王亞軒, 于 坤, 沈舒婷, 王 慧

(皖南醫(yī)學院 藥學院,安徽 蕪湖 241002)

熒光金屬配合物因兼具有機化合物熒光量子產(chǎn)率高和無機化合物光熱穩(wěn)定性好的優(yōu)勢,被認為是最具有發(fā)展和應用前景的一類發(fā)光材料[1-2]。常見的熒光金屬配合物主要包括具有d10電子構(gòu)型的Zn(II)[3]、 Cu(II)[4], d6電子構(gòu)型的Ru(II)[5]、 Ir(III)[6]、 Os(II)[7]和d8電子構(gòu)型的Pt(II)[8]等。與其它金屬配合物相比,銥配合物優(yōu)勢突出,如可調(diào)控的吸收和發(fā)射波段、較高熒光量子產(chǎn)率、較好耐光性以及較長磷光壽命等,在有機電致發(fā)光、離子/分子檢測、有機發(fā)光二極管、生物成像以及疾病早期診斷等領域受到廣泛關注[9-11]。因此開發(fā)新型金屬銥配合物并研究其在生物化學領域的應用具有重要意義。

基于此,本文以常見的C^N配體2-苯基吡啶(ppy)為母體,選擇鄰菲羅啉衍生物作為輔助配體,引入不同的末端基團,設計并合成了兩種銥配合物IrL1和IrL2(圖1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、質(zhì)譜和傅里葉紅外光譜表征。研究了兩種配合物在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜,并采用MTT實驗和共聚焦顯微成像技術研究了配合物IrL1和IrL2在HepG2細胞中的應用效果。

圖1 配合物IrL1和IrL2的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance (400/600 Hz)型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標);AB SCIEX MALDI-TOF型基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀;Nicolet FTIR is5型傅里葉變換紅外光譜儀(溴化鉀壓片);UV-5900 PC型紫外可見分光光度計;HITACHI F-4600型熒光分光光度計;Infinite 200 Pro型多功能酶標儀;Leica TCS SP8型共聚焦顯微鏡。

IrCl3·3H2O, 4-(2-吡啶基)-苯甲醛(>95%),鄰菲啰啉(99%),對羥基苯甲醛(98%),香草醛(99%),溴丁烷(99%),上海阿拉丁試劑公司;其余試劑為分析純,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 合成

(1) 配體L1的合成

在250 mL三口燒瓶中依次加入鄰菲羅啉雙酮[12](0.74 g, 3.50 mmol),中間體M1[13](0.62 g, 3.50 mmol),乙酸銨(5.75 g, 75.00 mmol)和75 mL冰乙酸,氮氣保護下,于120 ℃反應4 h。冷卻至室溫,倒入大量冰水中,用NaOH溶液調(diào)pH至7,析出固體,減壓抽濾,所得濾餅用甲醇重結(jié)晶得淡褐色固體L10.35 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.98(d,J=4.0 Hz, 2H), 8.87(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.18(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.79～7.77(m, 2H), 7.11(d,J=8.4 Hz, 2H), 4.02(t,J=6.4 Hz, 2H), 1.74～1.66(m, 2H), 1.49～1.38(m, 2H), 0.91(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 160.31, 151.24, 148.02, 143.86, 129.94, 128.22, 123.63, 122.93, 115.28, 67.80, 31.17, 19.17, 14.14。

(2) 配合物IrL1的合成

(3) 配體L2的合成

合成方法與配體L1類似,最終得褐色固體0.29 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96～8.92(m, 4H), 7.90(s, 1H), 7.85(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.77～7.75(m, 2H), 7.11(d,J=8.3 Hz, 1H), 4.01(t,J=6.5 Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 1.74～1.67(m, 2H), 1.47～1.40(m, 2H), 0.93(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 152.28, 149.71, 149.49, 147.70, 143.65, 140.93, 140.89, 130.13, 123.99, 123.53, 119.67, 113.31, 110.44, 68.36, 56.13, 31.27, 19.21, 14.16。

(4) 配合物IrL2的合成

1.3 配合物的光學性質(zhì)測試方法

將配合物IrL1和IrL2分別配成濃度為1.0 mmol·L-1的母液(溶劑為二甲基亞砜)。移取50 μL母液,分別加入5 mL容量瓶中,定容至配合物終濃度為10 μM。溶劑分別為1,4-二氧六環(huán)(DOA)、乙酸乙酯(EA)、四氫呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、乙腈(CH3CN)、二甲基亞砜(DMSO)和PBS緩沖溶液(pH=7.40)。熒光光譜的實驗參數(shù)設置為激發(fā)波長410 nm,狹縫寬度10 nm,電壓500 V。

1.4 細胞毒性和細胞成像測試方法

細胞毒性實驗、細胞傳代和培養(yǎng)方法參照文獻[15]。當細胞密度達到實驗要求時,設置如下兩組實驗:(1) 10 μM配合物IrL1和IrL2分別與HepG2活細胞共培養(yǎng)30 min; (2)用4%多聚甲醛固定細胞15 min,移去多聚甲醛,PBS洗滌兩次,分別加入10 μM配合物IrL1和IrL2的DMEM溶液,與固定細胞共培養(yǎng)30 min。所有細胞用PBS洗滌兩次后,直接用于共聚焦成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征分析

以鄰菲羅啉、對羥基苯甲醛、香草醛和溴丁烷為原料,通過親核取代反應和縮合反應等,在氮氣保護下簡潔高效地合成了兩種有機配體L1和L2,然后與銥二氯橋化合物中間體M3在氮氣保護和避光條件下進行配位反應,經(jīng)過柱層析分離提純,得到了兩種陽離子型銥配合物IrL1和IrL2。

2.2 光物理性質(zhì)分析

測試了配合物IrL1和IrL2在7種不同極性的常見溶劑中的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜,比較并分析兩種配合物的光學性質(zhì)。圖2為兩種配合物在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜,從圖2中可看出,配合物IrL1和IrL2在300 nm均有1個較強的吸收峰,摩爾吸收系數(shù)均大于1.0×104,可能源于配體內(nèi)自旋允許的π-π*躍遷過程。在370～450 nm內(nèi)出現(xiàn)1個中等強度的吸收峰,可能是由于自旋允許的金屬到配體之間的電荷轉(zhuǎn)移躍遷(MLCT)[16]。配合物IrL1和IrL2的紫外可見吸收光譜未隨著溶劑極性的增加發(fā)生明顯變化(除了PBS以外)。

圖3為配合物IrL1和IrL2在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜。配合物IrL1和IrL2在乙醇中的熒光強度高于在其它溶劑中,在乙醇中配合物的激發(fā)態(tài)相比于在其它溶劑中更加穩(wěn)定。這兩種配合物在DOA、 CH3CN和DMSO溶劑中表現(xiàn)出明顯的精細結(jié)構(gòu),表明其發(fā)射激發(fā)態(tài)除了具有MLCT特征外,還具有明顯的3LC特征[17]。與配合物IrL2相比,配合物IrL1的熒光強度更高,但最大發(fā)射峰位置未發(fā)生明顯改變,說明在配合物IrL2中引入甲氧基對整個配合物共軛程度的增加沒有明顯貢獻。

λ/nm

2.3 細胞毒性分析

選取HepG2細胞為研究對象,采用MTT法評價配合物IrL1和IrL2與細胞共培養(yǎng)24 h后的細胞存活率。由圖4可知,即使配合物濃度到30 μM時,細胞的存活率仍在80%以上,說明配合物IrL1和IrL2具有較低的細胞毒性,可將其用于后續(xù)的細胞成像研究。

c/μM

2.4 細胞成像分析

圖5是配合物IrL1和IrL2在活細胞和固定細胞中的細胞成像圖。由圖5可知,兩種配合物只在固定的HepG2細胞的細胞質(zhì)中展現(xiàn)出明顯的熒光信號,而在HepG2活細胞的細胞質(zhì)中的熒光信號較弱。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于細胞被固定后,膜的通透性發(fā)生改變,更有利于配合物穿過細胞膜進入到細胞質(zhì)。

圖5 配合物IrL1或IrL2與HepG2活細胞和固定細胞共培養(yǎng)30 min后的共聚焦成像圖

本文以2-苯基吡啶為母體,鄰菲羅啉為輔助配體,合成了兩種銥配合物IrL1和IrL2,系統(tǒng)研究了這兩種配合物在不同極性溶劑中的光物理性質(zhì)。生物學研究結(jié)果表明:配合物IrL1和IrL2細胞毒性低,可定位于固定細胞的細胞質(zhì)中。此實驗結(jié)果為后期設計合成以2-苯基吡啶為母體的銥配合物提供了實驗依據(jù)。