陳大偉，劉 敏，唐修君，陸俊賢，趙 敏，劉茵茵，馬麗娜，周 倩，王 娟，高玉時

(1. 江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125 ； 2. 江蘇威特凱鴿業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214415 ；3. 江都區(qū)武堅鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 揚州 225253)

隨著居民生活水平和消費的提高，對禽肉產(chǎn)品質量安全要求也逐漸增強。乳鴿肉質鮮美，富含的氨基酸、脂肪酸構成合理，并具有一定的藥用價值，近年來乳鴿消費群體逐年增加[1]。與其他家禽不同，乳鴿自出殼到28日齡上市，主要以種鴿分泌的鴿乳作為營養(yǎng)物質來源[2]。因此，親鴿用藥后可能傳遞到乳鴿體內造成藥物殘留。

毛滴蟲病是困擾養(yǎng)鴿業(yè)的重要寄生蟲病之一[3]，目前用于預防和治療該病的主要藥物是硝基咪唑類，如地美硝唑。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告中規(guī)定地美硝唑在飼養(yǎng)動物中可以使用，但產(chǎn)品中不得檢出[4]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第278號公告規(guī)定雞使用地美硝唑的休藥期為28 d[5]，但對鴿子使用后的休藥期暫無規(guī)定。養(yǎng)殖戶一般參照雞的休藥期進行操作，但因休藥期時間太長，與乳鴿的上市時間相同，導致藥物使用后的休藥期可操作性降低。這也是目前鴿產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物常有檢出的重要原因。因此，亟需研究地美硝唑在鴿體內的殘留代謝規(guī)律，制定相應的休藥期規(guī)則，指導生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)和地美硝唑-D3(Dimetridazole-D3，DMZ-D3)標準品，均購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；羥甲基甲硝咪唑(Hydroxy dimetridazole，HMMNI)和羥甲基甲硝咪唑-D3(Hydroxy dimetridazole-D3，HMMNI-D3)標準品，均購自加拿大TRC公司；色譜純級甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷，均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；20%地美硝唑預混劑，購自廣州白云山寶神動物保健品股份有限公司。

1.1.2 主要儀器 TSQ QUANTUM ACCESS MAX液相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品)；3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司產(chǎn)品)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司產(chǎn)品)；Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore公司產(chǎn)品)。

1.1.3 試驗動物 哺乳親鴿80對，每對親鴿哺乳2只乳鴿，由無錫威特凱鴿業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 80對親鴿隨機分為飼喂組和灌胃組，于相同時間開始哺育乳鴿(1日齡)，飼喂組進行拌料給予DMZ(2.5 g/kg)，灌胃組進行灌服給予DMZ(0.375 g/只)，連續(xù)給藥5 d。本試驗采用的試驗劑量為鴿場生產(chǎn)中實際使用的劑量，通過現(xiàn)場調查證實生產(chǎn)中使用該劑量對鴿生產(chǎn)性能和健康無明顯影響。

1.2.2 樣品采集與制備 分別在給藥后第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天隨機屠宰各組6只親鴿和6只乳鴿，采集親鴿和乳鴿肌肉、肝臟、腎臟、皮脂，以及乳鴿嗉囊內的鴿乳。胸肌、肝臟、腎臟和皮脂用絞肉機進行充分均質，1只親鴿的每種組織分別制備1個樣品。乳鴿第7天前體重較小，2只乳鴿的相同組織合并制備1個樣品，第7天及以后樣品制備方法與親鴿相同。鴿乳經(jīng)冷凍干燥后研磨成粉作為測定樣品。

1.2.3 標準曲線繪制 準確稱取DMZ、DMZ-D3、HMMNI和HMMNI-D3標準品，用乙腈溶解，配制成400 mg/L的標準儲備液。分別移取適量標準儲備液，用0.1% (體積分數(shù))甲酸水溶液稀釋，配制成100 ng/mL的混合標準中間液；最后用空白基質溶液配制成質量濃度為1、2、5、10、15、20、50和100 μg/L 的系列混合標準工作液(標液)，內標濃度為10 μg/L。

1.2.4 樣品檢測前處理 以標液濃度為橫坐標(X),外標和內標峰面積比為縱坐標(Y)繪制標準曲線。準確稱取(2.00±0.01)g樣品于50 mL離心管內，加入乙酸乙酯8.0 mL，渦旋1 min，高速振蕩提取5 min，12 000 r/min離心5 min。轉移全部上清液到15 mL離心管中，45 ℃下氮氣吹干，加入4 mL正己烷+2.0 mL 0.1%甲酸水溶液+甲醇(90+10，V+V)溶液，渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min(5 ℃)，去除正己烷層，下層置于裝有50 mg乙二胺-N-丙基硅烷(Primary secondary amine,PSA)粉末的2 mL離心管中，渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min(5 ℃)。吸取適量上清液過0.2 μm微孔濾膜后用液相色譜串聯(lián)質譜法測定樣品中DMZ和HMMNI含量。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國 Thermo 公司)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。流動相：A 為0.1% (體積分數(shù))甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～1.5 min，流動相B由5%變?yōu)?0%，流速0.3 mL/min；1.5～4.0 min，流動相B由20%變?yōu)?0%，流速0.3 mL/min；4.0～4.5 min，流動相B維持30%，流速0.3 mL/min；4.5～4.6 min，流動相B由30%變?yōu)?%，流速0.3 mL/min；4.6～6.5 min，流動相B維持5%，流速0.3 mL/min。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗結果以“平均值±標準差”方式表示。采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)制圖。

2 結果

2.1 標準曲線繪制 DMZ和HMMNI在0～100 μg/L(內標濃度為10 μg/L)濃度范圍內外標和內標的峰面積比(Y)和濃度(X)呈現(xiàn)良好的線性關系，其線性方程分別為：Y=0.034 856 2X+0.000 993 288和Y=0.024 757 7X+0.022 565 9，相關系數(shù)R2分別為0.997 8和0.999 3(圖1和圖2)。方法回收率和精密度均能滿足檢測要求(數(shù)據(jù)未列出)。

圖1 地美硝唑標準曲線

圖2 地美硝唑代謝物(羥甲基甲硝咪唑)標準曲線

2.2 飼喂方式親鴿和乳鴿藥物殘留及消除規(guī)律 飼喂方式親鴿組織中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律見圖3，親鴿飼喂DMZ后第1天肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中DMZ及其代謝物殘留量均達到峰值，肌肉中最高殘留量為200.9 μg/kg，腎臟、肝臟和皮脂最高殘留量相當，分別為902.9 μg/kg、999.3 μg/kg和961.3 μg/kg；肌肉中藥物消除曲線較為平緩，與第1天比較，第4天殘留量下降率為58.2%，第16天無殘留檢出；肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除曲線較為陡峭，與第1天比較，第4天殘留量下降率分別為66.2%、70.5%和64.4%，第19天均完全無殘留檢出。因此，飼喂方式給藥后親鴿肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除時間分別為16 d、19 d、19 d和19 d。

圖3 飼喂給藥方式親鴿組織中地美硝唑及其代謝物殘留消除規(guī)律

親鴿飼喂方式給予DMZ后，乳鴿組織中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律見圖4，乳鴿組織中DMZ及其代謝物最高殘留量與親鴿同步，均出現(xiàn)在第1天；乳鴿肌肉中最高殘留量為24.4 μg/kg，與第1天比較，第4天殘留量下降率為47.3%，第16天完全無檢出；肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除規(guī)律與親鴿類似，最高殘留量分別為150.2 μg/kg、175.4 μg/kg和59.6 μg/kg，與第1天比較，第4天殘留量下降率為52.6%、54.8%和88.9%，并分別于第16天、第16天和第13天完全無殘留檢出。因此，親鴿飼喂給予DMZ后乳鴿肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除時間分別為16 d、16 d、16 d和13 d。

圖4 飼喂給藥方式乳鴿組織中地美硝唑及其代謝物殘留消除規(guī)律

2.3 灌胃方式親鴿和乳鴿藥物殘留及消除規(guī)律 灌胃方式給藥后，親鴿組織中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律見圖5，DMZ及其代謝物殘留量在灌胃給藥后第1天即達到峰值，然后迅速下降，肌肉、肝臟、腎臟和皮脂第1天殘留量分別為329.3 μg/kg、1 337.2 μg/kg、1 104.9 μg/kg和6 591.7 μg/kg，與第1天比較，第4天各組織殘留量下降率分別為44.6%、62.7%、66.2%和98.2%，并分別于第22、22、19、19天完全無殘留檢出。因此，灌胃方式給藥后親鴿肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除時間分別為22 d、22 d、19 d和19 d。

圖5 灌胃給藥方式親鴿組織地美硝唑及其代謝物殘留消除規(guī)律

親鴿灌胃方式給予DMZ后，乳鴿組織中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律見圖6，與親鴿類似，乳鴿各組織中DMZ及其代謝物第1天殘留量最高，且殘留量最高的組織也是皮脂；肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中第1天殘留量分別為39.3 μg/kg、178.9 μg/kg、168.7 μg/kg和500.7 μg/kg，與第1天比較，第4天各組織殘留量下降率分別為59.1%、48.5%、53.7%和95.7%，并分別于第13、19、16、13天完全無殘留檢出。因此，親鴿灌胃給予DMZ后乳鴿肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中藥物消除時間分別為13 d、19 d、16 d和13 d。

圖6 灌胃給藥方式乳鴿組織地美硝唑及其代謝物殘留消除規(guī)律

2.4 鴿乳中DMZ及其代謝物殘留量 部分日齡鴿乳形態(tài)見圖7，乳鴿在0～7日齡完全靠親鴿分泌的鴿初乳維持生長，此時的鴿乳為全漿料，乳白色，有酸敗氣味，表面可見油狀物，是由親鴿嗦囊黏膜上皮細胞的脫落物和細胞碎片組成；7日齡開始，鴿乳中逐漸包含了消化不完全的飼糧顆粒；由22日齡鴿乳形態(tài)可知，乳鴿生長中后期采食的鴿乳的主要成分逐漸轉變?yōu)橛H鴿采食的飼料。2種給藥方式下鴿乳中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律見圖8，飼喂方式下鴿乳中初始藥物殘留濃度相對較高，約11 μg/kg；2種給藥方式下第10天鴿乳中均無藥物檢出。

圖7 部分日齡鴿乳形態(tài)

圖8 鴿乳中地美硝唑及其代謝物殘留消除規(guī)律

3 討論

液相色譜串聯(lián)質譜法是動物性食品中硝基咪唑類殘留檢測的主流方法[6]。本試驗采用本課題組前期建立的雞肉、雞蛋中硝基咪唑類檢測方法[7]，經(jīng)驗證后應用到鴿肌肉、肝臟、腎臟、皮脂和鴿乳中DMZ及其代謝物的檢測，回收率和精密度均能滿足要求，為下一步開展DMZ在鴿體內的殘留代謝規(guī)律研究奠定基礎。

鴿毛滴蟲病是嚴重危害肉鴿養(yǎng)殖的一種寄生蟲病，在鴿群中普遍流行[8-12]。鴿群可通過直接接觸蟲體或間接接觸被污染的飼料和水源等感染毛滴蟲[13]。國內外流行病學調查結果顯示，鴿毛滴蟲感染率在14.9%～77.8%[14-18]。研究發(fā)現(xiàn)，乳鴿感染毛滴蟲主要來自種鴿的哺乳行為[11]。因此，預防和治療鴿毛滴蟲病主要用藥對象是親鴿。現(xiàn)階段預防和治療毛滴蟲病的主要手段仍然是采用化學藥物，但化學藥物使用后的殘留問題一直是困擾養(yǎng)殖戶的技術難題。目前，對鴿毛滴蟲病防治效果較好，且臨床使用較多的藥物仍然是硝基咪唑類，主要是DMZ。DMZ為新型抗組織滴蟲藥物，具有極強的抗組織滴蟲作用。但是，如何在肉鴿養(yǎng)殖過程中合理使用DMZ并避免在產(chǎn)品中產(chǎn)生殘留是廣大養(yǎng)殖戶亟需解決的問題。

本試驗結合生產(chǎn)實際，采用飼喂和灌胃2種方式，在親鴿哺育乳鴿的起始階段給予親鴿DMZ，用藥時間均為連用5 d。由于飼料被親鴿采食后要經(jīng)過消化、吸收、分泌或與半消化飼料混合再哺育給乳鴿，所以乳鴿采食的鴿乳中的藥物含量將顯著降低。本試驗結果顯示，2種親鴿給藥方式都會引起乳鴿體內藥物殘留，但相同采樣時間乳鴿各組織中的藥物殘留水平遠低于親鴿，這主要由于乳鴿采食的鴿乳中藥物含量相對較低(最高10.96 μg/kg)。親鴿組織DMZ及其代謝物的殘留濃度和殘留時間均高于乳鴿；親鴿飼喂給藥建議休藥時間為19 d，乳鴿為16 d，親鴿灌胃給藥建議休藥時間為22 d，乳鴿為19 d。

本試驗檢測給藥后1日齡乳鴿組織中DMZ及其代謝物的殘留消除規(guī)律，其他日齡乳鴿的代謝規(guī)律是否相同仍需探討。鴿乳由親鴿嗉囊黏膜上皮細胞的脫落物和細胞碎片組成，乳鴿7日齡開始，鴿乳中逐漸包含了消化不完全的飼料顆粒，而中后期鴿乳中主要是親鴿采食的飼料[19,20]。本試驗鴿乳中DMZ及其代謝物殘留消除規(guī)律表現(xiàn)為1日齡最高，然后逐漸下降至不能檢出，這與鴿乳中親鴿嗉囊黏膜上皮細胞脫落物和細胞碎片的比例變化成正相關；7日齡后鴿乳中基本無DMZ及其代謝物檢出。因此，如果調整給藥日齡，避開0～7日齡給藥，鴿乳中DMZ及其代謝物殘留可能會顯著減少，從而進一步減少和縮短乳鴿體內的藥物殘留時間，但此推斷還需要進一步試驗驗證。