張建偉，彭 麗，張盼盼，吳寧鵬，孟 蕾，趙晨浩，吳志明，程相朝

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023 ； 2. 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008 ；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

奶作為人類優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來(lái)源，在居民膳食結(jié)構(gòu)中占有重要地位。隨著人們生活水平的提高和市場(chǎng)需求的增多，奶牛和奶羊的養(yǎng)殖規(guī)模也不斷的增加和擴(kuò)大。獸藥作為畜牧養(yǎng)殖業(yè)的重要投入品，在養(yǎng)殖過(guò)程占據(jù)重要的地位和角色。但是，濫用或不合理使用獸藥會(huì)導(dǎo)致奶中藥物殘留超標(biāo)，進(jìn)而通過(guò)食物鏈在人體富集，對(duì)人體造成毒性作用，危害人體健康[1-5]。為保障乳品安全，我國(guó)于2019年發(fā)布了《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)并規(guī)定了奶中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等獸藥的最大殘留限量[6]，為奶中獸藥殘留的監(jiān)管提供了依據(jù)。

獸藥殘留檢測(cè)是保障乳品質(zhì)量安全的重要監(jiān)管手段和措施。目前，奶中獸藥殘留常用的檢測(cè)方法有微生物法[7,8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9,10]、膠體金免疫層析法[11,12]、核酸適配體檢測(cè)法[13,14]等。以上方法準(zhǔn)確度不高、存在假陽(yáng)性，對(duì)于多藥物殘留同時(shí)檢測(cè)具有一定局限性。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)以其高靈敏度、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)被廣泛用于奶中獸藥殘留檢測(cè)[15-17]。但因獸藥種類多，不同種類獸藥之間理化性質(zhì)差異大，同時(shí)檢測(cè)多種類藥物難度大，現(xiàn)有奶中獸藥殘留檢測(cè)方法多是檢測(cè)單類藥物，難以滿足多種類藥物同時(shí)測(cè)定的需求。因此，有必要建立一種同時(shí)檢測(cè)奶中多種類獸藥殘留的方法。

本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了多種提取和凈化條件，建立了牛奶和羊奶中β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環(huán)素類、性激素類和抗蟲(chóng)類共8大類43種藥物(47種殘留標(biāo)志物)同時(shí)檢測(cè)的方法，對(duì)提升奶中獸藥殘留檢測(cè)能力，促進(jìn)乳品質(zhì)量安全建設(shè)具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、頭孢氨芐、紅霉素A、替米考星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、林可霉素、金霉素、四環(huán)素、土霉素、醋酸氟孕酮、咪多卡、氯羥吡啶、硝碘酚腈、阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、噻苯達(dá)唑(純度≥84%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；泰樂(lè)菌素A、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜(1 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)；吡利霉素、5-羥基噻苯達(dá)唑、21種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國(guó)默克股份兩合公司)；甲酸銨、氨水、二水乙二胺四乙酸二鈉、一水檸檬酸、十二水磷酸氫二鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 TSQ Quantiva液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；IKA MS3 Basic渦旋混合器(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)；TARGIN TECH VX-03型多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DC Ⅱ型氮吹儀(美國(guó)Organomation Associates公司)；LYNX4000高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；ME204T電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加適量助溶劑溶解后用甲醇溶解并定容，配制成濃度均為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液：分別移取適量同類別藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋并定容，配成濃度均為10 μg/mL的β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環(huán)素類、性激素類和抗蟲(chóng)類混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：分別稱取一水檸檬酸2.59 g，十二水磷酸氫二鈉5.52 g，二水乙二胺四乙酸二鈉7.44 g，加去離子水180 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.0 ± 0.5，用去離子水稀釋至200 mL，混勻。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為10 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離(Electrospray ionization,ESI)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring,MRM)模式。噴霧電壓：3.0 kV(ESI+)、2.5 kV(ESI-)；鞘氣：15 Arb(ESI+)、35 Arb(ESI-)；輔助氣：5 Arb；離子傳輸管溫度：320 ℃；霧化溫度：320 ℃；目標(biāo)物保留時(shí)間、母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量參考值見(jiàn)表2。硝碘酚腈掃描模式為負(fù)離子，其余藥物及殘留標(biāo)志物掃描模式均為正離子。

表2 43種藥物與其對(duì)應(yīng)殘留標(biāo)志物的質(zhì)譜條件參數(shù)

1.4.3 樣品前處理過(guò)程 提?。喝≡嚇右?奶)1 g于15 mL離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液200 μL，1%氨化乙腈1 mL，渦旋30 s，再加入1%氨化乙腈3 mL，振蕩10 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，移取上清液至另一離心管中。殘?jiān)屑尤?0%乙腈(含0.5%乙酸) 4 mL重復(fù)提取，合并上清液，作為備用液。凈化：上清液在40 ℃下氮吹至體積小于0.5 mL，加入甲醇200 μL，渦旋30 s，加水定容至1.0 mL，超聲1 min，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍1 h，于4 ℃下20 000 r/min離心20 min。上清液過(guò)微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取空白試樣液，按1.4.3中提取步驟處理得到空白基質(zhì)備用液，分別準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，加入空白基質(zhì)備用液中，按1.4.3中凈化步驟處理，配制成濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以各藥物特征離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 定性和定量分析 在同樣測(cè)試條件下，試樣液中待測(cè)物藥物峰的保留時(shí)間與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)峰的保留時(shí)間相對(duì)偏差在±2.5%以內(nèi)，且檢測(cè)到的離子的相對(duì)豐度比應(yīng)與濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度比一致，容許偏差達(dá)到歐盟2002/657/EC中的規(guī)定[18]。定量方法采用外標(biāo)法定量。

1.4.6 靈敏度測(cè)定 將適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液加入到空白試樣液中，按1.4.3步驟進(jìn)行前處理后，上機(jī)檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，依據(jù)信噪比S/N>10確定本方法在牛奶和羊奶中的定量限(Limit of quantitation,LOQ)。

1.4.7 回收率和精密度測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶、羊奶中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，制成添加濃度分別為L(zhǎng)OQ、1/2最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)、MRL、2MRL的陽(yáng)性添加樣品，各添加水平進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，求得平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)。各藥物MRL參照GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[6]。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.4.4中系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示，47種殘留標(biāo)志物在0.2～200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990。

表3 47種殘留標(biāo)志物線性范圍、定量限、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

續(xù)表

2.2 靈敏度測(cè)定 依據(jù)信噪比S/N>10，確定本方法的定量限。如表3所示，本方法在牛奶和羊奶中的定量限為0.5～5 μg/kg，具有較好的靈敏度。47種殘留標(biāo)志物總離子流色譜圖如圖1所示，47種殘留標(biāo)志物響應(yīng)強(qiáng)度高，分離度良好。

圖1 混合對(duì)照品總離子流色譜圖

2.3 回收率和精確度測(cè)定 結(jié)果如表4所示，牛奶和羊奶樣品中47種殘留標(biāo)志物在0.5～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率介于61.4%～115.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于1.2%～11.4%，表明該方法具有良好的回收率和精確度，符合多殘留分析要求。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 通過(guò)比較多藥物殘留檢測(cè)中常用的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-10 mmol/L甲酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨等流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)水相中加入0.1%甲酸能夠增強(qiáng)磺胺類、喹諾酮類等大部分藥物的離子化效率，使峰形更加對(duì)稱、尖銳，而加入甲酸銨可以顯著提高氯羥吡啶等藥物響應(yīng)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，選擇甲醇-10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，待測(cè)物出峰情況較為理想。

3.2 提取劑的優(yōu)化 奶中的蛋白質(zhì)不僅會(huì)干擾待測(cè)物的測(cè)定，還會(huì)引起儀器進(jìn)樣口堵塞等問(wèn)題，因此需將蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀[19,20]。本方法對(duì)0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈和1%氨水-乙腈3種不同的提取液進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，1%氨水-乙腈作為提取液時(shí)，47種殘留標(biāo)志物總體回收率較好。進(jìn)一步對(duì)提取液用量進(jìn)行考察，以1倍、2倍、3倍和4倍樣品體積的提取液進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，提取液和樣品比例達(dá)到4∶1時(shí)，蛋白沉淀效果最好。由于抗蟲(chóng)類藥物回收率偏低，考慮到同一種提取液難以兼顧所有種類藥物，故采用兩次提取方式以提高待測(cè)物回收率。比較了0.5%乙酸乙腈、90%乙腈、90%乙腈(含0.5%乙酸)的第2次提取效果，最終選用90%乙腈(含0.5%乙酸)作為第2次提取液效果最好。

3.3 凈化條件的優(yōu)化 牛奶和羊奶基質(zhì)復(fù)雜，除含有較多的蛋白質(zhì)外，還有磷脂等親脂性雜質(zhì)、碳水化合物和少量礦物質(zhì)等，因此必須對(duì)樣品進(jìn)行凈化以減少基質(zhì)影響[21]。常用的凈化方法有固相萃取法、正己烷除脂法和低溫冷凍法等，其中，固相萃取法考察了常用的HLB、PEP-2、X-HLB柱。經(jīng)過(guò)比較試驗(yàn)，本方法采用低溫冷凍凈化，可以有效去除奶中大部分基質(zhì)干擾，且省去了過(guò)柱等繁瑣步驟，有利于實(shí)際樣品分析檢測(cè)。

本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時(shí)測(cè)定牛奶和羊奶中β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環(huán)素類、性激素類、抗蟲(chóng)類共8大類43種藥物殘留的檢測(cè)方法。該方法對(duì)47種殘留標(biāo)志物的質(zhì)譜和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)提取和凈化條件進(jìn)行了探索，實(shí)現(xiàn)了牛奶和羊奶中47種殘留標(biāo)志物的定性和定量分析。與傳統(tǒng)獸藥殘留檢測(cè)方法相比，本方法省去了過(guò)柱等繁瑣步驟，可同時(shí)對(duì)奶中43種獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為奶中獸藥殘留監(jiān)管提供有力技術(shù)支撐。