張秋怡，石瑞麗，齊瑞芳，呂 軍，時靜華，王立軍，馬寶慧

(1.包頭醫(yī)學(xué)院2020級研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院)

氟存在于自然界的每個角落，是人體不可或缺的微量元素之一，攝取適量的氟化物有助于齲齒的預(yù)防及骨骼的發(fā)育，但過多的攝入會對機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷[1-2]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，過量攝取氟化物會對非骨性組織如心、腦、腎、肝和睪丸等造成不可逆性的損傷[3-4]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，長期氟暴露與心臟病的發(fā)病率有關(guān)，主要包括動脈粥樣硬化、心肌梗死和高血壓等[5]。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)是調(diào)控細(xì)胞焦亡及炎癥方面至關(guān)重要的蛋白。當(dāng)外來刺激物致炎癥發(fā)生時，炎癥小體NLRP3被激活，隨之激活其下游的caspase-1，被激活的caspase-1繼續(xù)激活消皮素家族成員，使其N端發(fā)生剪切致細(xì)胞膜完整性遭到破壞，與此同時，caspase-1還會激活細(xì)胞內(nèi)的炎性因子，最后致細(xì)胞內(nèi)的炎性因子被釋放，發(fā)生細(xì)胞程序性死亡。Li等[6]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaF(25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)可以誘導(dǎo)C57BL/6J雄性小鼠小腸發(fā)生炎癥反應(yīng)致細(xì)胞焦亡。然而長期氟暴露是否通過依賴caspase-1所引發(fā)的炎癥反應(yīng)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，截至目前尚未有相關(guān)報(bào)道。我們課題組先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著氟化鈉濃度的增加，H9c2心肌細(xì)胞caspase-1蛋白和mRNA表達(dá)量隨之上升，且呈劑量依賴性[7]。因此，本研究將Wistar大鼠作為研究對象，建立體內(nèi)長期氟暴露模型，研究不同濃度NaF對大鼠心肌caspase-1和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 40只體質(zhì)量為90～110 g，清潔級雄性健康Wistar大鼠，購自北京芳元緣養(yǎng)殖場[SCXK(京)2014-0012]。將實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動物中心，室溫保持(25±1) ℃，相對濕度(55±5) %,光照周期(明∶暗=12 h∶12 h)，動物自由飲去離子水，自由進(jìn)食常規(guī)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2方法

1.2.1動物分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，40只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組，低劑量染氟組(50 mg/L)，中劑量染氟組(100 mg/L)和高劑量染氟組(200 mg/L)，10只/組。所有大鼠均喂食常規(guī)飼料，空白對照組飲用去離子水，其他三組分別飲用不同濃度的含氟去離子水。所有大鼠自由進(jìn)食及飲水，連續(xù)喂養(yǎng)7個月。

1.2.2慢性氟中毒模型制備 按照如上分組的方法7個月后，觀察不同染氟組大鼠氟斑牙情況。觀察指標(biāo)主要包括牙齒光澤度、斑塊條紋的形成、缺損情況等。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1心肌取材 飼養(yǎng)7個月后，用10 %水合氯醛麻醉大鼠，采用滴灌法為大鼠灌注0.9 %生理鹽水及4 %多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟固定，滴灌結(jié)束后迅速在冰凍臺上取出心臟；將取出的心臟繼續(xù)固定在4 %多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)制作石蠟切片。

1.2.3.2免疫組織化學(xué)染色 將所得石蠟切片通過二甲苯溶液進(jìn)行脫蠟，不同梯度的無水乙醇進(jìn)行復(fù)水處理，處理完成后加入3 %過氧化氫(H2O2)溶液進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)15 min，抗原修復(fù)10 min，自然冷卻后，PBS清洗3次，10 min/次，5 % BSA溶液孵育，去除多余孵育液，加一抗，4 ℃過夜。次日，加二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，10 min/次，DAB顯色，蒸餾水清洗蘇木精復(fù)染，自來水藍(lán)化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，采用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析。

2 結(jié)果

2.1慢性氟中毒模型制備情況 NaF染毒7個月，空白對照組大鼠牙齒有光澤，呈淡黃色且顏色均一，染毒組大鼠由于染氟濃度具有差異，從而展現(xiàn)不同程度的氟斑牙，輕者牙釉質(zhì)表面失去光澤，形成白堊狀斑塊略粗糙，重者牙釉質(zhì)表面完全失去光澤，全牙呈現(xiàn)黃褐色斑塊，顏色不一，粗糙且部分牙齒有缺損。隨著氟濃度的升高，氟斑牙程度逐漸加重，呈劑量依賴性，表明慢性氟中毒模型造模成功。

2.2免疫組織化學(xué)染色檢測氟暴露大鼠心肌TNF-α表達(dá)情況 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，氟暴露組心肌細(xì)胞TNF-α表達(dá)明顯加強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.316，P<0.001)。見圖1。

圖1 長期氟暴露對大鼠心肌TNF-α表達(dá)的影響注：左圖免疫組織化學(xué)染色圖像，A為空白對照組，B為50 mg/L組，C為100 mg/L組，D為200 mg/L組；右圖陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與對照組比較，*為P<0.05

2.3免疫組織化學(xué)染色檢測氟暴露大鼠心肌caspase-1表達(dá)情況 結(jié)果顯示，空白對照組大鼠心肌caspase-1表達(dá)較少，心肌細(xì)胞著色程度較淺；與對照組相比，氟暴露組心肌細(xì)胞著色相對較深，且隨著氟濃度的增加顏色逐漸加深，陽性表達(dá)加強(qiáng)(F=13.303，P<0.001)。見圖2。

圖2 長期氟暴露對大鼠心肌caspase-1表達(dá)的影響注：左圖免疫組織化學(xué)染色圖像，A為空白對照組，B為50 mg/L組，C為100 mg/L組，D為200 mg/L組；右圖陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與對照組比較，*為P<0.05

3 討論

氟主要以氟化物的形式存在于自然界中。眾所周知，低劑量的氟有助于牙齒和骨的生長，但攝入過量則會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)若干健康問題。吳云飛等[8]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長期氟暴露可導(dǎo)致QT間期縮短，誘導(dǎo)心肌發(fā)生細(xì)胞凋亡。Yan等[9]實(shí)驗(yàn)表明，30 mg/L和90 mg/L NaF處理大鼠6個月后，對照組心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，Z、M線清晰有條理，染色均勻；30 mg/L組心肌細(xì)胞肌絲排列較疏松，整體差異不顯著；90 mg/L組心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂，Z、M線斷裂，核形態(tài)受損，細(xì)胞破裂。我們前期的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了氟對心肌結(jié)構(gòu)的損傷，與上述研究結(jié)果一致。但是，長期氟暴露對心肌損傷的機(jī)制尚不明確。

活性氧在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中具有重要作用。在毒性、高溫和紫外線下等情況下，活性氧的生成顯著增加，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，從而引發(fā)氧化損傷。本課題組前期研究顯示，氟染毒可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞活性氧過量產(chǎn)生，且過量氟可導(dǎo)致大鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]?；钚匝跎膳c激活炎癥通路有關(guān)[11]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中一種重要的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞損傷及重塑過程。心肌損傷可釋放TNF-α，TNF-α也可刺激活性氧釋放。TNF-α相關(guān)研究證實(shí)，冠心病患者通過介入治療后血清中caspase-1、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、TNF-α表達(dá)水平顯著下降[12]。VarlB等[5]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaF致Wistar大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)、TNF-α及IL-1β表達(dá)水平顯著增加。Panneerselvam等[13]發(fā)現(xiàn)，氟處理使大鼠心肌磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子p65(Ser536)[Phosphorylated-nuclear factor-κB p65(Ser536),pNF-κB p65(Ser536)]、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白α/β(Ser176/180) [Phosphorylated-nuclear factor-κB-inducing kinase α/β(Ser176/180),pIκKα/β(Ser176/180)]及其下游TNF-α表達(dá)水平顯著升高。這與我們的研究結(jié)果一致，表明長期攝入NaF會誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激可直接損傷心肌細(xì)胞，使心臟功能受損。

Caspase-1參與炎癥反應(yīng)和程序性細(xì)胞死亡過程，常以未激活的酶原狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，炎性體刺激后，未激活的酶原變成激活狀態(tài)，促進(jìn)炎癥因子IL-1β的轉(zhuǎn)化和釋放。心肌組織缺氧可引起caspase-1異常表達(dá)而使心肌細(xì)胞凋亡[14]。Caspase-1表達(dá)上調(diào)也可引起細(xì)胞焦亡。大量研究報(bào)道，細(xì)胞焦亡參與了眾多心血管疾病的發(fā)生，包括心肌缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、心肌肥厚等[15-17]。Shi等[15]的研究中，C57BL/6J小鼠心肌缺血再灌注損傷可見NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)和caspase-1表達(dá)顯著上調(diào)，且炎癥因子白介素18(Interleukin-18,IL-18)、IL-1β、TNF-α的表達(dá)也顯著上升，這表明小鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞發(fā)生了焦亡。呂展等[18]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3’,4’-二羥基黃酮醇通過抑制caspase-1和IL-1β的激活,從而改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚和纖維化。相關(guān)研究表明，細(xì)胞焦亡所釋放的炎癥因子IL-18是NLRP3激活的下游產(chǎn)物之一，它有助于TNF-α的產(chǎn)生，同時TNF-α可以觸發(fā)NF-κB通路，進(jìn)而導(dǎo)致NLRP3和IL-18的轉(zhuǎn)錄，這種交叉作用再次加重了心肌組織的炎癥損傷[19]。本研究結(jié)果表明，中長期氟暴露后大鼠心肌caspase-1和TNF-α表達(dá)顯著增加，推測這可能是由于氟誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞焦亡。

綜上所述，長期氟暴露不僅可以改變大鼠心肌細(xì)胞中caspase-1和TNF-α的表達(dá)水平，且與染氟濃度有關(guān)，推測可能與依賴caspase-1的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑有關(guān)，但還需進(jìn)行更深入的研究，以進(jìn)一步明確長期氟暴露與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系，以期為地氟病的防治工作貢獻(xiàn)微薄力量。