2A，E～F)、caspase1 p20(圖2A，G～H)和NLRP3(圖2A，I)蛋白水平下降(P<0.01)。

2.5 Herkinorin預(yù)處理提高缺血性卒中鼠腦半影區(qū)內(nèi)IκBα與β-arrestin2的結(jié)合水平

與sham組相比，tMCAO組大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)IκBα與β-arrestin2結(jié)合水平下降(P<0.01)；但與tMCAO組相比，Herkinorin預(yù)處理可提高鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)IκBα與β-arrestin2的結(jié)合水平(P<0.01)(圖2J)。

A, B.expression of IκBα; A, C.expression of p65; A, D.expression of p-p65; A, E.expression of pro-IL-1β; A, F.expression of IL-1β; A, G.expression of pro-caspase1; A, H.expression of caspase1 p20; A, I.expression of NLRP3; J.interaction of IκBα and β-arrestin2

3 討論

Herkinorin是以salvinorin A為模板合成的阿片受體激動(dòng)劑，其與β-arrestins親和力低，在激動(dòng)阿片受體的同時(shí)較少募集β-arrestins，不導(dǎo)致受體內(nèi)化，這一特性使Herkinorin既具備傳統(tǒng)阿片類藥物的治療作用，又大大減少了藥物耐受、便秘、呼吸抑制等不良反應(yīng)[2]。

NLRP3異常活化關(guān)系到多種疾病的發(fā)生發(fā)展。NLRP3的激活與卒中后神經(jīng)細(xì)胞死亡及行為缺陷密切相關(guān)，抑制NLRP3激活可減輕神經(jīng)元缺血/再灌注損傷[5-7]。

NF-κB通常以p50-p65異二聚體的形式與其抑制性蛋白IκBα結(jié)合而呈非活化狀態(tài)，其通過復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)機(jī)制參與機(jī)體的慢性炎性反應(yīng)[8]。研究顯示， 楊梅花青素通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制NLRP3激活，從而減輕腦缺血/再灌注損傷[9]；環(huán)境刺激通過抑制NF-κB信號(hào)通路降低NLRP1/NLRP3活性，從而減輕腦缺血/再灌注損傷[10]。

前期研究發(fā)現(xiàn)Herkinorin降低大鼠OGD神經(jīng)元中caspase-1、IL-1β的活化程度及NLRP3的表達(dá)水平，而μ阿片受體(μ opioid receptor，MOR)抑制劑β-funaltrexamine可以逆轉(zhuǎn)此作用。Herkinorin可明顯抑制NF-κB通路的活化，降低p65的磷酸化水平，上調(diào)IκBα的表達(dá)，而MOR基因敲除后Herkinorin上述能力消失。這說明Herkinorin可能通過MOR途徑降低OGD神經(jīng)元中p65磷酸化水平，抑制NF-κB/NLRP3通路表達(dá)。而本研究在tMCAO大鼠中進(jìn)一步驗(yàn)證了此作用機(jī)制。

阿片受體是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)。GPCRs激活后，細(xì)胞外信號(hào)通過兩個(gè)信號(hào)通路傳遞到細(xì)胞內(nèi)：G蛋白通路和β-arrestins通路。在G蛋白通路中, GPCRs活化后募集β-arrestins，β-arrestins促進(jìn)GPCRs和G蛋白解偶聯(lián)及受體內(nèi)化，阻止下游效應(yīng)因子激活，介導(dǎo)受體脫敏；在β-arrestins通路中，β-arrestins與Src、Raf-I、Akt、ERKl/2、JNK3、Mdm2和IκBα等信號(hào)分子形成復(fù)合物，調(diào)控MAPK、P53、NF-κB信號(hào)通路[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Herkinorin處理大鼠OGD神經(jīng)元后，IκBα與β-arrestin2結(jié)合量增加，IκBα泛素化水平降低。而β-arrestin2基因敲除后，Herkinorin抑制NF-κB通路活化，降低p65磷酸化水平，上調(diào)IκBα表達(dá)，降低 IκBα泛素化的能力消失。這說明Herkinorin抑制NF-κB通路活化可能是通過增加β-arrestin2與IκBα結(jié)合、降低IκBα泛素化實(shí)現(xiàn)的。本研究也發(fā)現(xiàn)， Herkinorin可增加IκBα與β-arrestin2的結(jié)合，穩(wěn)定IκBα并抑制NF-κB激活，這表明IκBα與β-arrestin2在Herkinorin對(duì)tMCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，Herkinorin可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路減輕tMCAO大鼠腦缺血/再灌注損傷，這可能是通過增加IκBα與β-arrestin2結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。