郭宇帆，高 冰,2，姜紅梅，商佳琪，高 龍,2，趙宇航，田春風，李 凱，包 艷,2

(1.包頭醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭醫(yī)學院營養(yǎng)與食品健康研究所)

肥胖是許多國家都正在面臨的一個日益嚴重性難題，身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)增加導致多種疾病患病風險增加，如2型糖尿病和心腦血管疾病[1]。腸道微生物群可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、維持上皮屏障預防多種疾病，并且在維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡和人類健康方面發(fā)揮著重要功能[2]。腸道菌群具有多種人體不具備的酶系，能夠?qū)⑹澄镏胁荒芡耆幌?、分解的寡聚糖、蛋白質(zhì)和大型多糖等一系列物質(zhì)酵解成短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等小分子物質(zhì)，主要包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸和戊酸等。SCFAs作為腸道微生物群和宿主之間的中介，在調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性、炎癥控制、膽汁酸代謝、免疫功能和疾病控制等方面有重要作用[3-4]。

課題組前期對不同BMI蒙古族兒童糞便中SCFA含量的變化進行分析發(fā)現(xiàn)，肥胖組兒童SCFAs含量升高，SCFAs含量的差異歸因于他們的體重指數(shù)BMI的差異。一些動物學研究也發(fā)現(xiàn)，正常和肥胖SD大鼠盲腸內(nèi)容物SCFAs含量及對應比值與其糞便結果均存在差異[4]。因此，在維持機體能量代謝平衡中SCFAs可能作為一個重要因素改變宿主的能量吸收和代謝過程[5-6]。脂肪酸的氧化被SCFAs激活后，能夠抑制脂解，最終可使血漿中的游離脂肪酸濃度降低，從而使體重減輕[7-8]。AMPK可以通過磷酸化作用或其他方式調(diào)節(jié)一系列的脂代謝關鍵酶的活性以維持肝臟能量的穩(wěn)定，AMPK可以抑制機體內(nèi)TC的合成從而抑制糖異生，也可抑制脂肪組織內(nèi)脂肪酸的合成。因此本實驗探究SCFAs是否通過影響AMPK信號通路來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

HepG2細胞來源于一個15歲白人的肝癌組織，油酸鈉(sodium oleate，OA)誘導HepG2細胞建立脂質(zhì)堆積模型廣泛應用于脂肪肝及脂質(zhì)代謝等體外細胞實驗研究[9]。本研究通過建立HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型，使用不同濃度的SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型進行干預，觀察HepG2細胞形態(tài)以及細胞活力，檢測TC、TG含量以及細胞AMPK磷酸化水平，探討SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型脂質(zhì)代謝的影響，為肥胖及其相關代謝疾病防治提供新思路和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 實驗所用細胞為人肝癌HepG2細胞系，購于ATCC細胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、DMEM培養(yǎng)基(以色列Biological Industries公司)；甲醇、異丙醇，無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國SIGMA公司)；油酸鈉(西安鯤創(chuàng)科技有限公司)；噻唑藍(MTT)(美國Amresco公司)；TC、TG試劑盒(南京建成生物工程研究所)；油紅O(成都艾科達化學試劑有限公司)；蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)(北京普利萊基因技術有限公司)；AMPK抗體，P-AMPK抗體(英國Abcam公司)；細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)；脫脂奶粉、AMPK抑制劑Compound C(美國MCE公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒，Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Tween20(博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型的建立 HepG2細胞凍存于-80 ℃保存，復蘇后將細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，在含有雙抗體和10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃、CO2濃度為5 %的培養(yǎng)箱內(nèi)。待培養(yǎng)皿底部HepG2細胞匯合率達到70 %時，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，取出培養(yǎng)皿棄去原有培養(yǎng)液，加入濃度為0.5 mmol/L油酸鈉的高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。使用油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)橙紅色或橘紅色脂滴說明高脂細胞模型已經(jīng)建立。

1.2.2MTT法檢測HepG2細胞存活率 96孔板內(nèi)接種對數(shù)生長期并且生長狀態(tài)良好的HepG2細胞懸液，每孔培養(yǎng)液為100 μL，細胞密度為104個/mL，設置6個重復孔。加入不同濃度梯度的SCFAs，選用0、6、12、24、36 mmol/L的SCFAs(乙酸、丙酸、正丁酸)干預HepG2細胞，在0 h、12 h、24 h和48 h采用MTT法檢測細胞的活力值，酶標儀450 nm處測吸光度并進行存活率計算。

1.2.3HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型TC、TG含量檢測 通過HepG2細胞活力值結果顯示，選擇6、12、24 mmol/L的SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型進行干預處理。干預12 h后棄掉上清，取HepG2細胞TC、TG試劑盒檢測TG、TC含量。

1.2.4HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型蛋白含量檢測 通過上述實驗，選擇12 mmol/L的SCFAs為干預濃度進行蛋白測定時，用Western blot檢測AMPK、p-AMPK、ACC和p-ACC蛋白的表達。

2 結果

2.1HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型的建立 使用油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型使用油紅O染色后，倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)橘紅色脂滴，說明成功建立HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型。見圖1。

圖1 正常HepG2細胞與HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型對比圖(×100)

2.2SCFAs對HepG2細胞存活率的影響 隨著SCFAs干預時間的延長，HepG2細胞的活性顯著降低(P<0.05)；干預時間為12 h時細胞狀態(tài)較好，24 h和48 h時細胞死亡較多；SCFAs濃度為48 mmol/L時細胞大量死亡。見圖2。

圖2 SCFAs在不同時間對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型細胞活性的影響注：a，與0 h相比，P<0.05；b，與12 h相比，P<0.05；c，與24 h相比，P<0.05

選擇時間為12 h檢測細胞活力值，加入不同濃度SCFAs對HepG2細胞活性有抑制作用(P<0.05)，HepG2細胞的生長對SCFAs存在劑量依賴性，即隨著SCFAs濃度的升高，HepG2細胞活性逐漸降低。見表1。

表1 SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型吸光度的影響

2.3SCFAs干預HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型后細胞形態(tài)學變化 加入不同濃度SCFAs后細胞形態(tài)發(fā)生不同程度的改變。對照組HepG2細胞呈梭形，單層貼壁生長，狀態(tài)良好，排列均勻且緊密，折光率高，增殖旺盛，胞體大；加入OA后鏡下觀察細胞出現(xiàn)亮點，說明脂滴已經(jīng)形成，細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度明顯增加；6 mmol/L組細胞排列開始松散；12 mmol/L時細胞折光率減弱，細胞間距變大，貼壁能力下降，但細胞形態(tài)完整；24 mmol/L時細胞開始變小變圓，部分細胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中；36 mmol/L時可見大部分細胞明顯變圓，細胞體積縮小，細胞數(shù)量明顯減少。見圖3、圖4。

圖3 油酸鈉干預前后HepG2細胞形態(tài)學的變化(100×)

圖4 不同濃度的SCFAs干預后HepG2細胞形態(tài)學的變化(100×)

2.4HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型TC、TG含量檢測結果 HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型組TC含量與正常對照組相比升高(P<0.05)；在干預12 h后，不同濃度的SCFAs作用HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型，TC含量降低(P<0.05)，隨著SCFAs濃度升高TC含量降低。見圖5。

圖5 SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型TC含量的影響注：*與正常對照組相比，P<0.05；#與HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型組相比，P<0.05

HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型組TG含量與正常對照組相比升高(P<0.05)；使用不同濃度的SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型干預12 h后，TG含量降低(P<0.05)，隨著SCFAs濃度升高TG含量降低。見圖6。

圖6 SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型TG含量的影響注：*與正常對照組相比，P<0.05；#與HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型組相比，P<0.05

2.5HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型蛋白表達結果 使用SCFAs對HepG2細胞處理均可抑制p-AMPK的表達水平，其中使用丁酸處理能夠最有效地抑制p-AMPK的表達，其次為丙酸，效果最低的為乙酸，但細胞AMPK總體表達水平變化不大，說明SCFAs可抑制AMPK信號通路的激活。見圖7、圖8。

圖7 不同種類SCFAs激活AMPK、ACC的量效關系注：a為正常對照組；b為脂質(zhì)堆積模型組；c為乙酸12 mmol/L組；d為丙酸12 mmol/L組；e為丁酸12 mmol/L組；f為Compound C組

圖8 不同種類的SCFAs對激活細胞內(nèi)AMPK、ACC的影響注：*與正常對照組相比，P<0.05

3 討論

《中國居民膳食指南(2022)》顯示，目前我國成年居民超重或肥胖已經(jīng)超過一半。全球肥胖在過去20年內(nèi)急劇增長，全球共有10億人屬于肥胖患者，中國肥胖人數(shù)高居世界第一，超重肥胖已成為一個日益嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[10]。

機體內(nèi)腸道菌群產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物是腸道菌群和宿主之間的信使，其中包括SCFAs在內(nèi)的大部分會對宿主健康產(chǎn)生有益影響[11]。SCFAs是腸道有益細菌代謝膳食纖維等碳水化合物所產(chǎn)生的代謝物，它既是體內(nèi)重要能量來源，也作為新型信號分子調(diào)節(jié)人體能量代謝[12]。諸多研究已經(jīng)表明SCFAs在消化、營養(yǎng)代謝、能量供應、維持腸道穩(wěn)態(tài)等各種生物過程和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，此外，SCFAs還可以通過激活肝臟和肌肉中的AMPK活性來增加能量消耗[13]。通過干預生活方式和飲食習慣調(diào)整腸道菌群，例如減少高脂肪飲食、增加體育運動以及補充膳食纖維等方式，可以有效促進腸道菌群的改善，調(diào)控腸道發(fā)酵相關基因的微生物表達，繼而減少肥胖相關疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。

基于上述背景，SCFAs調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用及其機制的研究對肥胖的發(fā)生發(fā)展有重要意義。本研究選擇0、6、12、24、36 mmol/L的5個濃度梯度的SCFAs對細胞進行干預處理，隨著SCFAs濃度的增加，對HepG2細胞活性的抑制作用逐漸增強，出現(xiàn)明顯的劑量依賴性，高濃度的SCFAs對HepG2細胞具有直接損傷作用。說明SCFAs可對HepG2細胞的增殖分化產(chǎn)生一定的抑制作用，方劍等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)SCFAs可促進HepG2細胞凋亡。

TC可作為脂質(zhì)代謝的指標，TG在維持體內(nèi)能量代謝中發(fā)揮重要作用[16-17]。SCFAs可使高脂飲食誘導的肥胖小鼠體重減輕，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的紊亂；也可以在體內(nèi)改變宿主的能量吸收和代謝過程，調(diào)節(jié)機體內(nèi)能量的平衡[18]。油酸鈉可以使細胞內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)代謝紊亂，并促進脂質(zhì)的合成，導致細胞內(nèi)TC、TG含量增加。油酸鈉誘導HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型建立后細胞TC、TG代謝異常，SCFAs干預后，TC、TG含量與HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型組相比顯著降低，說明SCFAs能夠促進脂肪自身分解，抑制TC、TG的合成，從而降低HepG2細胞模型中脂質(zhì)的含量。

為了進一步研究SCFAs調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的機制，我們檢測了AMPK通路相關蛋白的表達。機體內(nèi)能量的改變是活化AMPK的經(jīng)典途徑，部分研究認為，被活化的AMPK可使其下游的脂肪酸合成關鍵酶ACC失活，致使機體合成代謝關閉，分解代謝開啟，繼而抑制脂肪酸的累積和脂質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝并促進脂肪酸氧化，抑制TC、TG和脂肪的合成[19-20]。SCFAs與位于脂肪細胞上的G-蛋白偶聯(lián)受體43(G-protein coupled receptor43，GPR43)結合后能夠促使細胞分泌瘦素，瘦素作用于機體使攝食量減少，且可以增加能量的釋放，抑制脂肪細胞的增殖合成，影響脂質(zhì)代謝[21-22]。本研究結果表明，SCFAs能夠不同程度地抑制油酸鈉誘導的脂質(zhì)堆積模型組細胞內(nèi)AMPK、ACC的磷酸化表達，且具有量效關系。同時，細胞內(nèi)TC、TG含量的檢測結果也進一步表明抑制AMPK信號通路可以降低細胞脂質(zhì)的積累[23]。Anthony等[24]的研究表明，AMPK的活化可以抑制嚙齒動物脂肪細胞中脂肪溶解，促進脂肪的積累，這可能與激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)在脂滴表面定位有關，HSL可影響脂肪水解以及脂類的積累，AMPK可影響HSL活化。AMPK通路的活化對脂肪積累促進或抑制作用是有爭議的[25]，因此，SCFAs對于脂肪代謝及AMPK活性的影響，仍需要深入探討。

人體中SCFAs以酸的形式存在，本實驗采用乙酸、丙酸和正丁酸進行實驗，但是SCFAs在體內(nèi)具有復雜的生物學活性，易揮發(fā)，在體外的細胞實驗中不能完全模擬其在體內(nèi)分布狀態(tài)；此外體內(nèi)部分SCFAs以結合形式存在，直接穿過上皮屏障發(fā)揮作用[26]。因此本實驗還存在一定局限性，在今后的研究中還需進一步探究其鹽類對細胞的作用機制以及動物實驗明確SCFAs對機體作用效果。

綜上所述，SCFAs可以調(diào)節(jié)HepG2細胞脂質(zhì)代謝，可以有效降低HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型中TC、TG含量，SCFAs對HepG2細胞脂質(zhì)堆積模型AMPK通路蛋白表達產(chǎn)生一定的影響作用，對預防肥胖及相關疾病的發(fā)生和發(fā)展有重要意義。