胡學會, 閆 紅, 吳計劃, 趙忠禮, 汪曉翠, 楊 斌

(1. 安徽省兒童醫(yī)院 神經內科, 安徽 合肥, 230000; 2. 中國科學技術大學第一附屬醫(yī)院 臨床病理中心, 安徽 合肥, 230001)

脊髓性肌萎縮癥(SMA)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由5號染色體運動神經元生存基因(SMN)突變導致。2018年, SMA被列入中國《第一批罕見病目錄》，發(fā)生率僅約1/10 000[1]。人類SMN基因有SMN1和SMN2,SMN1基因主要編碼蛋白基因,SMN2是備用基因，也是SMA的主要疾病修飾因子[2]。根據發(fā)病年齡和達到的最大運動里程碑, SMA分為0、1、2、3、4共5型[3]。SMA患者的肌無力、肌萎縮癥狀，主要是由于患者體內不能編碼產生足夠的SMN蛋白，其缺失導致脊髓前角運動神經元逐漸丟失，進而引發(fā)一系列臨床表現，重型可導致死亡。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類內源性非編碼RNA分子(ncRNA), 具有高度保守、結構穩(wěn)定、自然抵抗外切酶的降解和組織特異性等優(yōu)點，有成為生物標志物的巨大潛力[4-6]。多項研究[7-11]表明circRNA參與了神經退行性疾病并扮演了重要的角色，例如顳葉癲癇、阿爾茲海默癥、帕金森病、多發(fā)性硬化癥以及肌萎縮性脊髓側索硬化癥。本研究通過芯片技術篩選兒童SMA2型患者和健康人群血漿中顯著差異表達的circRNA, 并分析這些circRNA可能參與的生物學過程及通路，同時構建circRNA-miRNA網絡，從circRNA的視角探討SMA的發(fā)病機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年9月—2022年3月安徽省兒童醫(yī)院收治的5例SMA2型患兒作為SMA組。收集患兒的性別、就診年齡、發(fā)病年齡、肌張力、骨密度以及遺傳學等臨床資料。所有患兒按照《脊髓性肌萎縮癥遺傳學診斷專家共識》[12]的標準進行診斷及分型。另選取同期年齡匹配的5例健康兒童作為對照組。納入標準為: 患兒就診時年齡不超過18歲，未接受基因修飾治療; 排除合并其他系統(tǒng)性疾病者，排除SMN1基因外顯子發(fā)生純合性缺失及拷貝數異常者。本研究已通過安徽省兒童醫(yī)院倫理委員會批準(批件號: EYLL-2020-015), 全部受試者及其監(jiān)護人均知曉并簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA樣品抽提和上機測序: 采集2組受試者的空腹靜脈血各5 mL置于抗凝管中, 4 ℃低溫下1 200轉/min離心10 min, 吸取上層液體分離出血漿，保存于-80 ℃冰箱中。采用Trizol法對血漿中游離RNA進行抽提。采用NanoDrop檢測方法測定RNA濃度和純度。采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA的完整性。樣品質檢合格后，取1～10 ng RNA, 使用Clontech SMARTer Stranded Total RNA seq kit V2 pico input試劑盒進行文庫構建，所有樣品的互補DNA文庫均采用Illumina HiSeq 2000測序平臺(廣州吉賽生物科技股份有限公司)進行測序。

1.2.2 差異circRNAs的篩選: 對獲得的原始數據進行過濾，同時刪掉接頭序列、含N較多的序列及低質量的reads, 獲得高質量數據(clean reads); 將clean reads與參考基因組進行比對，比對結果用于下一步 circRNA的鑒定。采用 DCC軟件綜合鑒定circRNA, 得到高可信circRNA。應用edgeR工具進一步對鑒定到的circRNA進行序列預測、表達值計算和表達差異分析。顯著差異表達的circRNA進行熱圖(Heatmap)和聚類分析(差異倍數≥1.5, 統(tǒng)計學顯著性P<0.05), 用于后續(xù)功能的挖掘。

1.2.3 競爭性內源RNA(ceRNA)網絡構建: circRNA可作為ceRNA來保護mRNA免受微小RNA(miRNA)的降解，進而調控mRNA的表達豐度。利用TargetScan和miRanda軟件預測circRNAs可能結合的miRNA, 以及所有對應物種的miRNA與差異表達 circRNA 的關系，判斷兩者關系的主要依據包括序列匹配、circRNA-miRNA雙鏈結合熱穩(wěn)定性等。根據 miRanda比對得分>140, 自由能<-15構建circRNA-miRNA網絡關系調控圖。

1.2.4 功能富集分析: 使用R軟件clusterProfiler對差異表達的circRNA分別進行基因本體論(GO)功能分析、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集以及Reactome通路富集分析，以查看可能參與的生物學過程和通路。

1.3 統(tǒng)計學分析

為了獲得表達更準確的差異表達circRNA轉錄本，對circRNA進行了M-值的加權截尾均值(TMM)標準化并過濾表達過低的circRNA(基因表達譜CPM值>0.1), 隨后根據分組信息采用edgeR對circRNA進行了差異表達分析(差異倍數≥1.5,P<0.05, FDR<1)。差異表達基因集合是否顯著富集到GO/KEGG/Reactome term, 不僅僅要看P值，還需要關注overlap Gene Count, 如果其太小(<3), 即使P值很顯著，也沒有太大的生物學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料

結合發(fā)病年齡和運動里程碑, SMA組5例均為SMA2型，其中男2例，中位年齡3歲，女3例，中位年齡10歲。見表1。對照組性別及年齡均按1∶1匹配入組。

表1 SMA組5例SMA患兒臨床資料

2.2 SMA患者血漿中差異circRNA表達譜

層次聚類分析顯示了SMA組與對照組circRNA的差異表達譜。相對表達較高的circRNA用紅色表示，表達較低的用藍色表示，見圖1, 熱圖展示將SMA患者與健康對照組區(qū)分開來。以差異倍數絕對值≥1.5、統(tǒng)計學顯著性P<0.05為標準，相較于對照組, SMA組中共鑒定出136個顯著差異表達的circRNA, 其中55個circRNA表達上調, 81個circRNA表達下調，見圖2。根據變化差異倍數和P值，分別選取上升和下降排名前10位的circRNAs, 見表2。

圖1 SMA組與對照組差異表達的circRNA熱圖(S為SMA組, N為對照組)

圖2 SMA組與對照組差異表達的circRNA火山圖

表2 SMA組與正常對照組差異表達的circRNA

2.3 circRNA-miRNA調控網絡

使用TargetScan和miRanda數據庫預測差異表達circRNA的靶向miRNA, circRNA序列上的miRNA結合位點數目越多, miRNA越有可能結合到circRNA上。根據差異倍數排序，各選取前5位的上調、下調circRNA進行預測，篩選出匹配值較高的5個miRNA進行注釋，見表3。通過對預測結果過濾，保留總分最大的前1 000個miRNA, 應用Cytoscape軟件繪制circRNA-miRNA調控網絡圖，見圖3。

表3 差異表達的circRNA與miRNA結合位點的預測結果

紅色節(jié)點代表上調circRNA, 綠色節(jié)點代表下調circRNA, 藍色節(jié)點代表miRNA。圖3 circRNA-miRNA調控網絡圖

2.4 差異circRNA的生物信息學分析

根據差異表達的circRNA進行GO功能注釋，結果顯示主要富集于去磷酸化作用、DNA復制、有絲分裂等生物過程。細胞成分的定位主要在高爾基外側網絡、紡錘體和細胞質膜側等，其主要分子功能為ATP酶活性、磷酸酶、磷酸酯水解酶活性和組蛋白結合等，見圖4。KEGG分析發(fā)現，差異的circRNA可能涉及的通路包括MAPK信號通路、HIV病毒感染、VEGF信號通路、同源重組修復、DNA復制等，見圖5。Reactome分析結果顯示，差異的circRNA主要富集在高爾基體和內質網的運輸、DNA雙鏈斷裂修復、同源重組和非同源末端連接等信號通路，見圖6。

圖4 差異表達的circRNA的GO富集分析

圖5 KEGG通路分析條形圖

圖6 Reactome通路分析條形圖

3 討 論

SMA是最常見的神經退行性疾病之一，與兒童的死亡率有關。目前診斷SMA的金標準是基因檢測，但仍需結合典型的臨床癥狀和家族史[13]。近年來，基因療法成為第2種被批準治療SMA的方法，其能夠恢復SMN2外顯子7的小分子化合物，進一步擴展了用于SMA治療的RNA靶向分子類別，除SMN2pre-mRNA外，內源性RNA靶標如miRNA和circRNA, 也可能被用于開發(fā)額外的SMA療法[14]。

研究[15]顯示, circRNA具有獨特的閉環(huán)結構，使其可以高度穩(wěn)定地存在于血清、血漿等細胞外壞境中，這也提高了circRNA作為miRNA海綿通過ceRNA網絡調節(jié)親本基因表達的有效性[16]。目前已有多項研究[17-18]表明，血漿circRNA分子能夠作為診斷疾病和腫瘤的分子標志物，不僅與治療敏感性密切相關，還可作為預后相關的重要分子標志物，具有很強的臨床診斷意義[19-20]。然而，目前circRNA在兒童SMA患者中的研究仍較少。本研究首次使用來自兒童SMA2型患者和健康對照組血漿中circRNA的表達譜進行多層綜合分析，發(fā)現共有136個顯著差異表達的circRNA, 其中55個在SMA組表達上調, 81個表達下調，這些circRNA可以在血漿樣本中作為SMA的候選生物標志物，同時高通量數據為SMA可能的致病作用也提供了線索。

研究[21]表明miRNA在運動神經元的發(fā)生發(fā)展、SMA發(fā)病機制方面發(fā)揮著至關重要的作用，識別潛在的SMA相關miRNA及其相應的伴侶RNA結合蛋白，不僅可以提供監(jiān)測疾病進展的生物標記物，還可以代表潛在的治療靶點。ABIUSI E等[22]發(fā)現miR-181a-5p、miR-324-5p和miR-451a在SMA患者血清中顯著上調，并提高了SMA的表型預測價值。本研究對SMA患者血漿中差異表達的circRNA進行了miRNA位點的預測，篩選出匹配值較高的5個circRNA, 并在此基礎上構建了circRNA-miRNA調控網絡。初步分析發(fā)現除了上述3種miRNA均在預測范圍內，這些差異表達的circRNA還具有與神經元發(fā)育相關miRNAs(miR-9、miR-124 和 miR-133)、富含運動神經元miRNAs(miR-183和miR-218)、肌肉特異性miR-206以及星形細胞產生的miR-146等在SMA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要調控作用的miRNA的結合位點[23-26]。因此，這些circRNA可能通過靶向吸附miRNA調控SMA的發(fā)生和發(fā)展。此外，本研究繪制的ceRNA調節(jié)網絡也為SMA中circRNA-miRNA級聯放大協同效應的調控途徑提供了線索。

GO功能富集分析顯示，多數差異表達的circRNA參與了ATP酶活性以及磷酸酶活性。研究[27]表明, SMN蛋白的缺失影響了線粒體穩(wěn)態(tài)的維持以及能量代謝的調控，其中包括ATP酶活性。PTEN是一種磷酸酶和張力蛋白同源物，其缺失可激活抗凋亡因子，該通路在許多神經退行性疾病中起著重要的保護作用[28]。因此,PTEN基因的敲除、缺失或突變通過調節(jié)其磷酸酶活性可能是促進SMA運動神經元存活的重要治療策略。此外, KEGG及Reactome通路富集分析均顯示，候選circRNA的靶基因在同源重組修復(HR)、非同源末端連接(NHEJ)以及DNA復制途徑中富集。KANNAN A等[29]研究指出長期低水平的SMN蛋白會導致感覺神經毒素(SETX)缺乏，誘導DNA雙鏈斷裂(DSB)增加，以及DNA活化蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)的缺乏，從而損害DSB修復。因此, DNA損傷在SMA患者脊髓組織中積累，在細胞分裂過程中, DSB通過HR和NHEJ途徑修復[30]。另外, TAY S H等[31]利用同源重組修復機制產生了一個具有中等水平SMN蛋白的斑馬魚突變體，用于研究晚期SMN蛋白的缺失對運動神經元和肌肉的影響。據此推測，這些circRNA可能通過同源重組修復參與調控SMA的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究通過對兒童SMA2型患者血漿中提取的circRNA的差異表達進行詳細的生物信息學分析，并基于該假設構建了circRNA-miRNA網絡，這些結果可能有助于闡明SMA的發(fā)病機制，以指導治療策略的制訂。鑒于SMA發(fā)病率低，臨床罕見，本研究納入病例量較少，后續(xù)仍需進一步擴充臨床樣本，考慮在其他亞型SMA患者、肌肉活檢組織或細胞水平進行驗證，以期為SMA的早期檢測、精確診斷以及靶向治療提供新的策略方向和更多的數據基礎。