伍建中，李修琴，莫雙銘，張 艷，巫秀美，劉 衡，李 玥，游海濤

(1. 岳池縣人民醫(yī)院藥劑科，四川 岳池 638300 ； 2. 大理大學(xué) 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000 ；3. 河南醫(yī)藥健康技師學(xué)院，河南 開封 475000 ； 4. 黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 興義562400 ； 5. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種炎癥性腸病，其臨床表現(xiàn)主要為腹痛、腹瀉、血便等。UC在全世界的發(fā)病率逐年攀升，相對于歐洲而言，中國的UC發(fā)病率增長更快[1]。研究顯示，UC的發(fā)生與免疫、環(huán)境和腸道菌群變化有關(guān)[2]。腸道菌群在維持腸道免疫和保護(hù)黏膜屏障方面發(fā)揮著重要的作用，同時菌群的變化也會干預(yù)UC病程發(fā)展和影響藥物療效[3]。

中藥具有多成分作用于多靶點(diǎn)的特征，在治療UC這類病因復(fù)雜的難治性疾病中有著能夠整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以蜚蠊(PeriplanetaamericanaL.)為主要原料藥的康復(fù)新液可以通過促進(jìn)腸黏膜愈合和改善腸道菌群來緩解UC[4]，但對于病因復(fù)雜的UC，單一的藥物并不能滿足臨床治療的需求。目前臨床治療UC的中藥常以復(fù)方配伍為主，如結(jié)腸寧、益氣湯和白頭翁湯等。因此，本試驗(yàn)所在研究團(tuán)隊(duì)篩選了具有抗炎作用的蒲公英提取物[5]與蜚蠊提取物(康復(fù)新液)配伍，制成復(fù)方蒲蠊提取物PL1(1∶2)和PL2(2∶1)，采用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)聯(lián)合醋酸建立UC大鼠模型，而后以雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、大腸埃希菌和硫酸鹽還原菌作為研究對象，探討復(fù)方蒲蠊提取物治療UC的可能機(jī)制，分析復(fù)方蒲蠊提取物對UC的治療作用，以期為治療UC的蒲蠊藥物研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013—0004。

1.2 主要儀器 實(shí)時熒光定量 PCR 儀(型號：StepOneplus RT-PCR)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；梯度 PCR 儀(型號：MyCycler)，美國伯樂公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(型號：InGenius)，美國Syngene公司產(chǎn)品；核酸蛋白分析儀(型號：NANODROP2000)，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑 糞便 DNA 提取試劑盒(批號：DP328)，購自北京天根生化科技有限公司；SYBR Green I 熒光定量 PCR 預(yù)混液 UNG(含 ROX)(批號：6BBC01)和DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(批號：M1061)，均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；二甲基甲酰胺(批號：3AF01)，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)(批號：P8585)，購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；冰乙酸(批號：20150604)，購自瑞金市瑞金特化學(xué)品有限公司；X-gal(批號：AC18BA0016)，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)藥物 康復(fù)新液(批號：150427)，購自四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司；復(fù)方蒲蠊提取物 PL1(批號：150305)和復(fù)方蒲蠊提取物 PL2(批號：150302)，由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院張成桂教授提供。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動物造模及分組處理 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取6只作為正常對照組，雌雄各半，剩余大鼠參照參考文獻(xiàn)[6]方法，采用DNCB聯(lián)合醋酸進(jìn)行UC造模；造模后參照參考文獻(xiàn)[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動指數(shù)(Disease activity index，DAI)評分，剔除不合格的大鼠，剩余造模成功的大鼠隨機(jī)分成8個組，每組6只，雌雄各半，分別為模型組、陽性對照組[康復(fù)新液組3 g/(kg·bw)][8]、PL1低劑量組[0.05 g/(kg·bw)]、PL1中劑量組[0.1 g/(kg·bw)]、PL1高劑量組[0.2 g/(kg·bw)]、PL2低劑量組[0.05 g/(kg·bw)]、PL2中劑量組[0.1 g/(kg·bw)]、PL2高劑量組[0.2 g/(kg·bw)]，各給藥組每日灌腸給予相應(yīng)藥物，模型組和正常對照組在相同操作下給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥14 d，1 次/d，分別于給藥后1、4、7和14 d評價DAI。

1.5.2 結(jié)腸組織檢測指標(biāo) 末次給藥后，禁食不禁水12 h，處死大鼠。將大鼠浸泡于75%乙醇5 min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，解剖，取出結(jié)腸，收集結(jié)腸糞便樣品，記錄結(jié)腸長度。沿腸系膜剖開結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈后觀察結(jié)腸組織狀態(tài)，參照Ekstr?m[9]制定的評分標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(Colon mucosa damage index，CMDI)評分。隨后用濾紙吸干結(jié)腸表面水分，稱重，計(jì)算結(jié)腸指數(shù)[結(jié)腸指數(shù)(g/kg)=結(jié)腸重量÷體重]。

表1 CMDI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.3 病理組織學(xué)評分(Histological score，HS) 將結(jié)腸組織制作病理切片，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，H.E.)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化，參照Obermeier等[10]制定的評分標(biāo)準(zhǔn)(表2)進(jìn)行HS評分。

表2 HS評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.4 實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)檢測 腸道菌群對維持腸道穩(wěn)態(tài)有著重要的作用，在UC的發(fā)病中常常伴隨著益生菌和機(jī)會致病菌的失衡，而它們的失衡又會加重UC[11]，腸道菌群的變化一定程度上反映了UC病情的進(jìn)展。因此，本試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取了UC患者中常見的益生菌和致病菌[12]進(jìn)行檢測，以分析復(fù)方蒲蠊提取物治療UC大鼠的可能機(jī)制。糞便樣品按照糞便 DNA 提取試劑盒說明書中的操作方法進(jìn)行操作，提取糞便細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)菌種特異性引物(表3)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL SYBR Mixture UNG(含 ROX)預(yù)混液、2 μL模板，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)和 0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，最后用滅菌 ddH2O補(bǔ)足，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 15 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個循環(huán)；60～95 ℃進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線分析反應(yīng)產(chǎn)物的特異性，并由 StepOne Plus PCR 儀分析結(jié)果。

表3 引物信息

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠DAI評分的影響 結(jié)果如圖1所示，試驗(yàn)期間正常對照組大鼠DAI評分基本無變化；與正常對照組相比，模型組和給藥組大鼠在給藥第1天DAI評分均極顯著升高(P<0.01)，提示造模成功；在給藥第14天，與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組DAI評分均極顯著降低(P<0.01)。

圖1 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠DAI評分的影響

2.2 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠結(jié)腸組織的影響 肉眼觀察結(jié)腸，正常對照組結(jié)腸黏膜無水腫、糜爛和潰瘍形成，模型組大鼠結(jié)腸近肛端腸壁可見明顯的充血和水腫，腸壁黏膜可見散在的潰瘍點(diǎn)和糜爛。如圖2所示，與正常對照組相比，模型組結(jié)腸長度極顯著變短(P<0.01)、CMDI和結(jié)腸指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組結(jié)腸長度明顯增加(P<0.05或P<0.01)，各給藥組CMDI有降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組結(jié)腸指數(shù)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

圖2 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠結(jié)腸組織的影響

2.3 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠結(jié)腸組織HS的影響 顯微鏡下觀察組織切片，結(jié)果如圖3所示，正常對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，可見明顯的隱窩和杯狀細(xì)胞，基本無充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤，模型組出現(xiàn)結(jié)腸上皮細(xì)胞、隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞和隱窩均出現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤也相對減少。如圖4所示，與正常對照組相比，模型組結(jié)腸上皮細(xì)胞HS評分、炎性細(xì)胞HS評分和HS總評分均極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組大鼠上皮細(xì)胞HS評分、炎性細(xì)胞HS評分均有一定程度降低，HS總評分明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

圖3 UC大鼠病理組織切片(H.E.染色，200×)

圖4 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠結(jié)腸組織HS的影響

2.4 復(fù)方蒲蠊提取物對UC大鼠腸道菌群的影響 qPCR結(jié)果如圖5所示，與正常對照組相比，其余各組腸道總菌群數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與正常對照組相比，模型組擬桿菌、大腸埃希菌、腸球菌和硫酸鹽還原菌極顯著增多(P<0.01)，雙歧桿菌和乳桿菌極顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組擬桿菌、大腸埃希菌、腸球菌和硫酸鹽還原菌顯著減少(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌和乳桿菌極顯著增多(P<0.01)。

圖5 細(xì)菌實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

3 討論

UC的發(fā)生是由多種致病因素共同作用的結(jié)果，單一的造模試劑不能完全反映UC的發(fā)病機(jī)制。研究顯示，與單一試劑誘導(dǎo)UC相比，2,4-二硝基氯苯(DNCB)聯(lián)合醋酸進(jìn)行UC造模不僅沒有DNCB造模病程短、自愈性強(qiáng)和醋酸造模不具有免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)，而且組織學(xué)改變與人類 UC 更為相似，是一種理想的UC模型[14]。因此，本試驗(yàn)通過DNCB聯(lián)合醋酸建立大鼠UC模型，研究復(fù)方蒲蠊提取物PL1、PL2對UC的療效及對腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，造模后大鼠出現(xiàn)腹瀉、血便、體重下降等癥狀，DAI評分升高，提示造模成功。經(jīng)康復(fù)新液、蒲蠊提取物PL1和PL2治療后，UC大鼠DAI、CMDI和HS評分均有不同程度的改善，提示PL1和PL2對UC有一定的緩解作用，推測PL1和PL2對UC的治療作用可能與含有保護(hù)腸道黏膜的蜚蠊[15]和抗炎效果的蒲公英[16]等有關(guān)。腸道菌群是機(jī)體腸道黏膜的重要組成部分，正常情況下可以通過參與各種生理功能來保護(hù)腸道黏膜[17]。然而當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境、飲食和用藥等因素影響時，就會引起腸道微生態(tài)失衡，繼而引發(fā)異常的免疫反應(yīng)和代謝功能[2]，造成腸道黏膜損傷。腸道菌群中有益菌和致病菌的失衡與胃腸道炎癥的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，乳桿菌和雙歧桿菌可以通過增加短鏈脂肪酸和丁酸鹽水平來抑制免疫炎癥[18]；硫酸鹽還原菌則可產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物硫化氫而導(dǎo)致腸道屏障物理性和生物性的破壞[19]；擬桿菌和大腸埃希菌與宿主的關(guān)系則更為微妙，當(dāng)宿主免疫功能正常時兩者屬于共生關(guān)系，能夠維持宿主的免疫平衡，但當(dāng)宿主免疫功能失調(diào)時兩者會促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生[20]。本試驗(yàn)實(shí)時熒光定量 PCR 結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠腸道菌群明顯失調(diào)，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量極顯著減少(P<0.01)，腸球菌、硫酸鹽還原菌、擬桿菌和大腸埃希菌數(shù)量極顯著增多(P<0.01)。本試驗(yàn)結(jié)果與現(xiàn)有研究報(bào)道的UC患者腸道菌群的變化結(jié)果[21]基本一致，這種改變可能與腸道微環(huán)境被破壞有關(guān)。

中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制炎癥反應(yīng)和保護(hù)腸道黏膜屏障的作用。研究顯示，相比于西藥，中藥治療UC能夠有效緩解 UC癥狀，促進(jìn)腸道黏膜恢復(fù)并減少復(fù)發(fā)[22]。蜚蠊具有一定的腸道菌群調(diào)節(jié)[23]和黏膜保護(hù)[24]功能，而蒲公英能夠通過作用于IL-6/STAT3來緩解腸道炎癥[25]。本試驗(yàn)通過現(xiàn)代工藝將蜚蠊和蒲公英制成PL1和PL2提取物，結(jié)果顯示，與模型組相比，PL1各劑量和PL2各劑量組致病菌和有益菌的平衡都得到了一定恢復(fù)，該腸道菌群變化結(jié)果與現(xiàn)有研究報(bào)道結(jié)果[26]相符，提示PL1和PL2對UC的治療作用可能與對腸道菌群的有益調(diào)節(jié)有關(guān)，兩者對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用相當(dāng)，且PL1和PL2高劑量組對于腸道菌群的調(diào)控作用要優(yōu)于康復(fù)新液，提示中藥復(fù)方制劑在一定程度上優(yōu)于單方制劑。

綜上所述，復(fù)方蒲蠊提取物PL1和PL2能夠改善UC大鼠的疾病活動指數(shù)，保護(hù)大腸腸道黏膜和抑制腸道炎癥，對UC大鼠具有一定的治療效果，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)UC大鼠腸道菌群組成，維持腸道菌群平衡有關(guān)。UC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一的藥物治療并不能起到良好的治療效果。中藥具有多成分多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，利用藥性特點(diǎn)制成復(fù)方制劑或許是治療UC的一種有效方法。