劉必旺，趙換，周文靜，路榮榮，曹越

（1.山西中醫(yī)藥大學傅山學院，山西 榆次 030619； 2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；3.山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山西 太原 030024）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，造成的急性低氧性呼吸功能不全［1］。依據(jù)歐美聯(lián)席會議的ALI診斷標準，近年來ALI在美國的發(fā)病率每年79/10萬。據(jù)研究，嚴重感染患者中有25% ～ 50%會發(fā)生ALI/ARDS（急性呼吸窘迫綜合征）［2］。

黃芪具有補中益氣、益衛(wèi)固表、升陽舉陷等功效，其成分或制劑具有改善肺功能、保護肺臟的作用，可以降低脂多糖致急性肺損傷（ALI）模型大鼠呼吸頻率、提高PaO2，顯著改善ALI導致的ARDS［3-4］。

黃芪發(fā)酵產(chǎn)物（HF）是通過酵母菌將黃芪發(fā)酵制得。據(jù)有關文獻報道，通過發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化技術，可以產(chǎn)生多種酶，使纖維素、半纖維素等構(gòu)成的細胞壁發(fā)生裂解，促進中藥有效成分釋放，甚至產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，從而可能改善其生物利用度，提高藥效［5］。含量檢測發(fā)現(xiàn)，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物中黃芪甲苷等化學成分含量增高［6］，且黃芪中的許多化學成分有改善肺功能、保護肺臟的功效［7］。

近紅外熒光活體小動物成像研究是近年來應用于動物實驗探討炎性的一項新技術。本研究以脂多糖復制ALI小鼠模型，觀察HF對ALI模型小鼠TNF－α、IL－1、IL－6及TLR4表達的影響，并采用近紅外熒光活體小動物成像技術闡釋其保護肺組織免受炎性因子損傷的機制，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量（20 ± 2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2016－0011。實驗單位使用許可證編號：SYXK（晉）2020－0006。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。本研究經(jīng)過山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，符合實驗動物倫理委員會指導原則。

1.2 藥品

黃芪于2018年8月采自山西省應縣南泉鄉(xiāng)麻峪村（北緯N39°20'59.80″，東經(jīng)E113°14'46.46″），經(jīng)應縣乾寶黃芪種植專業(yè)合作社專家劉仲秀鑒定為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus memeranaceus（Fisch） Bge. var.mongholicus （Bge.） Hsiao］的根，3～4年半野生藥材。分別用干凈的實驗刷子刷掉表面泥土至潔凈，置50～60 ℃真空干燥箱中干燥120 min，取出，粉碎后過4號篩，備用。舒普深（頭孢哌通舒巴坦鈉，美國輝瑞制藥有限公司，批號：cr5630）。

1.3 試劑

水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20191010，使用生鹽水溶液配制為濃度10%，于常溫保存）；RDye?800CW 2－DG Optical Probe（C60728－01）（美國LI－COR公司，批號：C60728－01）；脂多糖（美國Sigma公司，批號：L2630，使用前量取5 mg脂多糖溶于100 mL生理鹽水中，4 ℃保存）；PBS緩沖液（批號：03C30C21）、TNF－α（批號：af7108）、IL－6（批號：20201119）、IL－1（批號：20201208）、TLR4檢測試劑盒（批號：20210324）、β－actin檢測試劑盒（批號：20210203）（武漢博士德生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，批號：A8024，華美生物有限責任公司）；BCA蛋白定量試劑盒（批號：CW0016s，美國PIERCE公司）。

1.4 儀器

MGC－350 HP人工氣候箱（上海一恒科學儀器有限公司）；VORTEX－5漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；YC－D209E超聲波加濕器（北京亞都環(huán)?？萍加邢薰荆籔earl Trilogy近紅外熒光小動物活體成像系統(tǒng)（美國LI－COR公司）；EL204萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；BCD－206STPQ海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；Option R7純水系統(tǒng)（英國ELGA科技有限公司）。

1.5 黃芪發(fā)酵產(chǎn)物及其混懸液的制備

取安琪釀酒高活性干酵母150 g、蛋白胨100 g、麥芽糖300 g，加入5 000 mL 35～38 ℃的0.2%糖水活化30 min，然后加入5 000 g黃芪藥材粉末與15 000 mL 37 ℃的蒸餾水，充分攪拌均勻。保鮮膜封口放置于提前設定好38 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)液體深層發(fā)酵7 d［8］。將發(fā)酵好的藥材放置在電熱恒溫鼓風干燥箱中3 h（溫度設定為120 ℃）烘干，殺菌，研磨，即得黃芪發(fā)酵產(chǎn)物（HF）。采用HPLC－ELSA法測定發(fā)酵后黃芪甲苷的含量為1.337 mg/g。實驗時根據(jù)實驗所需以純水配成相應濃度的混懸液。

1.6 分組及給藥

實驗動物依據(jù)隨機數(shù)字表隨機分成空白對照組、模型組、舒普深組、HF低劑量組、HF中劑量組和HF高劑量組，每組10只，并標記?？瞻讓φ战M不造模，蒸餾水灌胃干預。其余各組造模處理后，根據(jù)既往研究結(jié)果并結(jié)合臨床劑量，模型組蒸餾水灌胃，舒普深組按0.3 g/kg劑量灌胃，HF低、中、高劑量組分別按黃芪生藥量12.5、25、50 g/kg灌胃干預，連續(xù)4周。

1.7 模型復制

根據(jù)文獻［9－11］，在實驗第1周和第3周，按標記分10次從模型組、舒普深組、HF低劑量組、HF中劑量組和HF高劑量組取不同標記的小鼠各1只，放入自制的密閉艙中。在做好實驗者防護措施的前提下，抽取10 mL的脂多糖溶液進行霧化處理，并將低濃度的脂多糖霧化氣體通入密閉艙，30 min后將小鼠從密閉艙中取出，進行下一批小鼠的染毒處理，共10批次完成染毒。

1.8 一般狀態(tài)觀察及體質(zhì)量檢測

每日觀察并記錄小鼠的飲食情況及精神狀態(tài)等一般狀態(tài)。實驗前及實驗中每周稱量并記錄小鼠體質(zhì)量。

1.9 近紅外熒光小鼠活體成像觀察

將近紅外熒光分子探針I(yè)RDye?800CW 2－DG凍干粉，放入微量迷你離心機中，離心5 min，用1 mL無菌PBS溶解為濃度0.1 nmol/μL水溶液，避光儲存在4 ℃冰箱。末次灌胃1 h后，通過尾靜脈注射15 nmol的2－DG探針。探針注入24、48、72、96 h后，以10%水合氯醛，按0.04 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，實驗動物不反抗后，放入近紅外熒光小動物成像系統(tǒng)中，動態(tài)監(jiān)測熒光探針2－DG在小鼠體內(nèi)的代謝與分布，所得的圖像在同一熒光（800 nm）通道下進行顯示，并分析其熒光強度［12-13］。

1.10 ELISA法檢測小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－1水平

近紅外熒光活體成像觀察后，3 d內(nèi)，眼球取血，離心血清，使用TNF－α、IL－6、IL－1的酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒檢測血清中TNF－α、IL－6、IL－1的含量。

1.11 Western blot 檢測肺組織TLR4的表達

小鼠取血后，取右肺進行組織蛋白的提取。配置SDS－PAGE分離膠，制備凝膠，上樣后接通凝膠電泳儀的電源，進行電泳及轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜封入塑料袋中，加入BSA稀釋的一抗（β－actin，TLR4）。以TBST洗膜，再將PVDF膜封入塑料袋中，加入BSA稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗，常溫搖動1～1.5 h，以TBST洗膜。將化學發(fā)光試劑盒ECL中的兩種試劑混合，在暗室中滴加到膜上，將所有條帶放入普利萊避光片盒中，壓緊蓋子進行曝光，KODAK曝光系統(tǒng)進行檢測。將每個條帶的相對強度通過其對應的β－actin進行歸一化處理，然后使用圖像分析軟件進行半定量分析。

1.12 肺病理學觀察

小鼠取血后，取左肺浸入10%中性福爾馬林溶液中固定。至少48 h后，經(jīng)水沖洗固定液，酒精梯度脫水后包埋；3～5 μm切片，60 ℃烤片，采用蘇木素－伊紅（HE）染色；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹膠封片，對各實驗組的肺臟進行光鏡檢查。

1.13 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0和Origin 7.5軟件進行分析，計量資料以均數(shù) ± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠不同時間點一般狀態(tài)和體質(zhì)量的比較

空白對照組小鼠表現(xiàn)正常，呼吸平穩(wěn)，攝食飲水正常，皮毛光亮，體質(zhì)量逐漸增加。模型組小鼠造模后活動減少，呼吸急促，反應靈敏度變差，毛發(fā)干燥晦暗。第14、21、28天模型組小鼠體質(zhì)量顯著低于空白對照組，第21、28天的模型組與空白對照組比較，小鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。第28天舒普深組、HF中劑量組、HF高劑量組與模型組比較，小鼠體質(zhì)量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。詳見表1。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善脂多糖造模的小鼠體質(zhì)量的減輕情況，起到增加體質(zhì)量的作用。

表1 不同時間點各組小鼠體質(zhì)量比較（ ± s，g）

表1 不同時間點各組小鼠體質(zhì)量比較（ ± s，g）

注：與空白對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

第28天30.6 ± 1.7 24.2 ± 2.8**29.4 ± 2.4##26.2 ± 2.7 26.5 ± 2.5#28.9 ± 2.9##組別空白對照組模型組舒普深組HF低劑量組HF中劑量組HF高劑量組n 10 10 10 10 10 10第0天20.5 ± 1.4 20.8 ± 1.2 19.9 ± 1.7 20.4 ± 1.4 19.6 ± 1.6 20.1 ± 1.3第7天23.4 ± 1.3 22.5 ± 2.8 22.5 ± 2.8 23.5 ± 2.8 22.5 ± 2.8 23.5 ± 2.8第14天26.7 ± 1.6 23.3 ± 2.3*25.6 ± 2.5#24.3 ± 2.5 24.7 ± 2.6 25.4 ± 2.3第21天28.1 ± 1.6 24.5 ± 2.1**27.9 ± 2.7#25.5 ± 2.5 25.6 ± 2.2 27.4 ± 2.5#

2.2 各組小鼠近紅外熒光小鼠活體成像的比較

尾靜脈注射2－DG熒光探針24 h后，各組可觀察到小鼠體內(nèi)的熒光信號。注射48 h后，2－DG探針對炎癥特異性靶向效果良好，達到濃聚高峰，與空白對照組比較，模型組熒光成像非常明顯，提示48 h時段可作為觀察炎癥的最佳成像時段；各組組間比較，模型組小鼠體內(nèi)的熒光信號最強。注射72 h后，各組熒光信號減弱，說明2－DG探針開始逐漸排出體外。模型組小鼠持續(xù)成像96 h，仍可在炎癥部位觀察到熒光信號。與模型組比較，HF高劑量組小鼠對2－DG探針在不同時刻近紅外熒光明顯減弱。48 h時段近紅外熒光活體成像結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組熒光信號都減弱。具體見圖1、圖2。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善脂多糖小鼠炎性反應，起到抗炎的作用。

圖1 小鼠活體成像熒光強度折線圖

圖2 近紅外熒光小鼠活體成像48 h時段觀察圖

2.3 各組小鼠血清炎性因子水平的比較

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中的TNF－α、IL－1、IL－6升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。與模型組比較，HF中劑量組的TNF－α、IL－6的水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；HF高劑量組的TNF－α、IL－1、IL－6的水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見表2。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物在一定程度上能夠降低脂多糖誘導的血清炎性因子的水平。

表2 各組小鼠血清促炎細胞因子水平比較（ ± s， pg/mL）

表2 各組小鼠血清促炎細胞因子水平比較（ ± s， pg/mL）

注：與空白對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01。

IL－1 21.61 ± 1.29 26.53 ± 3.67*22.23 ± 2.94#26.17 ± 3.41 24.63 ± 3.39 23.19 ± 3.53#組別空白對照組模型組舒普深組HF低劑量組HF中劑量組HF高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF－α 108.42 ± 12.16 183.25 ± 33.05**137.43 ± 26.71##171.62 ± 29.90 168.11 ± 26.83#142.68 ± 29.15##IL－6 40.31 ± 1.86 57.59 ± 3.65*43.19 ± 2.08#53.73 ± 4.09 47.39 ± 3.94#45.35 ± 2.03#

2.4 各組小鼠肺病理學的比較

空白對照組小鼠肺組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯病變；模型組肺組織上皮細胞不完整、管腔狹窄管壁皺縮、基底膜增厚，肺泡間隔增寬充血，可見大量炎性細胞浸潤；HF各劑量組管腔內(nèi)有滲出物，肺間質(zhì)增厚且有大量炎性細胞浸潤等不同程度病理性改變，其中HF中劑量組炎性細胞浸潤及黏液分泌相對較少。見圖3。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物能夠降低脂多糖小鼠的肺組織損傷程度。

圖3 各組小鼠肺組織病理學變化的比較（HE染色，×200）

2.5 各組小鼠對TLR4表達的比較

與空白對照組比較，模型組TLR4蛋白表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。與模型組比較，HF高劑量組TLR4表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖4。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物能夠通過TLR4途徑拮抗脂多糖誘發(fā)的炎性反應。

圖4 各組小鼠對TLR4表達的影響

3 討論

近年來，近紅外熒光成像技術越來越廣泛地應用于實驗室和臨床前研究。該技術一鍵采集，成像迅速，靈敏度高，具有較強的組織穿透力，更好的信號強度，能夠?qū)崟r、無創(chuàng)地完成在體持續(xù)成像監(jiān)測等工作［12］。熒光探針2－DG是利用GLUT轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞的葡萄糖類似物，磷酸化后被有效地捕獲在細胞內(nèi)［13］。許多炎癥的特征是代謝率升高，特別是對葡萄糖的攝取增強。2－DG作為葡萄糖的替代物，進入動物機體后，可被炎癥組織靶向性攝取，所以可以進行近紅外熒光成像系統(tǒng)進行評估分析的研究［14］。本研究結(jié)果可見，模型組和各給藥組組內(nèi)比較，48 h時段熒光信號最佳；組間比較，72、96 h時段熒光信號模型組熒光信號最強，各給藥組不同程度的熒光信號減弱，說明模型組炎癥最重，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗炎、保護肺組織的作用。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是引起ALI的主要原因之一，脂多糖誘導法是ALI動物模型的主要方法之一。TLR4是Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）之一，TLR4在肺內(nèi)多種細胞中均有表達，在肺損傷中起重要作用。有文獻報道，黃芪可改善脂多糖所致大鼠ALI，脂多糖通過TLR4系統(tǒng)的信號通路引起ALI［15］。TLR4系統(tǒng)的信號通路主要為TLR4與髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MD）形成復合物，激活酪氨酸蛋白激酶（Src），介導NF－κB亞基的核轉(zhuǎn)位，啟動TNF－α、IL－6、IL－1等促炎性因子的合成和釋放，促進血管內(nèi)皮細胞黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）表達，引發(fā)炎癥反應。本實驗研究了黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對TLR4、TNF－α、IL－6、IL－1等指標的影響，這些指標都有所改善，說明黃芪發(fā)酵產(chǎn)物一定程度上可以抑制脂多糖引起ALI。TLR4系統(tǒng)的信號通路還有其他指標，如Src、NF－κB、ICAM－1及其他促炎性因子等。雖然本實驗沒有對Src、NF－κB、ICAM－1等進行研究，實驗結(jié)果仍可以說明黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可通過TLR4通路拮抗脂多糖炎性反應。見圖5。

圖5 黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對TLR4通路的影響

黃芪有廣泛的生物活性和良好的保健功能，關于黃芪的研究也日益受到國際關注。在美國出版的許多關于植物食品的書籍中，黃芪是位列第一的中藥材。中藥發(fā)酵技術可以將現(xiàn)代生物技術和中醫(yī)藥研究進行完美結(jié)合，在中醫(yī)藥研究開發(fā)與利用等方面提供了新的思路。中藥材的發(fā)酵具有2 000多年的歷史，但有關黃芪的發(fā)酵研究本世紀初才有所報道，目前研究還相對較少。近年來，本研究團隊一直致力于黃芪的發(fā)酵研究，推動中藥發(fā)酵技術的發(fā)展。中藥發(fā)酵比一般的物理、化學方法炮制中藥更能大幅度地改變藥性，為了解中藥的功效，開發(fā)新藥等提供了新的手段。

本實驗以黃芪發(fā)酵產(chǎn)物為研究對象，建立急性肺損傷（ALI）小鼠模型，通過觀察小鼠的一般狀態(tài)及體質(zhì)量、ELISA法檢測小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－1水平，Western blot檢測肺組織TLR4的表達情況，及近紅外熒光小鼠活體成像觀察和肺病理學觀察，探討了黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對ALI的影響。結(jié)果顯示，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善小鼠體質(zhì)量的降低的情況，降低脂多糖誘導的血清TNF－α、IL－1、IL－6炎性因子的水平，降低TLR4的表達水平，降低脂多糖小鼠的肺組織損傷程度。綜上所述，采用近紅外熒光成像系統(tǒng)初步確定黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對ALI有較好的保護作用，通過TLR4通路，保護肺組織免受炎性因子的損傷，為下一步新藥開發(fā)及臨床應用提供了實驗依據(jù)。